自动心率检测器

#本文由马尔文帕纳科应用专家冯慧庆供稿# 基因治疗是生物制药行业中一个快速增长的领域，通过基因治疗可实现疾病的治疗或预防。其中，重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域研究较多的一类病毒载体。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一，一般，研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。目前，rAAV的准确定量分析和表征的难度是阻碍基因治疗快速发展的关键因素。我们常常需要对rAAV进行综合全面表征，比如衣壳数量、实心率、颗粒尺寸、聚集体比例等。传统情况，rAAV滴度和病毒载量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技术进行测量。但这些方法通常费时费力，而且精确度不高。本文通过GPC/SEC和多角度动态光散射（MADLS）两种分析技术分析rAAV5样品，展示了快速、准确和可靠地定量测量AAV的病毒滴度（AAV Titer）和实心率(% full AAV)的方法。 01仪器参数OMNISEC GPC/SEC多检测器系统非常适合于生物医药行业，可用于全面表征rAAV样品。OMNISEC包含一个示差折光检测器(RI)，紫外线全波长阵列检测器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射检测器，仅需一次进样，可精确测量绝对分子量、聚集体比例、病毒滴度和实心率。与传统HPLC不同，测量过程不依赖柱保留体积，也不需要一系列标样进行色谱柱校正。图1显示了使用OMNISEC测量的CQA关键质量参数。02检测方法我们采用Empty和Full rAAV5两个样品作为分析案例。Full rAAV5 载有已知分子量为785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。经qPCR和ELISA测量方式可知，该样本的病毒滴度为2.5x1013。采用色谱柱P4000和P3000串联，对rAAV样品的进行色谱分离。由OMNISEC软件采集分析测试结果，其中硬件系统包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自动进样器和柱温箱)和OMNISEC REVEAL（包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射检测器）。样品经过分离洗脱后，使用共聚物分析方法确定样品两种不同组分的浓度和分子量。计算方法如下：其中，ConcCapsid是衣壳浓度(mg/mL)，NA是阿伏伽德罗数，Mwcapsid是衣壳的分子量(g/mol)，ConcDNA是DNA浓度(mg/mL)，MwSeqDNA是来自序列的ssDNA的分子量。因此，通过计算出的颗粒浓度，可以很容易地得出样品实心率的百分比。 03检测结果案例一：图2显示了Empty rAAV5的三检测色谱图。RI信号由红色曲线表示，260 nm紫外信号由紫色曲线表示，直角光散射(RALS)信号由绿色曲线表示。样品包含四个部分：单体峰保留体积(RV)在12.5ml，碎片在16ml ，二聚体在10.5ml ，聚集体在8.5ml 。使用共聚物分析方法，可以得到表1结果。单体的分子量为3.84×106g/mol。衣壳的理论分子量为3.8×106g/mol，证实分析结果与预期相符。MW/Mn为分子量分布，描述了样品的分散性，单体和二聚体的值接近1，而聚集体和片段均显着高于1，表明在同一峰内有多个不同分子量的组分。Fraction of Sample表示样品组分百分含量，单体所占百分比为84.7%。Fraction of Protein显示了样品中衣壳的百分比，单体包含99.8%的衣壳。这证实了样本确实是Empty rAAV5。最后Empty rAAV5样品总滴度为5.91x1013Vp/ml。 案例二：第二个样品Full rAAV5的三检测器色谱图如图3所示。图中显示了与Empty rAAV5截然不同的色谱峰。分析色谱图可以看出，只包含两个不同的组分，其中单体峰，大概12.5ml RV处，包含Full 和Empty rAAV5的混合物，而聚集体出现在8ml RV处。测试结果见表2。对于主体的单体峰，计算出其混合物分子量为4.49×106g/mol，其中86%为衣壳。rAAV5的蛋白质组分的分子量为3.89×106g/mol，这与表1中Empty rAAV5 的数据一致。单体是总体的93.2%，样本的总滴度为7.48x1013VP/ml。其中单体包含78% Full rAAV5，22% Empty rAAV5。需要注意的是，这种分析方法假设样品要么是Full ，要么是Empty ，忽略部分装载或过度装载情况。Zetasizer Ultra纳米粒度及电位仪可以使用MADLS方式快速确定病毒滴度。从OMNISEC获得的数据与Zetasizer Ultra的粒子滴度进行了比较，两种技术之间有很好的相关性，见图4。另外，本文将Full rAAV5和Empty rAAV5以确定比例混合，来对Full rAAV5样品进行分析。表3显示了每个样品的预期值和实际值Full rAAV百分比。图5显示了期望值和实际值之间有很强的相关性，证实了OMNISEC确定样品实心率结果的可靠性。为了进一步评估OMNISEC对rAAV样品准确表征能力，我们进行了rAAV5样品的热应力稳定性研究，同时，基于ZS Ultra对聚集体的极高灵敏度，我们利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集体的微小变化。测试条件是将rAAV5样品置于25oC到80oC之间进行测试。在不断加热过程中，在每个温度下测量rAAV5样品的粒径。在25oC和35oC之间，没有观察到粒径的变化。从35oC开始，可以观察到粒径开始增大，这表明样品开始发生变化(图6A)。30oC和45oC下的数据比较清楚地显示了这些样品之间的大小差异(图6B)。我们选择45oC条件，对OMNISEC进行进一步稳定性研究。将rAAV5样品在稳定在45oC，分别在2min 、5min、10min和15min后，取样品到OMNISEC上测试。图7色谱叠加图显示样品发生了明显的变化，聚集体百分含量增加，单体浓度含量降低。表4显示MW在此潜伏期内保持稳定，单体峰中的AAV百分比也保持稳定。结论：在这项研究中，我们展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在综合分析表征rAAV5样品的能力，以及将两者联合使用的应用价值。 OMNISEC多检测SEC系统将示差折光检测器、紫外全波长检测器、光散射检测器集成一体化设计，具有更高的灵敏度和准确度，通过一次进样分析，可提供各种血清型AAV样品的绝对分子量、衣壳大小、滴度、实心率、聚集体、片段和样品稳定性等关键质量属性。虽然这些参数中很多都可以使用传统的生物化学方法来确定，但OMNISEC提供了更为简单、可靠的方法，正逐渐成为一种表征分析AAV通用的技术工具。

腾讯数码讯(编译：Ben)第一代运动追踪器如Fitbit，通过内置加速度传感器及软件算法，来实现运动监测，并将其转换为热量数值，以此来帮助人们更好地了解每天的运动量，实现更健康的生活形态。但计步也许是不够的，各种数据显示，心率监测逐渐成为一种新的趋势。　　目前，包括Fitbit、Jawbone、英特尔、摩托罗拉、LG、三星、微软以及苹果，都在运动手环或是智能手表中配备心率传感器，来实现更精准的运动监测。心率监测已经不仅仅是专业运动爱好者和心脏病患者所关注的，而是成为整个运动监测设备行业的新标准。　　　　去年10月，普华永道发布了一份关于运动监测设备的报告，其中33%的受访者表示虽然购买了运动监测设备，但很少或者不再使用它。分析人士认为，造成这种现象的最主要原因是监测设备呈现的数据形式有限，很难吸引消费者一直使用下去，但心率监测则有可能改善这种体验不足。　　目前，先进的运动监测设备所配备的心率传感器能够给更精准地获取运动数据，并且以此为标准实现更丰富的使用体验，比如追踪运动强度、不同的运动训练模式等等，并以此推算出睡眠周期、水化、压力甚至是情绪水平，而不再仅仅是基础的热量消耗。换句话说，心率监测呈现出了一种更加专业和准确的运动数据。　　当然，一个不能忽视的问题依然是数据隐私。由于心率监测相对计步来说更加私人化，所以很多消费者也担心数据泄露造成隐患。不过，在苹果健康等平台的推动下，将数据通过加密形式共享给合作的医疗机构也是一种未来趋势，运动监测设备所获得用户生物数据将更有价值。虽然隐私问题一直是科技行业最令人担心的部分，但&ldquo 因噎废食&rdquo 显然不是一个好的解决方案。　　可以肯定的是，未来几年的运动监测设备将逐渐普及心率监测功能，生产的大量数据无疑是积极的，有助于人们获得更好的运动形态、甚至帮助医疗领域更好地对抗心脏类疾病。

英国Oxehealth 公司开发了一项新型技术，能够让普通摄像头或数码相机集成生物体征监测功能，包括心率、皮肤状况、呼吸率等，具有广泛的应用场景。　　我记得在《少数派报告》上映时，人们很担心电影里的一个场景会变成真的：城市里无处不在的监控摄像头会扫描人们的视网膜，读取身份信息。　　显然，如果这个技术实现，公共安全可能会更好，但人类几乎没有隐私。不过现实中，首先有可能率先到来的不是身份识别、而是体征监测。　　日前，英国Oxehealth 公司发布了一项新技术，只需通过软件技术，即可让普通摄像头、数码相机具有生命体征监测功能，不需要任何特殊硬件。　　简单来说，就是将该软件集成到数码相机、摄像头的处理芯片中，便可监测人类心率指数、皮肤状况、呼吸频率等，有望代替传统的医疗仪器。在牛津大学的临床研究中，该技术的精准率几乎与传统医疗仪器一致，令人印象深刻。 有趣的是，该技术并不仅限医疗机构，还可以应用在监狱、家庭、汽车领域，比如集成在汽车仪表盘中，来判断司机是否适合驾驶 或是用于远程照料老人、婴儿等等。虽然并未透露技术细节，但Oxehealth 公司表示，几乎在任何光线下，都能过精准地测量数据。　　Oxehealth的CEO Hugh Lloyd-Jukes表示，目前正在积极寻求商业部署，虽然暂时没有登陆医疗市场，但由于其合作伙伴是大名鼎鼎的牛津大学，预计该技术的前景还是非常光明的。也许很快，我们就会看到具有心率监测功能的安全摄像头上市。