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液相色谱反向柱

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液相色谱反向柱相关的论坛

  • 关于极性改性反相液相色谱柱那些事

    关于极性改性反相液相色谱柱那些事

    常规C18 色谱柱在高水相条件下长时间操作,经常会出现“柱塌陷” 现象,造成分析物的保留时间和分离度骤降。极性改性反相色谱柱由于采用独特的极性改性技术,通过引入极性基团使其表面更容易被水润湿,从而有效地避免了该现象的发生。此外,极性改性反相液相色谱柱在高有机相下表现同样出色,能在LC-MS 测试中加快去溶剂化的过程,从而有效提高LC-MS 的检测灵敏度。极性改性反相液相色谱柱的流动相适用范围可以从100% 水相到100% 有机相,使方法开发更加简单易行。极性改性反相色谱柱是以高纯硅胶为基质,采用独特的极性改性技术生产的色谱柱。这个系列的色谱柱不但保留了传统硅胶基质反相色谱柱的性能,而且又增加了一些新的特性:• 填料表面具有极性基团,适合于高水相条件下的分离• 增强了对亲水性、极性化合物的保留能力• 独特的选择性和优异的分离度• 降低了碱性化合物与残余硅羟基的相互作用,提高了色谱峰的对称性• pH 范围更宽,适合于分析酸、碱化合物迪马科技极性改性反相液相色谱柱有两个系列:一个是Spursil(思博尔)系列,包括Spursil C18 和Spursil C18-EP,二者的结构差异如下http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/06/201506021619_548446_1610895_3.jpg一个是Diamonsil Plus 系列,包括Diamonsil Plus C18-A 及 Diamonsil Plus C18-B,Diamonsil Plus C18-B的极性略大约Diamonsil Plus C18-Ahttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/06/201506021624_548450_1610895_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/06/201506021624_548451_1610895_3.jpg

  • 【原创】反相高效液相色谱柱的清洗和再生(一)

    原文来自:JANUARY 2003 LC[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url] NORTH AMERICA VOLUME 21 NUMBER 1 19,20,22,24,26http://www.chromatographyonline.com/反相高效液相色谱柱的清洗和再生(二)http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045750/反相高效液相色谱柱的清洗和再生(三)http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045752/[size=4]本文原是2年前让我的研究生左莹暑假特意翻译的,只是后来忘了。一个月前,在整理电脑资料中发现了这篇文献翻译,我重新校对,修整了一些错误,但仍可能会有些翻译不对的地方,或者语句不畅,请大家指正。[/size][color=#00008B]][color=#00FFFF][size=4]反相高效液相色谱柱的清洗和再生[/size][/color][/color] 这个月的“关注色谱柱”着眼于将一根污染的柱子回到或接近初始状态的实用方法。Ron Majors 会讨论硅胶基质或其它类型的反相柱子的清洗步骤。 反相液相色谱是迄今为止高效液相色谱法(HPLC)中使用最广泛的技术[1]。它的广泛使用是因为它能应用于大部分的非极性化合物、许多可电离的及离子化合物的分析。大部分用于反相色谱的固定相是亲水性的,因此分析物是通过其与固定相之间的亲水作用的程度来进行分离的,含有亲水组成的基团也有相似的保留行为。 表一列举了最常见的键合硅胶的固定相(1)。一些比较次等的固定相比如说一些混合固定相(例如:苯基-乙基),末端封尾和不封尾类型的,一些极性固定相同样属于硅胶键合。其它一些各种各样的填料同样也被用于反相液相色谱,包括聚合物,涂布有硅和铝的聚合物,涂有氧化锆的无机-有机杂化物和石墨化的碳。各种不同的固定相都有其自身的优点和缺点。表1 HPLC固定相中的使用比例*固定相 使用比例C1839C826CN**14.5苯基12C43.7亲水作用1.8C21.2C10.8其它0.8聚合物0.5* 来源于文献1** 包括正相色谱,因为正相与反相使用无法确定比例。 反相色谱柱由于可使用多种流动相和添加剂而得到了广泛的使用。其中使用添加剂的一些技术可改变或修饰填料表面。有时,这些添加试剂本身就会污染填料表面或键合相。 由于使用了亲水性的键合固定相,硅胶表层有了其他的化学特征。残余的硅羟基存在于所有的硅胶键合相的表层。图一描述了可能存在的不同类型的硅羟基(2)。由于是弱酸的特性,这些硅羟基会同某些分析物和基体化合物相互作用,尤其是同一些碱性化合物。因为硅羟基的Pka值大约是在4.5左右。电离可能发生在中间的pH值,因此存在其同阳离子产生静电作用的可能性。比较老的A型硅胶可能含有高浓度的金属离子(通常为100ppm,或更高),这些金属离子会在硅胶表面提供更强的酸性,同样还会和金属螯合化合物(3)相互作用。残留的硅羟基会在末端不封尾的键合硅胶和短链键合的固定相上(例如C2和C4固定相)造成较多的麻烦。 色谱柱的使用者必须清楚色谱柱固定相的表面特征和可能存在的分析物—固定相表面的相互作用,所以在使用和发展反相色谱方法时必须考虑可能存在的基体相互作用。比如一些非常疏水的材料如玉米油、特别芳香类材料和蜡可以附着在反相填料表层并改变填料层的特征。含有蛋白质的生物液体会吸附在填料表层,尽管分析者尽了最大的努力来保护高效液相色谱柱以防止外来物质对其的伤害,最终是,某些分析物-基体化合物还是会对固定相产生不利的影响。 当一根色谱柱被污染之后,它的色谱性征可能已经不同于未被污染的色谱柱了。被污染的色谱柱可能会表现出反压力的问题。对于一根被污染的色谱柱则必须通过清洗和再生将它恢复到原来的操作条件。“关注色谱柱”这部分将会讨论一些实用的方法来将色谱柱恢复或接近到初始状态。由于键合的硅胶柱是最常用的,所以我要着重讨论他们。在最后,我将会论述一些其他类型的反相色谱柱的清洗程序。 反相色谱柱中污染物是怎样的形成? 通常,样品基体里总是含有一些对分析者来说不感兴趣的化合物。盐类、脂质、含脂肪的化合物、腐殖酸、疏水性的蛋白质和其他的一些生物化合物就是在使用中能够接触到高效液相色谱柱的可能物质。这些物质可能会比所需分析的物质更强或更弱的保留能力。那些保留能力比较弱的化合物如盐类,将以死体积被洗脱出来。这些不希望发生的干扰可以通过检测器观察到,它表现为一些色谱峰、斑点、基线干扰,甚至是一些倒峰。如果样品基体组成在色谱柱中有强的保留性,且流动相组成本身就不强到足以使其洗脱出来,这些被吸附的、或是被吸收的化合物将会累积,通常是在经过多次进样之后堵塞在色谱柱的柱头。这种特征是在等度条件下观察得到的。中等保留能力的样品混合物可以被缓慢的洗脱出来,其表现为宽峰、基线干扰或基线漂移。 有时,这些吸附的样品组成达到了比较高的浓度,它们便表现为一种新的固定相。被分析物可与这些杂质作用并表现为新的分离机理。它可能会引起保留时间的变化和峰的拖尾。如果色谱柱受到了比较严重的污染,色谱柱的反压力会达到一个无法承受的高度,这将会使泵超压工作,在堵塞的位置引起柱的塌陷并产生中空。表2分析柱的柱体积柱的尺寸(mm*mm)死体积(mL)250 * 4.62.5150 * 4.6 1.5150 * 3.00.64150 * 2.10.2850 * 4.60.5030 * 4.60.3015 * 4.60.15反相高效液相色谱柱的清洗和再生(二)http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045750/反相高效液相色谱柱的清洗和再生(三)http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045752/

  • 【转帖】纠正误区:反相液相色谱柱不是LC-MS/MS分析的主流

    对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的! LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要! 色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点:(1) 许多极性化合物难以保留,质谱灵敏度差。 许多重要的物质,如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素,污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。(2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应(Carryover Effect)的“陷阱” LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应(Carryover Effect)。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 %最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。 由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下,使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。(3) 峰形拖尾或扭曲 因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的Cogent Diamond Hydride反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。另一方面,使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。 专家认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(HILIC或)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外,乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解,从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。

  • 【原创】反相高效液相色谱柱的清洗和再生(二)

    三 清洗硅胶基质的色谱柱 恢复一根已受污染的高效液相色谱柱的关键在于了解污染物的性质,然后寻找一种合适的溶剂将其去除。如果污染物是由于一些强保留物质的多次进样积聚而产生,一个除去这些污染物的简单的冲洗过程往往会使色谱柱恢复性能。有时,在经过了等度操作之后,用20个柱体积的90%~100%的溶剂B(二元反相体系中较强的溶剂)将会除去这些污染物。(表二列出了各种型号的高效液相色谱柱的柱体积,所以读者可以很轻易地确定色谱柱的冲洗体积。)例如,脂质类的化合物可以使用一些非水性的溶剂来去除,如甲醇、乙睛、四氢呋喃。如果你正在使用含水的缓冲流动相,则千万不能将流动相直接跳到强溶剂中。将流动相猛然间改到高比例有机相的举动会导致高效液相色谱流动体系的缓冲沉淀,这将会造成更加严重的问题,如使筛板堵塞,接口管路堵塞,泵的密封垫失效,刮伤泵的柱塞杆,使进样阀转子失灵。相反,应使用非缓冲的流动相来冲洗色谱柱(就是用水来代替缓冲液)。在经过了5~10个柱体积的非缓冲溶剂冲洗之后才能允许较强的溶剂流经色谱柱。 有时,流动相中的强溶剂组分是不能充分去除色谱柱中的污染物的。必须另外使用一种更强的溶剂或一系列的溶剂才能清洗色谱柱。假如污染物是非生物性的,则使用者可以通过一种或更多的其他有机溶剂来去除不需要的化合物。可以使用许多种的溶剂和溶剂组合方式。访问一些色谱柱生产厂商的网站可以浏览到一些推荐使用的溶剂系统。 一般来说,所有的清洗都会遵循一个相似的模式。清洗过程中的溶剂浓度是增加的,通常最后都是使用一些非极性的溶剂(例如:乙酸乙酯,乃至碳氢化合物),它将会有助于溶解一些脂质类和油类化合物。重要的是要确保这一系列的每个溶剂都能与所使用的下一个溶剂互溶。一个清洗循环的结论是,在回到初始的流动相系统之前,可通过中间的可互溶的溶剂反向走。例如,异丙醇就是这个中间步骤的一个极好的溶剂,因为它能够同有机溶剂互溶,如正己烷和二氯甲烷,而且同样也能够和水相溶剂互溶。因为异丙醇有很大的粘度,所以必须确保清洗时流速不能太高,否则会引起泵的压力过载。同样,如果使用了紫外检测器,则需避免使用在紫外光谱区有吸收的溶剂,因为这样会需要大量的清洗溶剂才能去除所有吸收的溶剂以得到一个稳定的基线。对于典型的键合硅色谱柱和无缓冲液的流动相的一个推荐使用的清洗系统就是:l100%甲醇;l100%乙睛;l75%乙睛——25%异丙醇;l100%异丙醇;l100%二氯甲烷;l100%正己烷; 当使用了二氯甲烷或正己烷作为冲洗溶剂后,由于溶剂的不互溶性,需要先用异丙醇冲洗色谱柱,而后才能使用含水的流动相。冲洗色谱柱的清洗溶剂的体积最小为柱体积的十倍。对于一根250mm×4.6mm的色谱柱,分析者可以使用经典的1~2mL/min的高效液相色谱流量。为了要回到原来的流动相,色谱工作者可以跳过颠倒使用该系列的清洗溶剂。推荐使用异丙醇为中间的清洗溶剂,然后用不含缓冲液的流动相冲洗,最后再用最初使用的流动相进行冲洗。四氢呋喃是另一个使用广泛的溶剂,它可以被用来清洗受污染的色谱柱。如果使用者怀疑色谱柱受到了比较严重的污染,则可以用二甲亚砜或二甲基甲酰胺与水以50:50的比例,以小于0.5mL/min的流速进行清洗。成功的反向液相色谱柱的再生需要花费相当多的时间,使用溶剂进行冲洗可以设置梯度程序来进行通宵操作。* 在清洗过程中产生了是否应该将色谱柱颠倒过来冲洗的问题。因为大部分的强保留的污染物都会留在色谱柱的前端,将色谱柱颠倒过来清洗会减少已被溶解的污染物流出色谱柱的迁移距离。就填料层的稳定性而言,大部分的现代高效液相色谱柱都是用比普通操作压要高得多的压力装填的;因此,色谱柱的填料层应该不会受到反向的流速的干扰。然而,如果色谱柱顶端的筛板的空隙要比底部的来得大,这种反向的方式则是有害的。比如说,如果底部筛板的空隙为2µ m,则足够容纳装填有平均填料粒径为5µ m的色谱柱。(含有粒径5±2µ m的尺寸分布)。然而生产商往往在色谱柱的顶端安装空隙度比较大的筛板,以防止其被样品或流动相颗粒所堵塞。如果这种筛板的空隙度要比粒径大小分布的最小微粒大,部分填料会经筛板而流出色谱柱,这样就会产生中空。如果色谱柱上有一个箭头来提醒色谱柱的流向,我觉得应该在反向使用色谱柱之前参考说明使用书,浏览生产商的网站,或与技术支持组进行商讨,以确定这是否是一个安全的举动。无论你是否将色谱柱反向使用,最好要将色谱柱同高效液相色谱检测器断开,使污染物或者颗粒留在筛板上而不流经检测池,因为这些物质会污染检测池。 清洗污染的反相色谱柱的频率依懒于有多少不明物质被注射到柱子中,因为反相色谱柱有时在分辨率损失和外来物质的洗脱前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他们观察到一些异常现象才对柱子进行清洗。然而,长时间累积的污染物会使色谱柱的清洗工作变得更难。正因为如此,如果你知道自己的色谱柱很容易受到脏的样品基体的污染时,我建议定期清洗你的色谱柱。清洗的次数越多,清洗条件也就越简单。反相硅胶基质色谱柱中残留蛋白质的清洗 如果一些如血浆、血清的生物物质留在了反相液相色谱柱上,色谱工作者必须使用一些不同的清洗程序。在大部分情况下,一些比较纯的有机试剂如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白质的,所以它们不能有效清洗反相液相色谱柱。然而加入了缓冲液、酸或者一些离子对试剂的混合有机溶剂能够有效清洗这些物质。起初,可以尝试含比较高浓度的溶剂B的流动相来冲洗色谱柱。Freiser和他的同事(4)发现来回反复地梯度洗脱,使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色谱柱再生。Bhadway和Day(5)建议进样100µ L的三氟乙醇到250mm×4.6mm色谱柱可以达到清洗的目的。如果这些方案都失败了的话,推荐使用Cunico和他的同事们(6)的强洗脱液和溶解性的试剂(见表三)。然而,在用这些试剂冲洗色谱柱之前,应该参考色谱柱的手册,或和生产商进行商议,以确保其不会破坏色谱柱的填料。硅键合色谱柱的填料往往能够与这些试剂共存,而聚合物色谱柱可能会因为与特定溶剂结合而使填料产生膨胀或收缩,从而影响到色谱柱的性能。表三 用于HPLC反相色谱柱蛋白质物质除去的清洗溶剂溶剂组成乙酸1%的水溶液三氟乙酸1%的水溶液0.1%三氟乙酸-异丙醇40:60(V:V)(粘稠的,通常降低流速)TEA-异丙醇40:60(V:V)(在三乙胺混合前用0.25N的磷酸调节pH到2.5)尿素或胍的水溶液5-8M(调节pH到6-8)NaCl,Na3PO4,Na2SO4水溶液0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)DMSO-水 或 DMF-水50:50(V:V)来自参考文献6。如果使用了早期的一系列溶剂,则必须确保表三中的溶剂与这个系列中的溶剂都是互溶的。异丙醇是一个良好的中间冲洗溶剂。在体系中的清洗体积最少为20个柱体积。由于一些溶剂清洗系统具有一定的粘滞性,所以必须调整冲洗流速以避免产生超压。在清洗完一根含有胍和尿素的色谱柱后,需要用至少40~50柱体积的色谱级的水进行冲洗。对于反相高效液相色谱柱来说使用一些如十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton的清洗剂来清洗是不妥的,因为这些化合物会强烈地吸附在硅胶基质的表面而难以去除。这些试剂会影响填料表层,改变填料的性质。然而,分离小组的研究发现,肽合成过程中保护基团和净化剂产物对柱子的污染,可以通过在流动相中注射500µ L的1%SDS溶液以1mL/min的流速进行冲洗(7)。如果接下来使用含0.1%(V/V)三氟乙酸的5%~95%乙睛的梯度,在开始的条件下进行平衡,多肽的分离效果则可恢复。

  • 【资料】纠正误区:反相液相色谱柱不是LC-MS/MS分析的主流

    对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的! LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要! 色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点:(1) 许多极性化合物难以保留,质谱灵敏度差。 许多重要的物质,如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素,污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。(2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应(Carryover Effect)的“陷阱” LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应(Carryover Effect)。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 %最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。 由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下,使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。(3) 峰形拖尾或扭曲 因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。另一方面,使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。 专家认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(HILIC或Cogent Diamond Hydride)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外,乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解,从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。

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    [color=#444444]反向高效液相色谱是流动相的极性大于固定相,极性大的物质先出峰,但有个问题我想不明白,当流动相为乙腈:水=50:50时,物质1在5.1min出峰,物质2在8.9分钟出峰,当改变流动相的比例为乙腈:水=30:70时,物质1和2的出峰时间均退后,而且物质1和2出峰时间相差更大,这应该怎么解释?水的极性大于乙腈,改变流动相的比例后,流动相的极性更大了,出峰时间不应该更短吗?为什么刚好相反?[/color]

  • 液相色谱柱使用、保养与反相HPLC柱子的清洁和再生

    液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色谱柱的安装: 1、液相色谱柱的结构: a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。 在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。 b、柱填料: 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 μm之间。 2,色谱柱的安装: a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 c、 按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。二、液相色谱柱的使用: 色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理: a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制:

  • 关于反向高效液相色谱柱的选择和推荐

    反向高效液相色谱测定盐酸多柔比星的含量样品浓度:100ug/ml流动相:十二烷基硫酸钠(1.44g加0.68ml磷酸加500ml双蒸水):乙腈:甲醇=500:500:60进样量:10ul流速:0.7ml/min波长:254nm之前流速为1.0ml/min,杂质峰与主峰分离度为2.273,出峰时间约11.5min,流速改为0.7后,分离度为2.832,出峰时间约11.6min按照这些条件已能得到较好的峰形,但现在我们老师又让我们找适合于蛋白质类药物的条件,因为我们真正要做的是蛋白质药物,而阿霉素只是试验。并且要把样品溶在PBS溶液中,我现在要怎么调整这些条件?(老师还是让我们用阿霉素来摸适合阿霉素的条件)让它的条件适合蛋白质(蛋白质在有机溶剂中容易变性),又能得到好看的峰形?

  • 【讲座名称】:安捷伦科技反相液相色谱柱在单克隆抗体分离中的应用

    【讲座名称】:安捷伦科技反相液相色谱柱在单克隆抗体分离中的应用【讲座时间】:2014年12月18日 10:00【主讲人】:米建秋 (安捷伦消耗品及色谱柱资深应用工程师)【会议简介】安捷伦在反相色谱柱技术上一直处于领先位置,而反相色谱在分析及检定蛋白类药物时扮演着非常 重要的作用。 从 Zorbax 开始,安捷伦科技一直领先液相色谱柱技术。近年还开发了针对于常规液相仪器的快速液相色谱柱 Poroshell 系列,实现高柱效的同时保证了较低的柱压。近期还推出了用于单克隆抗体分离的专用色谱,提供了更快的分析速度和更高的柱效。-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件:只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元手机充值卡一张哦~3、报名截止时间:2014年12月18日 09:304、报名参会: http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/12485、报名及参会咨询:QQ群—231246773

  • 液相色谱柱的选择

    [color=#444444]需要买一根液相色谱柱,反相的就可以了,但是发现色谱柱类型太多了,不知道自己该买哪一种,求教高手指点下,买液相色谱柱需要考虑哪些问题,如何选择适合的液相色谱柱?谢谢![/color]

  • 【资料】反相液相色谱中流动相pH的确定

    反相高效液相色谱缓冲体系PH的选定反相高效液相色谱中缓冲体系PH值的选择在反相高效液相色谱分析中,选择正确的缓冲液PH值,对可离解的化合物分析的重现性十分重要,不恰当的PH值可能导致不对称峰,宽峰,分裂峰或肩峰,而尖锐的,对称的峰是定量分析中获得低的检测限以,两次分析之间较低的相对标准偏差(RSD)和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值,以及如何选择正确的缓冲体系。什么时候需要缓冲溶液?在反相液相色谱分析中,流动相的PH值一般在2.5-7之间,当被分析物在反相条件下可离解,或样品的PH值在2.5-7之外时,就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基,他们的Pka在1-11之间,选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在,离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害,则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前,应先了解被分析物的Pka,高于或低于Pka两个PH值单位的,有助于获得好的、尖锐的峰,从HH公式:PH=Pka+log([A-]/[A])得知,溶液PH值高于或低于Pka两个单位,化合物中99%以一种形式存在,而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。如果选择不到合适的,样品的pKa与流动相的pH非常接近,那么流动相pH微小的变化,都会引起样品保留时间较大的变动。当化合物只有氨基时,缓冲体系的选择十分简单,大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化,所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用,你也许会问水的PH值大约是7,为什么还用缓冲盐,因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性,以及色谱峰的尖锐性,PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱,减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用,而使峰更尖锐,从表1 可值,任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析,但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在上面两个例子中,PH=3的磷酸钾盐都能获得良好的应用,在一般情况下,它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液,并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。为离子对试剂选择缓冲液为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的,离子对试剂例如四丁基铵的盐,十四烷基磺酸钠等,在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对,在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。应用缓冲液PH值来调节方法选择性如前面提到的,氨基化合物的保留随PH的减小而降低,这个特性可以用来调节方法的选择性,如果两个化合物共流出,一个含有氨基,适当改变PH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠PH值,所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团,如果PH值变小,出峰便快,则化合物中可能存在氨基,当PH变大,化合物出峰很快,或流出在死时间处,化合物可能是一种羧酸,因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。总结正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰,捡出限,以及获得稳定的保留时间十分重要,如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。[em01] [em01]

  • 反相高效液相色谱

    [color=#444444]我的问题是:在反相高校液相色谱中,流动相有机溶剂的比例增加,所有样品的化合物的保留都会减弱,提前出峰。这是为什么?[/color][color=#444444]恳请各位给予解答,[/color]

  • 【原创大赛】液相色谱柱维护之正向使用、反向冲洗

    【原创大赛】液相色谱柱维护之正向使用、反向冲洗

    液相色谱柱维护之正向使用、反向冲洗前言: 液相色谱柱是比较昂贵的色谱耗材,正确的使用和维护对发挥色谱柱的最佳性能和延长寿命至关重要。对于新柱的首次使用要平衡活化、按照标签标示的方向使用、保证流动相和样品洁净、在规定pH范围使用等使用注意事项本文就不在此一一赘述,今天我们主要来讨论一下其维护方法。关键词: 色谱柱、维护、柱压、塌陷、冲洗、反向正文: 色谱柱维护是个长期复杂的工作,如果维护得当会得到满意的试验结果,即提高了工作效率,又延长了色谱柱寿命、节约成本。分析色谱柱受损伤的因素发现,填料被污染是最常见的问题。而解决这个问题最有效、方便、省钱的办法就是冲洗色谱柱。现在以大家应用最为常见的硅胶基质键合C18填料的色谱柱为例,如果您的色谱柱前后端筛板是相同的,那么,本文给您的这个建议对您的色谱柱维护将非常实用,即:正向使用、方向冲洗! 色谱柱正常的工作状态即流动相在泵的外力下带着样品流入色谱柱,然后在柱内把样品分离,而后流出色谱柱进入检测器(如下图一)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012313_320698_1622024_3.jpg图一看似简单的过程却会由于流动相、样品的洁净度不够等原因把污染物带入色谱柱(如下图二),也就是说色谱柱本身的使用就是一个被污染的过程,随着时间越来越长,污染越来越来重,直到报废。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012313_320699_1622024_3.jpg图二 色谱柱最先被污染的部位就是柱前段,即使是添加保护柱或在线过滤器,也只能减少污染,而并不能杜绝污染。随着使用时间的延长,色谱柱长期接受来自一个方向的污染和冲击,会带来两个严重后果:一是柱前段被高度污染,柱压升高等;二是色谱柱头填料塌陷,即由于色谱柱头填料长期接受来自同一个方向的力量冲击造成的松懈,如果不及时修复会来到柱效下降、峰型变差甚至分叉等情况(如下图三)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012314_320700_1622024_3.jpg图三被污染后得到的试验图谱自然不合我们的要求,如下图四为某样品在柱前段被污染的色谱柱中检测得到的图谱,理论塔板数、拖尾因子都明显下降,并不符合规定。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012314_320701_1622024_3.jpg图四 我们解决这个污染的办法就是冲洗色谱柱,如果您怕麻烦采用正向冲洗,很显然,根据污染物被流动相带出的方向看,污染物会进过整个柱管内的填料,因此这对色谱柱来说又是一次污染的过程。因此我在这里给您的建议是反向冲洗,使污染物经过最小的路线流出色谱柱(如下图五)。如果您在平时试验中使用此方法,不但能快速的把柱前段的污染物冲洗走,还能把由于流动相冲击照成的柱头填料塌陷修复好,并且采用此方法越早对柱子的修复率越高,色谱柱性能也能保持的越长久。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012315_320702_1622024_3.jpg图五经过反向冲洗后,对某样品同样方法检测,图谱明显变好(见下图六)塔板数、拖尾因子都恢复到原来水平。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110012315_320703_1622024_3.jpg图六 为保证反向冲洗时二次污染色谱柱,大家一定要保证色谱柱前端的管路、流动相等的洁净度。如不能保证流动相的纯度,建议使用前抽滤。因此,此种方法对于色谱柱的日常维护效果明显,值得大家借鉴!也欢迎大家共同讨论,发表自己看法!

  • 【原创】反相高效液相色谱柱的清洗和再生(三)

    [size=4]清洗键合硅胶反相色谱柱的特殊方法[/size]有时,使用有机溶剂是不能去除色谱柱上的污染物的。如果金属离子被硅胶吸附或与键合,这种情况就特别明显了。这时,可以使用螯合试剂如0.05M的乙二胺四乙酸(EDTA)来冲洗色谱柱。EDTA会同许多金属形成络合物,并把他们进行溶解。在使用过了EDTA后,分析者可以用水彻底冲洗色谱柱。如果样品基体含有一些离子性的化合物,可以改变pH值使其变成非离子状态,然后用水—有机溶剂混合溶剂进行冲洗。例如,一个强碱性的基体化合物可以将其pH值调到小于3而将其去除,这会使质子化的胺在水中溶解性更大。对于去除酸性的基体化合物则是将pH值调到比较高—略高于其pKa——pH值大约为8或9,在这个pH值条件下,酸正处于它们的离子状态。然而,要小心键合硅胶基质的色谱柱,因为长时间暴露在高pH值下会损坏的(8)。为了控制缓冲体系和色谱柱中残留缓冲液中的细菌生长,色谱工作者可以使用一些家用的漂白剂稀释到1:10或1:20,用50个柱体积过柱,接着再用50个柱体积的高效液相色谱级的水进行冲洗。不能让漂白剂流经检测器,因为它会破坏流通池。为了防止溶剂瓶中的细菌生长,应该当天配制足够使用的缓冲液,并将不用的缓冲液存放在冰箱中,并加入0.1%的叠氮化钠,不允许在没有流速的情况下使缓冲液长时间驻留在色谱柱中。色谱工作者往往会讨论使用离子对试剂之后对色谱固定相柱产生的影响。一些离子对试剂如辛磺酸(用于阳离子)和四丁基溴化铵(用于阴离子)在含有某些有机改性剂的条件下会强烈地吸附在键合硅相的表面。色谱柱受到了污染不可能再生到他们的初始状态,这只能说用于离子对色谱的色谱柱需要为这门技术而献身,而且永远无法再用于常规的反相高效液相色谱。Bidlingmeyer(9)则并不赞同这种一般性的观点,认为较为极端的pH值,如在酸性条件下(pH 1-3)键合相和末端封尾硅羟基的水解或在高pH值(pH 7-8)条件下的硅胶溶解,这些离子对试剂能改变一些色谱柱的属性。为了去除磺酸类的离子对试剂,他推荐首先使用至少20倍柱体积的不含离子对试剂的相同流动相冲洗色谱柱,然后用不含缓冲液的流动相进行冲洗(在这个清洗步骤中,甲醇是一个比乙睛要好的有机溶剂;对于长链的离子对试剂,需要使用四氢呋喃)很明显,磺酸类的离子对试剂和胺类的离子对试剂存在不同的色谱行为,其对于色谱柱的影响是不同的。Bidlingmeyer和他的同事们(10)证明了当使用了C18柱,流动相浓度大于70%甲醇,SDS,这个长链的阴离子离子对试剂是不会吸附在固定相上的。这种发现也恰好验证了分离组的研究(7)。硅胶键合整体柱,例如Chromolith 色谱柱(Merk KGaA Darmstadt,Germany)应该被当成其他类型的硅胶色谱柱来进行处理。聚合柱的再生用来分离生物分子的聚合柱也会被污染而需要清洗。这种聚合材料的化学稳定性往往决定于它们的强度。实际上,许多的生产商推荐用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗聚合柱。某些反相聚合物柱子如聚乙烯填料(苯乙烯——二乙烯基苯)(PS-DVB)和聚合整体柱如CIM RP-SDVB的叠片柱(BIA Seperations, Ljublijana, Slovenia)以及Swift色谱柱(Isco, Lincoln, Nebraska)可以承受较宽的pH值范围(通常为1~13,有时为0~14),但是,使用者在用一些要求苛刻的有机试剂清洗色谱柱时应该谨慎。根据它们键交联度,当色谱柱暴露在有些有机溶剂中时,会使色谱柱填料产生收缩或膨胀。8—10%以上的高交联度的聚合填料通常具有非常良好的机械稳定性,在水相溶剂中有最小程度的收缩,而在有机溶剂中有最小程度的膨胀。在用一系列溶剂清洗聚合柱之前,最好能够参阅色谱柱手册,或同色谱柱生产商的技术支持部门进行商讨。按照BIA分离要求(11),使用者再生PS-DVB的聚合物整体柱可以通过:l 用10个柱体积的含0.1%的三氟乙酸的异丙醇,以一半的工作流速进行冲洗柱子;l 用至少5个柱体积的100%流动相B以一半的工作流速进行冲洗柱子;l 用至少10个柱体积的100%的流动相A以工作流速重新平衡色谱柱。如果要清洗一根有丁基和乙基的甲基丙烯酸填料的整体柱,可以用10倍柱体积的每份含1.0M的氢氧化钠、水、20%的乙醇溶液和缓冲液,反方向冲洗色谱柱(12),并将蛋白质除去。对于大部分的亲水性蛋白质,使用者应在用水清洗之后加入一个用异丙醇(30%V/V)或乙醇(70%V/V)的清洗步骤。对于微生物污染的清除和钝化,一根PS-DVB整体柱可以用0.5~1.0M的氢氧化钠完全清洗。装填的整体柱应该在室温下用氢氧化钠浸泡至少一个小时以上。用来分离复杂蛋白质如不溶性的细胞膜蛋白、结构蛋白和病毒外壳蛋白的传统聚合填料的色谱柱只需粗糙的清洗条件。例如,清洗这些复杂蛋白质(13)也许要在60 °C条件下用到含3M盐酸胍的50%的异丙醇。肽的合成中来自于固定相树脂的碎片,产生了活性碳正离子,这些碳正离子可以用苯甲醚和硫代苯甲醚来提取。这些碳正离子反应会产生大量的芳香分子,这些芳香分子会在肽的纯化中破坏反相色谱柱。这些污染物在C18柱内有很强的保留,不能用100%的乙睛或甲醇除去。为了清洗这些色谱柱,应该颠倒色谱柱的使用方向,然后用3~5个柱体积的100%异丙醇,3~5个柱体积的二氯甲烷,3~5个柱体积的异丙醇,再回到原来的初始溶剂系统进行冲洗(14)。芳香性杂质的洗脱可以用紫外检测器在260nm波长下进行核实。 氧化锆基质的高效液相色谱柱的再生ZirChrom 分离有限公司(Anoka,Minnesota)已经生产了一系列的氧化锆柱。其生产线也包括了一些反相液相色谱柱,如聚丁二烯、聚苯乙烯、石墨碳等形式。氧化锆要比硅胶更抗pH值,所以涂敷了氧化锆的色谱柱有更高的耐受性,能够经受住苛刻的操作环境,如高的pH值和操作温度。然而由于这些特殊的表面特性,分析者必须保持特定的分析条件以使他们的色谱柱成功地接受各种分析工作。碳酸、氟化物、磷酸根离子都会强烈地吸附在氧化锆柱上。为了将它们从色谱柱中清除,需用50倍柱体积的20%乙睛—0.1M氢氧化钠或0.1M的四甲基氢氧化铵,10倍柱体积的水,50倍柱体积的20%乙睛-0.1M硝酸,再用10倍柱体积的水,20倍柱体积的100%的有机溶剂进行冲洗。对于聚丁二烯和聚苯乙烯柱,色谱工作者可以用甲醇、乙睛、异丙醇或四氢呋喃。石墨碳色谱柱则需要在相同的溶剂中至少加入20%的四氢呋喃(15)。总结反相液相色谱柱会由于一些含强保留成分的样品基体的反复进样而造成污染,尤其是一些分子量高的、亲水性比较强的化合物、如蛋白质这样的生物流动性组成和一些会吸附在硅醇基上的强碱性物质。另外,某些流动相添加试剂如离子对试剂和表面活性剂会吸附在填料表面并改变其性质。被污染的色谱柱会产生糟糕的峰形、假的可重复的保留性、高的反压力和基线干扰。通常一些能够破坏污染物与色谱柱键合或硅胶表面反应的有机溶剂和试剂可以用来清洗色谱柱。 色谱工作者需要小心谨慎,因为这些试剂本身有很强的破坏作用,使用时会造成固定相本身的损坏。此外,通过使用样品的前处理过程,尽可能少地接触到污染物的样品,来防止色谱柱受污染是一个很好的步骤。在所有的应用中,本人强烈推荐使用保护柱来防止色谱柱的污染并对分析柱可能造成的伤害。

  • 液相色谱柱

    液相色谱柱分为正相和反相,我想问他们除了极性强弱的和固定相的差别还有什么不同?洗脱程序呢?

  • 液相色谱柱安装与使用

    液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 一、液相色谱柱的安装: 1、液相色谱柱的结构: a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。 在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。 b、柱填料: 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 µm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 µm之间。 2[/font

  • 五个小窍门提高HPLC反相液相色谱柱的使用寿命

    五个小窍门提高HPLC反相液相色谱柱的使用寿命

    五个小窍门提高HPLC反相液相色谱柱的使用寿命高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代发展的一种色谱分析手段,现如今已成为分离测定的重要方法,广泛运用于制药、食品、环境、石油及生物等几乎所有研究领域,色谱柱作为该系统的核心,分离效果的好坏取决于色谱柱的状态,养成良好的使用习惯,提高色谱柱的寿命至关重要。下面小编就以反相色谱柱为例,给大家列出几个小窍门提高色谱柱的使用寿命。一、 样品前处理由于被分析样品种类繁多,加之样品基质复杂,色谱柱极易被污染,是导致柱压升高、分离能力下降的原因之一,通常有下面两种情况。1、直径大于筛板孔径的颗粒物,堵在柱头筛板上,极易导致柱压高;上样前用针式滤器过滤将很好的解决这个问题,一般有0.22和0.45um规格,根据您的需要选择合适规格的。同时在柱前接上在线过滤器,可过滤流动相携带的颗粒,泵、进样阀磨损流失的颗粒物。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311141155_477191_2563834_3.jpg2、吸附性强的小分子很难洗脱下来,多次上样后聚集在柱头,可导致柱效差,柱压高,尤其是食品、生物、环境样品更容易损伤色谱柱,建议用SPE固相萃取去杂,并安装保护柱 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311141203_477195_2563834_3.jpg二、 养成测柱效的习惯,正确评价色谱柱每个厂家的色谱柱出厂报告中都会附有一份柱效报告谱图,代表该色谱柱的性能,我们只要留意理论塔板数和拖尾因子即可。当拿到色谱柱后,建议先测柱效(可参照出厂柱效报告上的方法),保留谱图,再做样品。当使用了一段时间后,或者实验出现问题时,换一台正常的液相仪测柱效,对比上述保留的新柱柱效报告来评价该色谱柱,这样做可以排除液相仪、样品等其它因素,正确的判断色谱柱是否合格。在修复损坏的色谱柱时,柱效测试将是您判断是否修复好的最佳指标,并且柱效测试流动相很简单,能快速验证。三、 针对色谱柱适用范围选择合适的流动相1、PH:常规的硅胶反相色谱柱PH耐受2-8,当PH偏低时会导致键合相断裂,当PH偏高时会溶解硅胶导致柱头塌陷。也有一些宽PH范围的色谱柱应运而生,在选择色谱柱时PH范围一定要与流动相匹配。2、温度:常规的硅胶反相色谱柱最佳温度20-60度,基本可以满足绝大多数实验,相信温度对于寿命的影响会很小。3、是否耐100%纯水:常规反相色谱柱有个缺点,100%纯水流动相会引起疏水塌陷,导致不保留样品,现在有很多厂家先后推出可以耐纯水的反相色谱柱,您在选择和使用时一定要留意您的流动相是否合适。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/11/201311141203_477197_2563834_3.jpg四、 经常冲洗色谱柱及再生日常清洗:[font=

  • 关于kromasil液相色谱柱反相 sum C18

    关于kromasil液相色谱柱反相  sum C18

    kromasil液相色谱柱反相 sum C18与普通C18柱有什么区别?[img=,690,1380]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801171802186588_4641_2204446_3.jpg!w690x1380.jpg[/img]

  • 关于正相的液相图与反相液相色谱图对应的问题

    [color=#444444]我们分析的一个样品用的是正相液相色谱,但是里面有些组分不能确定,所以想做[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url],但是听说不能做正相的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url],所以考虑了做反相的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url],但是反相跟正相的图完全不一样,怎么办啊?哪位高手给点指点[/color]

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