紫外二阶导数法

[size=4]三聚氰胺具有紫外吸收，这也是目前广泛采用的液相色谱-紫外检测器测定三聚氰胺的方法。但由于其仪器价格昂贵，再加上固相萃取前处理比较繁琐，在一定程度上限制其应用。 正因为由紫外吸收，所以利用紫外分光光度法测定成为可能。下图分别为三聚氰胺的紫外光谱图和一阶和二阶导数光谱图。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811290715_120915_1644065_3.jpg[/img]图一三聚氰胺的紫外光谱图[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811290715_120916_1644065_3.jpg[/img]图2 三聚氰胺一阶导数光谱图[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811290716_120917_1644065_3.jpg[/img]图3三聚氰胺二阶导数光谱图由于液相色谱的分离效果好，使检测干扰小。当采用紫外分光光度法测定时，因为很多物质在紫外区都有吸收，所以干扰较大。如何进行前处理就能为目前面临的最大的课题。导数光谱法具有将隐藏在大吸收峰里的小峰分离出来的作用，所以采用导数光谱法，在一定程度上可以消除部分干扰。[/size]

曾记得，九点虎版主在2009年10月写过一篇叫做【对分光光度计的理解请别停留在测试溶液的吸光值上】的文章。的确，目前大多数仪器的使用者均将分光光度计应用在测试液体样品上，当然分析固体样品的用户也不在少数，但是即使分析的样品是固体，也不过是些薄膜、粉末、透镜、滤光片等小型样品；至于那种可以将整个照相机变焦镜头或光学镜头等即大型又不可分离的样品放在样品室内直接测量的所谓大样品仓的紫外可见分光光度计，我想许多人不一定见过，为此，今将一款这种大样品仓的紫外可见分光光度计介绍给大家，权作第二届原创大赛的收官之作吧！（备注：为了避免有“仪托”之嫌，故将文中的仪器的型号和厂家隐去，请版友见谅！）这种仪器的外观见图－1所示：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301353_199717_1602290_3.jpg[/img] [b]图－1 外 观[/b]这种大紫外的最大特点是：样品室很大，可以直接将不易分离的样品（例如照相机镜头）放置在里面直接测定，所以将这种大样品室称为样品仓，而将这种样品仓的紫外俗称“大紫外”。需要说明的是：这种紫外也可以测液体样品，尤其是浑浊样品；同时这种仪器附带有多种测量附件，如偏振、固定反射角等，可以做多种光学方面的研究和开发。见图－2所示：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301353_199718_1602290_3.jpg[/img] [b]图－2 大样品仓[/b]这种仪器的测量波长范围很宽，如测固体样品检测波长范围在220～2600nm间；如测液体样品检测波长范围在187～3300nm间；为此，该仪器的分光系统很复杂和庞大；它的光学系统很有特色，需要详细介绍；图－3是它的光学结构系统示意图：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301353_199719_1602290_3.jpg[/img] [b]图－3 光学系统示意图[/b]由于样品仓所占用的水平面积过大，为了减少仪器的水平体积，故将光学系统（主要是单色器）安装在仪器的左侧，使单色器由传统的水平设置改为垂直设置，这是该仪器的一个独特的设计；具体外观见图－4所示：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301354_199720_1602290_3.jpg[/img][b]图－4 光路系统[/b]（1）灯 室：紫外区光源采用氘灯，可见区和红外区光源采用钨灯；灯室的结构见图－5所示：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301354_199721_1602290_3.jpg[/img] [b]图－5 灯 室[/b]（2）第一单色器：由于该仪器可以胜任测量光学器件，故对仪器的分辨率和色散率要求较高，为此该仪器设置了两个串联的单色器。第一单色器起到对预测波长的粗选作用，它实际上是取代了传统的滤光器部件，但又比滤光片的选择性好所以分光元件没有采用传统的光栅而采用了三棱镜，即图中的P元件，同时波长调整器选择了凸轮式的正弦机构，见图－6：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301354_199722_1602290_3.jpg[/img] [b]图－6 第一单色器[/b]（3）第二单色器：该单色器应该称之为主单色器，大的分辨率和色散率远远高于第一单色器，为此第二单色器的分光元件采用了传统的光栅，并且为了适应紫外、可见和红外的需要，该单色器设计了两块背靠背的光栅；光栅G1用于紫外区和可见区的分析需要；光栅G2满足红外分析的需要。同时为了保证波长的准确度，波长调整器采用了传统的线性正弦机构，即用丝杠的转动带动正弦臂杆的移动方式，这种调整机构的精度优于凸轮式的。具体配置见图－7：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301355_199723_1602290_3.jpg[/img][b]图－7 第二单色器[/b]（4）狭缝：众所周知，分光光度计的红外区的信号的稳定度与光通量的强弱有着很大的关系，并且在保障分辨率的前提下，波长的变化与最适光通量强弱的变化成正比。因此一般的专用的红外光谱仪的狭缝均设计为“饲服”类型的，也就是说，狭缝的宽窄变化与波长的变化成正比。为此，该型仪器的3个狭缝一改以往由传统的不同档位宽度的固定狭缝的结构，而采用同时由一只饲服电机带动的任意设置变化的狭缝宽度的结构。为了确保狭缝重复精度，这无疑对饲服电机以及狭缝机械加工精度带来了很大的挑战，图－8所示的就是这种三位一体的狭缝调整结构：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301355_199724_1602290_3.jpg[/img] [b]图－8 狭缝结构[/b]（5）分束器：从单色器M8射出的光已经是预选出的单色光了，但是为了满足双光束的需要，即一条光束作为参比光束，而另一条光束作为样品光束；此时该分束器已经变为水平放置了，它在大样品仓的左侧，其的结构见图－9所示，工作过程：由单色器输出的单色光从分束器底部射出到M9上，然后经过M10和M11的反射到达扇型镜即M12；通过扇形镜的作用，这条预选出波长的单色光此时已经变为两条光束了，完成了由单光束转变为双光束的过程。值得一提的是，这种分束形式目前已被普遍应用到各种光度计上。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301355_199725_1602290_3.jpg[/img] [b]图－9 分束器[/b]（6）扇形镜与切光马达：分束器的原理上面已经做了介绍，但是分束器中关键的部件是由切光马达带动的一只扇形镜。该镜子被分成四个扇区，两个反射区两个透射区；两个透射区出射的光束作为样品测量用；两个反射区一个装有反光镜，所折射的光束作为参比测量用；而另一个反射区上安装的是一片黑板，作为仪器时时暗电流的调零之用。因此每当扇形镜运转一个周期，所得到的信号顺序为：调零→样品→参比→样品。并按照如此顺序做周而复始的工作，以得到连续的检测信号。这种扇形镜和切光马达的外形图见图－10所示：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301355_199726_1602290_3.jpg[/img][b]图－10 扇形镜[/b]（7）检测器：由于测量的样品多为光学部件，所以从样品射出的光往往形成散射光；如果这样的散焦光束照射到光电倍增管上只能产生噪声很大的信号；为此，通常的直接使用光电倍增管作为检测器元件的设计已经不能满足测试需要了。所以要使用专用的积分球检测器，而积分球检测器又包括红外检测器，也称为硫化铅检测器（在积分球上方，）和紫外可见检测器即光电倍增管检测器（在积分球下方）两种；类似这种直接使用积分球作为检测器的分光光度计，我主观猜想可能还是不多见的。图－11就是这种检测器的实际照片：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/01/201001301355_199727_1602290_3.jpg[/img][b]图－11 检测器[color=#dc143c]后记：第二届网络原创大赛明天就要结束了，为了感谢论坛里各位版主、专家们长期以来不懈的无私的奉献；为了广大版友的支持和需要，我还是在这最后的收官之际利用今天休息日写下了这篇稿件。也许它没有什么务实价值，如是，那就权且算作我对论坛的一点小小的敬意吧。[/color][/b]

在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号；如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数光谱法有可能克服这些困难。近几年分光光度计的发展,使很多仪器具有全波长扫描和导数光谱处理功能,使导数光谱有了更快更好的发展。导数分光光度法对吸收强度随波长的变化非常敏感,灵敏度高.对重叠谱带及平坦谱带的分辩率高,噪声低.导数分光光度法对痕量分析,稀土元素,药物,氨基酸,蛋白质的测定,以及废气或空气中污染气体的测定非常有用。但此法的关键是如何采集光谱图和进行导数处理问题,本文就导数光谱采集问题中的影响因素进行深入的分析和探讨,并对导数处理过程中的波长差和标尺因子进行研究,得出了采集导数光谱的最佳条件。1 综述数据集的导数处理需要三个参数：阶数、波长差和标尺因子。导数处理后的数据集显示在一定范围内数据的变化率，通过处理可能发现隐藏的峰。选择操作 处理 转换 导数，然后在方法面板中给出导数的阶数、X 值的大小 ( 波长差)和标尺因子即可。( 为了显示所有的选项也许需要放大方法面板。)阶数：选择平滑、1st、2nd、3rd 和 4th 阶。波长差：给出进行平滑或导数计算时使用波长组合的点数。点数越大将越平滑。标尺因子：输入一个乘积因子，便于观察导数数据。平滑和导数计算使用 17 个数据点的卷积函数。导数计算的波长和时间差值四段可选，取决于平滑的间隔。间隔的 X 差越大，噪声越小，但是得到谱图的分辨率也随之减小；因此，选择的波长差要权衡折衷考虑噪声和分辨率。导数值的计算需要使用中心点前后两端的数据点，这意味着导数或平滑图谱不能得到图谱范围两端的数据，各端要损失一部分。尽管图谱的初始单位是吸收值和透射率。导数的单位则导数光谱时间扫描1stAbs/nm或T%/nmAbs/time或T%/time2ndAbs/nm2或T%/nm2Abs/time2或T%/time23rdAbs/nm3或T%/nm3Abs/time3或T%/time32仪器与试剂2.1仪器UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）3试验方法 以2μg• mL-1纳他霉素溶液测定样品溶液,分别对扫描速度和采样间隔分别进行试验,得出最佳采集条件。3.1扫描速度UVPROBE软件提供了四种扫描速度，分别是低速(very slow)、慢速(slow)、中速(medium)、高速(fast)。本试验采用了上述四种速度进行扫描。仪器条件为：采样间隔0.5,光谱带宽2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动。测定结果见表1:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812081815_122820_1644065_3.jpg[/img]从中间截取一段图,比较结果见图1:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812081815_122821_1644065_3.jpg[/img] 以上数据表明:在没有特别精确要求下,中速、慢速、低速扫描基本没有区别,但和快速扫描的区别比较大。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用中速扫描。3.2采样间隔采用0.05为采样间隔时，仪器以0.05nm为单位进行扫描，即自动在1nm范围内插入1/0.05=20个点。其它条件不变。仪器条件为：扫描速度为低速，光谱带宽2.0nm,氘灯转换波长360nm,扫描方式为自动,结果见表2:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812081838_122826_1644065_3.jpg[/img]从上表可以看出 , 0.05~0.5的采样间隔对最大吸收波长基本没有影响，但1.0和2.0的采样间隔则影响比较大。从图上可以看出,采用0.05、0.1、0.2、的采样间隔,其谱图平划,而0.5、1.0、2.0的采样间隔,其谱图都不是非常平滑。所以，在没有特别精确要求下, 采用0.05~0.2的采样间隔均可，但0.5、1.0、2.0的采样间隔则对测定结果有一定影响。从扫描时间和氘灯使用寿命等因素考虑，建议采用0.2的采样间隔。3.3光谱带宽 从理论上讲，光谱带宽越小，波长越接近单色光，但带宽太小，将使单色光的强度减小，使光电流信号减弱，降低信噪比。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812081838_122827_1644065_3.jpg[/img] 4 导数光谱的处理4.1阶数的选取有文献指出,n阶（n＝0～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。分辨率得到了很大的提高,且用微分求导,能显示出吸收峰微小的变化,其谱图如图4~7所示:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812081839_122828_1644065_3.jpg[/img]随着导数阶数的增加,谱带变的尖锐,分辨率提高,但[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原吸[/color][/url]收光谱的基本特点逐渐消失。在同一波长处有两个物质同时有吸收的情况下,此时的谱图为两物质叠加在一起的吸收峰。所以,在阶数的选择上,要选择能分辨两个或两个以上完全重叠或以很少波长差相重叠的吸收峰的导数光谱图。还要能够分辨吸光度随波长急剧上升处所掩盖的弱吸收峰或能确认宽阔吸收带的最大吸收波长。基于以上三个因素,综合考虑选择导数的阶数。4.2波长差波长差给出了进行平滑或导数计算时使用波长组合的点数,点数越多越平滑。 导数计算的波长和时间差值四段可选，取决于平滑的间隔。波长差有10.000,20.000,40.000,80.000可供选择,随着波长差的增大, 噪声越小,导数光谱图也越来越平滑,，但是得到谱图的分辨率也随之减小,光谱图上的特征吸收峰也随之而减少。因此，选择的波长差要权衡折衷考虑噪声和分辨率。所以,在一个导数光谱图吸收峰小于10个的情况下,建议使用的波长差为10.000 若吸收峰很多,尤其是小峰包很对的情况下,可以适当的调整波长差。4.3标尺因子 输入一个乘积因子，便于观察导数数据。所以,标尺因子对导数光谱图的分辨率和噪声没有影响,但使导数值成标尺因子倍数增加。当某物质4阶以上的导数光谱纵坐标很小的时候,可以相应的输入一个标尺因子,扩大导数光谱图的可视性。5结论 通过对以上条件的优化,确定了采集导数光谱的方法,对导数光谱在测定组分具有指导意义。

多年前，我到清华大学做访问学者，参加了纳米晶胶原基骨材料课题组的研究工作。当时，该课题组已经完成了材料的合成，动物试验，并申请了多项国内外专利，但合成人工骨的生物矿化机制的研究一直没有进展。我进课题组后，与一位博士生合作开始做生物矿化机制的研究。我们查阅了一个德国学者用紫外光谱动力学方法研究生物矿化过程的文献，该实验是将生物矿化的反应液（胶原溶液＋氯化钙＋pH7.2磷酸盐缓冲溶液＋pH7.2Tris缓冲溶液）混合后立即置于紫外光度计中，按5分钟测一次的频率自动测量反应体系的浊度，得到了一条平滑的阶梯形曲线（与碱滴定酸的滴定曲线相似），对生物矿化过程进行了讨论。我们很受启示，设计了一个获取不同反应状态的材料，用电镜研究反应进程中材料结构变化的方案：即同时平行做4－7个样，反应开始后，一份用紫外光度计来监视过程中的浊度变化（从显示器上观察曲线变化），在阶梯形的下平台、突跃中部、上平台等若干个反应状态（时刻）下，及时地依次将一份份平行的反应液投入到现场的液氮中，它们立即被冷冻固化，从而保持了各自反应状态时的固体微观形貌，测定完毕后，将被冻结固化的几个试样置于冷冻干燥机中升华去水，得到保持了原貌的各状态样品。再做扫描电镜，分析其形貌变化规律。　　　然而，实验时我们却发现了一个异常的现象：紫外光谱动力学曲线虽然也呈阶梯形，但在阶梯突跃的一瞬间（约1min完成突跃），陡峭的曲线上突然出现一个向下的小负峰（见附图1），我们又重复做了多次，改变各种条件再试验，这个现象均出现。我们既惊讶又兴奋，因为规律性的异常并不是坏事，说明我们发现了一个值得研究的“新大陆”，我们再考查文献的曲线和实验条件，我们发现，德国学者实验时的数据采样的时间间隔较大，而我们则是1min读一次数，而阶梯形曲线的阶梯突跃时间就只有1min，这个阶梯上的负峰的出现只有几十秒，因而德国学者未捕捉到这一特异的现象。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/08/200908142028_165721_1644756_3.jpg[/img] 　　生物矿化中的负峰现象，引导我们去提出各种设想，设计更多实验来验证设想，拓展了生物矿化机制研究的思路。后来，我们用定时的全波长扫描来进行紫外光度的动力学研究，得到了更丰富的光谱信息（见附图2），又改用圆二色光谱进行生物矿化动力学研究（见附图3），发现了游离钙离子及羟基磷灰石（HPA）的生成过程对胶原蛋白的二级结构变化的影响（按相反规律变化），并采用激光散射仪研究了生物矿化的动力学曲线。最后，我们提出了胶原生物矿化过程中发生了胶原的凝胶化和相分离过程，通过载钙胶原（络合作用结合）的板框式组装，羟基磷灰石矿化形成了有序的胶原－HAP复合材料（与天然骨相似）。并根据红外光谱数据，提出了矿化时第二类成核位点的理论观点，这些设想得到了红外光谱、过程样品电镜图及圆二色光谱和激光散射光谱数据的支持。发表了几篇质量较高的论文（均被SCI收录）。　　　这次科研经历，我体会颇深：传统的仪器分析如果不局限于成分的测定与鉴定，操作人员不局限于“来料加工”，而是结合课题研究来设计测定的方法和项目，是能够做出一些创新性的成果的（含新的分析方法研究）。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/08/200908142029_165722_1644756_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/08/200908142030_165723_1644756_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/08/200908142031_165724_1644756_3.jpg[/img]