显微注射微操作器

在许多延时或多维实验中，细胞操作是后续分析的起点。向贴壁细胞显微注射DNA、RNA 或探针，可以让您更好了解信号通路和细胞内通路。向卵母细胞或囊胚显微注射DNA、干细胞或者精子，可以此获得转基因或克隆生物，或利用辅助生殖技术 (ART) (例如，体外受精 (IVF)) ，让卵母细胞受精。另外，还可使用 CRISPR/Cas9 技术获得转基因动物。徕卡提供多种配置来满足您的不同需求和预算，确保您 找到最完美的显微操作解决方案 。完美的稳定性创建无振动结构，获得优异的光学器件，对显微注射的微小粒子进行可视化 (例如，原核) 是显微操作的主要挑战。高精度的徕卡机械操作器，是在卵母细胞、贴壁细胞和植物细胞等生物体) 上进行微创手术、生理或化学操作等生命科学应用的理想选择 。典型应用包括在贴壁细胞中进行显微注射、转基因操作和涉及干细胞的工作等。Leica DMi8 提供稳定的显微操作平台Leica DMi8 提供稳定、灵活、符合人体工学设计的显微镜平台，以及用于细胞可视化的各种反差观察方法。与自由选择的显微操作器相结合，您可创建最适合处理细胞的完美系统。出色的图像质量以最高的分辨率和对比度来可视化精子头部等微小结构。出色的反差观察方法 (例如，IMC整合调制相差和 DIC微分干涉相差) 以及各种高质量物镜，让微小结构纤毫毕现。样品不离视线无需切换物镜即可放大和缩小，不会失去移动样本的踪迹。使用徕卡 variozoom 相机 C 接口，只需转一圈适配器，就能增大和减小放大倍率 -在更改放大倍率时，快速移动的样本 (如精母细胞) 始终在您的视线之下，以便检查形态学或抓取注射的精子。全神贯注于您的工作只需按下触摸屏或显微镜上的按钮就能更改反差观察方法或放大倍率。Leica DMi8 中的智能自动化功能可自动选择正确的光学元件，实现最佳的样本可视化结果。符合人体工学设计的易用遥控器通过显微镜旁边的 Leica Smart Move 轻松控制对焦和载物台移动。Leica MATSMATS = 显微镜载物台自动热控制系统维持正确温度Leica MATS 配合最高 100x 的干式和油浸物镜加热载物台样本夹。通过精确、稳定的温度控制，可确保敏感的样本维持在正确的温度。经典显微操作配置用于 ICSI 的配置实例徕卡公司和 Narishige：世界各地广泛使用的组合。通过 Narishige 手动和电动油压显微操作器，找到最适合您的选择。带手动对焦和手动物镜转换器的 DMi810x、20x、40x 物镜IMC整合调制相差手动三板载物台Leica MATS 37°C 样本夹加热插件DFC290 HD 高清相机用于原核注射的配置实例配备徕卡机械显微操作器的DMi8，具有高精确度和高稳定性的特点。操纵杆的移动被精准地直接传送到毛细管尖端。带电动对焦和电动物镜转换器的 DMi8触摸屏10x、20x、40x 物镜微分干涉相差 (DIC)手动或电动三板载物台DFC290 HD 高清相机用于胚胎干细胞转移的配置实例全电动显微操作：使用全电动 Leica DMi8 和 Eppendorf 显微操作器，可存储和调用重要的功能，从而加快速度，增大精确度。还可添加触摸屏，轻松、直观的控制所有显微镜功能。带电动对焦和电动物镜转换器的 DMi8触摸屏10x、20x、40x 物镜IMC整合调制相差和相差观察法手动或电动 三板载物台DFC290 HD 高清相机关于徕卡显微系统Leica Microsystems 徕卡显微系统是全球显微科技与分析科学仪器之领导厂商，总部位于德国维兹拉(Wetzlar, Germany)。主要提供显微结构与纳米结构分析领域的研究级显微镜等专业科学仪器。自公司十九世纪成立以来，徕卡以其对光学成像的极致追求和不断进取的创新精神始终得到业界广泛认可。徕卡在复合显微镜、体视显微镜、数码显微系统、激光共聚焦扫描显微系统、电子显微镜样品制备和医疗手术显微技术等多个显微光学领域处于全球领先地位。 徕卡显微系统在全球有七大产品研发与生产基地，在二十多个国家拥有服务支持中心。徕卡在全球一百多个国家设有区域分公司或销售分支机构，并建有遍及全球的完善经销商服务网络体系。

瑞士Cytosurge AG公司的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统合为一体的单细胞操作系统，采用不同孔径的微型纳米注射器，可实现单细胞注射（Injection）、活细胞内物质提取（Extraction）、单细胞分离（Isolation）、粘附力测定（Adhesion）、纳米打印(Nano-printing)等多种功能，全程机械臂操纵，将污染风险和人为误差降到低，提高工作效率与实验可重复性，具有高度自动化、操作速度快与操作度高等特点，能够在单细胞水平上为研究者提供大的便利，可应用于单细胞质谱、单细胞力谱、单细胞基因编辑、细胞系构建、药物研发、医疗等领域。北京大学生命科学学院公共仪器中心的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是国内套多功能单细胞显微操作系统，于2020年9月顺利安装于金光楼126室并开始试运行，由公共仪器中心覃思颖老师负责接样测试与维护管理。目前本中心的FluidFM BOT系统已成功应用于单细胞注射与物质提取（小鼠体外培养原代海马神经元、昆虫叶蝉细胞、MDA-MB-231细胞等）、单细胞分离（植物细胞原生质体、U2OS细胞等）与粘附力测定（细菌侵染细胞时细菌的粘附力、血管内皮细胞对不同基底的粘附力等）等多方面科研需求。以下是多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT的多个功能应用与实例介绍。FluidFM BOT结合原子力系统、微流控系统于一体（https://doi.org/10.1021/nl901384x）FluidFM BOT功能应用单细胞注射实例FluidFM BOT可以将多种不同类型的可溶性物质注入细胞核或细胞质中，可量化注射体积（fL别），可实现批量注射（每小时注射超过100个细胞），尤其适用于使用传统方法难转染的细胞，且对细胞几乎没有损伤。CHO细胞的Lucifier Yellow染料注射C57小鼠体外培养原代海马神经元DIV7的Dextran染料注射（北大生科院数据）活细胞内物质提取实例FluidFM BOT系统的活细胞内物质提取功能十分温和，可直接用微型纳米注射器吸取活细胞的细胞质或细胞核中的物质，无需经过化学或生物学手段进行破膜处理，不会产生裂解的细胞碎片，不会对内部细胞器造成任何破坏，可用于电镜成像、酶活检测、核酸表达检测、代谢组学、基因测序等多方面研究。活细胞提取物可结合电镜观察、酶活测定、转录检测等分析手段（http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.06.025）HeLa细胞的细胞质物质提取单细胞分离实例FluidFM BOT可进行无损细胞分离，对于悬浮细胞，可将细胞吸取并转移释放即可。对于贴壁细胞，可在探针的样品池中加入消化液如胰酶，对指定位置的细胞进行消化，然后再进行吸取与转移释放。FluidFM BOT实现的单细胞分离存活率很高，结合单细胞注射可实现快速转染细胞并建立单克隆细胞群，对于工程细胞株的建立十分有效。植物原生质体的单细胞分离（北大生科院数据）贴壁细胞CHO的单细胞分离粘附力测定实例FluidFM BOT系统通过负压将细胞吸附在探针针孔处，对细胞的吸附力比蛋白结合更加牢固，能够直接将细胞从基底上分离。这种方法不需要激活细胞的任何信号通路，可以得到接近细胞原生的数据。不同的探针针孔直径（2、4、8um）可适用于不同大小的细胞粘附力测定，我们甚至可使用孔径为300nm的探针进行更小个体的吸附与粘附力测定，目前在本中心的FluidFM BOT系统已成功应用于金黄色葡萄球菌侵染大鼠肠上皮细胞时的细菌粘附力测定（nN别）。不同大小的单细胞粘附力测定（https://doi.org/10.1038/s41598-019-56898-7）纳米打印实例FluidFM BOT系统还是一台纳米打印设备，可以在实验器材上铺设特定的基底膜，如打印亲水或亲脂性物质，从而实现对细胞贴壁的操纵，构建不同的细胞模式，实现对细胞信号转导机制、肿瘤细胞群落迁徙、神经细胞树突或轴突形成的研究。CMD基底打印cRGDfK的细胞贴壁生长Pattern研究（DOI: 10.1021/acs.langmuir.8b03249）多功能单细胞显微操作系统在高性能单元的监控下，通过全自动的工作站实施操作，可确保实验的平稳、顺利的进行。探针有多种孔径规格可选，也可结合FIB技术进行探针定制，结合不同的探针可实现各式各样的应用，以上仅展现部分应用，更多的新功能有待各位老师与同学结合自己的课题需求进行探索与发掘，欢迎大家联系前来测试样品！

[报告简介] 单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。 线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征，是细胞中能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵十分困难，将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。 本报告分为两部分：1. 来自ETH的Dr. Christoph G. Gäbelein使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪发现被移植线粒体与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。本次报告Dr. Christoph G. Gäbelein将对上述文章和数据进行详细分享。2. 2020年9月，国内套FluidFM多功能单细胞显微操作系统在北京大学生命科学学院顺利安装并交付使用。期间，在北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台覃思颖老师和Quantum Design中国工程师胡西博士的帮助下，成功举办多场workshop，FluidFM多功能单细胞显微操作系统助力北大发表多篇paper。本次报告中，覃思颖老师将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[直播入口]请扫描下方二维码进入FluidFM单细胞显微操作技术群，届时会在微信群中实时更新直播入口，无需注册！扫码进群，即刻获取直播链接，无需注册！[报告时间]06月08日 下午15:00-16:00 [主讲人介绍]Christoph G. Gäbelein，ETHChristoph是一名来自ETH的青年科学家，科研中他一直致力于将FluidFM单细胞显微操作技术应用于更多的生命科学场景中。在过去两年间，他以一作或参与者的身份发表了FluidFM多篇文章：2022 Mitochondria transplantation between living cells2022 Injection into and extraction from single fungal cells.2021 Single cell engineering using fluidic force microscopy.2021 Genome-wide molecular recording using Live-seq.Christoph对于FluidFM技术的应用具备丰富而完善的经验，文章也是高产的，目前Christoph已经成为了FluidFM技术领域的专家。本次Webinar，Christoph将介绍他应用技术的新成果，并详细阐述从活细胞中提取、注射线粒体，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力的技术细节。Christoph的座右铭是：Curiosity-driven young scientist interested in fundamental cell biology 覃思颖，北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台工程师。2016年于北京大学获得生物物理学博士学位，博士期间以作者在Nature Materials发表论文，博士后期间入选届北京大学博雅博士后项目。2019年加入北京大学生科院公共仪器中心，负责原子力显微镜、多功能单细胞显微操作系统、共聚焦显微镜等大型仪器的技术支持与运行管理，在多尺度生物样品的原子力制样与成像力学检测、单细胞注射与分离等显微操作、生物荧光成像与图像处理分析等方面有着丰富的经验，为校内外100余课题组提供技术服务，辅助课题组在Nature、Cell、Nature Cell Biology等国际期刊发表论文30余篇。本次报告将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[应用简介]1. 从活细胞中提取线粒体 为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 μm2)和圆柱型探针(A=1.6 μm2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对单个线粒体及多个线粒体进行提取或大量抽提。图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 对线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。 本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。图2(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5 µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 将线粒体移植至新细胞 研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。 虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。在提取和移植之前，作者通过在探针中填充不混溶的C8F18来确保提取液在提取过程中保持在孔径附近。因此，只有很小的体积(0.5 - 2pL)被注入到宿主细胞中(图3B)。 除了标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)外，还标记了受体细胞的线粒体(su9- BFP)，这样就能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态。在上述两种移植方案(移植和纯化后注射)中，宿主-线粒体网络的管状状态不会因注射过程而产生影响。此外，标记可以让作者可视化地监测线粒体地移植，观察线粒体地融合。 无论移植方法是细胞到细胞(图3I)，还是注射纯化线粒体(图3J)，都可以观察到这些过程。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内次观察到融合事件。 如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。 综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论 FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。 该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。