内毒素凝胶法测定仪应用的规程

p style="text-align: justify text-indent: 2em "细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。其化学成分本质为磷脂多糖-蛋白质复合物，毒性成分主要为类脂质A。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。大量进入人体循环系统后可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等反应——又叫“热原反应”。因此，生物制剂、注射剂、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "化学药品注射剂除内毒素策略及超滤去除内毒素的应用及优势。在化学药品注射剂的制备过程中，难以避免的会从原辅料，过程，人员，设备和环境等环节中引入微生物及内毒素。出于药物安全的考量，药典对于化学注射剂的内毒素水平有严格的限定。这要求注射剂生产企业采取合理的策略，严格控制注射剂中的内毒素含量。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 20px " span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong内毒素特点/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "1.耐热：100℃，加热1小时，不会被破坏。只有在160℃，加热2–4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "2.抗原性弱：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素；把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物（称为抗体），中和作用较弱。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong内毒素的检测/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "内毒素的检测常用家兔热原法和鲎试验法。由于家兔对“热原”的反应与人基本相似，所以半个世纪以来用家兔来检测热原，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。鲎的来源目前主要有2大区域，除了美洲还有亚洲的中国鲎。/pp style="text-align: center margin-top: 10px "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 326px height: 250px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/noimg/9215e3a6-00d0-4b49-bd14-853b4702aea8.gif" title="鲎.gif" alt="鲎.gif" width="326" height="250"//pp style="margin-top: 10px text-align: center margin-bottom: 5px "span style="color: rgb(127, 127, 127) font-size: 14px "strong(图片来自网络)/strong/spanbr//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "2005年版中国药典规定168个品种进行细菌内毒素检查法。其中收录的细菌内毒素检查法包括2种：凝胶法和光度法，都是使用鲎试剂检测内毒素。前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法又可分为终点显（比）色法和动态比色法。该方法灵敏度、精密度高。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "鲎试验收载于1980年20版美国药典，又叫span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong细菌内毒素试验/strong/span（span style="color: rgb(79, 129, 189) "strongBET，Bacterial Endotoxin Test/strong/span）；随后英、德、意、日以及中国相继在药典中收载。此后鲎试验逐渐替代家兔热原试验。但由于部分药品自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，故鲎试验无法完全取代家兔热原试验。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "鲎试剂是鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有丝氨酸蛋白酶原(C因子)、G因子。其中，C因子能被细菌内毒素激活，G因子能被真菌葡聚糖激活，引起一系列酶促反应。根据鲎试剂反应原理，分别有针对细菌内毒素和真菌葡聚糖两种检测试剂盒，用于细菌内毒素含量和真菌感染的检测(G试验)。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong原则解读/strong/spanbr//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "该指导原则是对span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong《1143细菌内毒素检查法》/strong/span内容和应用做进一步的说明。归纳起来有以下几个重点：/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong1.详细阐释了内毒素限值的设定依据：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "内毒素限值由公式“L = K/M”计算得到。其中M为“人用每千克体重每小时最大供试品剂量“，详见《1143细菌内毒素检查法》对公式的解读。K的取值考虑了不同剂型的特点。/pp style="text-align: center margin-top: 15px "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 341px height: 290px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/28bbe22b-3c49-497a-9635-e0664f8bf099.jpg" title="1143章节.png" alt="1143章节.png" width="341" height="290"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "指导原则中增加了span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong“联合用药”“婴幼儿”“营养不良”/strong/span和span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong“恶病质”/strong/span等情况的用药。考虑到细菌内毒素对体弱患者人群可能导致更严重的影响而更加严格的控制最大可接受量。span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong100 mL/strong/span及以上装量的大输液类制剂，其细菌内毒素限值一般不得超过span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong0.50 EU/mL/strong/span。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong 2.对于测量方法的选择的考量：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "对于这两种检查方法，可以根据需要进行选择。凝胶法简便易操作，有可能不能排除干扰作用；光度法可以定量，并且预测趋势。凝胶法常用的反应容器为10 mm × 75 mm的玻璃小试管或空安瓿等，光度法常用的反应容器为测定仪专用试管或酶标板。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong凝胶法：/strong/span凝胶法的优点是操作简便，供试品在排除干扰作用后均可使用凝胶法进行检验。若样品稀释到MVD仍不能排除干扰作用，应进一步对供试品的前处理进行研究，再用干扰试验验证能否使用凝胶法。由于动态法的检测限范围比凝胶法宽，使得有干扰的样品可以有更大的稀释倍数，对于部分使用凝胶法无法排除干扰的样品，可以尝试使用动态法建立细菌内毒素检测方法。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong光度法：/strong/span包括浊度法和显色法，可定量检测内毒素的含量。能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警的作用，更易达到数据完整性的要求。光度测定法可通过回收率判断出干扰的趋势，尤其对于研究性质的样品(如新产品)更具有优势。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong3.供试品的前处理技术：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "*溶解样品：内毒素检查用水/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*助溶：超声波、加热、助溶剂、调节pH等/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*有机溶剂（如乙醇、DMSO等）溶解时，必须进行干扰试验/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*包合技术（如微球、脂质体），采取适宜方法破坏，释放内毒素/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong4.检查法的建立：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "鲎试剂反应的一致性：应使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验。span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 0em "span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong不宜建立细菌内毒素检查项的情况：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*只能使用最高灵敏度鲎试剂（凝胶法0.03 EU/mL，光度法0.001 EU/mL）排除干扰br//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong5.其他：/strong/spanbr//pp style="text-align: justify margin-top: 10px text-indent: 2em "*避免支间差异：规格大于0.1 mL/支装量的鲎试剂时，为避免支间活性差异带来的影响，应复溶后混合，再分装使用。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "*若MVD值不是整数，可以使用小于MVD的整数进行实验。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong6.重组C因子法/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "对于含有span style="color: rgb(79, 129, 189) "strongβ葡聚糖干扰/strong/span的样品检测，该原则中给出了“重组C因子法”进行测试。C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "重组C因子法试验需采用荧光酶标仪，激发/发射波长一般为: strong380 nm/440 nm/strong，检测温度一般为37° C ± 1° C。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong检测与除杂/strong/spanbr//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "内毒素不仅可以通过快速检测，还可以通过专用的酶标仪配合相关试剂精准检测。对于实验用水中的内毒素，可以使用专用的超滤设备以及纯水机进行测试。span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong仪器信息网/strong/span编辑整合了相关资源，为广大制药工作者提供参考。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong快速检测平台/strong/span/pp style="text-indent: 2em "查士利华检测平台支持相同的卡片技术，准确、方便、实时检测内毒素和葡聚糖浓度。此外，每个系统都与a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C305827.htm" target="_blank"strongCharles River/strong/a Cortex™ 数据管理软件平台集成，创建了一个真正强大，可控的内毒素检测程序。/pp style="text-indent: 0em text-align: center margin-top: 10px " img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 140px height: 193px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/2bc46807-b781-4c83-85a1-1246fb4d3b43.jpg" title="便携.png" alt="便携.png" width="140" height="193"/span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strongbr//strong/span/pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strongEndosafesup® /sup nexgen-PTS™ 新一代便携式检测系统/strong/span/pp style="text-indent: 0em "span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strong/strong/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 198px height: 272px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/fbd7daa6-e453-49fc-85dd-15064ef82a9c.jpg" title="查氏维尔-cutted.jpg" alt="查氏维尔-cutted.jpg" width="198" vspace="0" height="272" border="0"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(89, 89, 89) font-size: 14px "strong实拍Endosafesup® /sup nexgen-PTS™ /strong/span span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strong/strong/spanbr//pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "15分钟内提供定量鲎实验结果；FDA认证，检测范围在0.005-10 EU/mL；系统便携，采样现场直接获得检测结果。/pp style="text-align: center margin-top: 10px " img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 311px height: 122px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/e69fe2a9-77ca-4c0d-9024-609aa7adb801.jpg" title="5卡.png" alt="5卡.png" width="311" height="122"//pp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strongEndosafesup® /supnexgen-MCS™ 多卡片式细菌内毒素检测系统/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "高样品通量，多个卡片共同测定，叠加的台式系统；15分钟内可同时检测5个样品；样品独立检测，允许随时插取，无需等待整批取样。/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 271px height: 167px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/noimg/68f78cdd-3c6f-4408-9285-fd5d04858e4f.gif" title="全自动N.gif" alt="全自动N.gif" width="271" height="167"//pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px color: rgb(127, 127, 127) "strongEndosafesup® /sup Nexus™ 全自动细菌内毒素检测系统/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "消除技术人员在样品制备上可能造成的差异；客户仅需要添加带条形码的样品到平台上即可完成。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 20px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong鲎试剂专用a href="https://www.instrument.com.cn/zc/142.html" target="_blank"酶标仪/a/strong/span/pp style="text-align: center text-indent: 0em margin-top: 15px "a href="https://www.instrument.com.cn/application/Solution-881680.html" target="_blank"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 284px height: 240px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/5f454915-b77f-4a81-b2bf-4c9743d1a359.jpg" title="Thermo专用酶标仪.png" alt="Thermo专用酶标仪.png" width="284" vspace="0" height="240" border="0"//aspan style="color: rgb(127, 127, 127) font-size: 14px "strongbr//strong/span/pp style="text-indent: 0em text-align: center margin-top: 5px "span style="color: rgb(127, 127, 127) font-size: 14px "strongThermo Varioskan LUX多功能微孔板读数仪/strong/span /pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "Varioskan LUX多功能微孔板读数仪是使用鲎试剂检测细菌内毒素适配的酶标仪。在传统酶标仪的基础上，专为内毒素检测优化设计光路，可满足不同鲎试剂检测需求。单通道检测，避免了多通道检测中不同光路之间的差异，另有2个参比通道，确保读数的高度精确性。检测波长范围strong340–850 nm/strong，满足多种鲎试剂检测需求，可进行动态显色法和动态浊度法检测。适用于微量96孔板，在提高检测通量的同时，降低实际成本。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "内置自我诊断程序，在启动阶段，系统对载板位置、光源和滤光片在内的各种相关参数进行全面的检测，确保结果的准确可靠内置振荡器及孵育器。最高温度达50℃，有热盖设计保证温控精确，满足内毒素检测的温度。/pp style="margin-top: 15px text-indent: 2em text-align: justify "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong过滤模块/strong/span/pp style="text-align: center margin-top: 10px "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 245px height: 173px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/016a48e4-8fb8-48e8-8606-e457748318f5.jpg" title="过滤膜.png" alt="过滤膜.png" width="245" height="173"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) font-size: 14px "strongMerck——盒式超滤膜包Pellicon® 2/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "超滤去除内毒素，使用孔径小于内毒素聚体的膜截留内毒素而让料液通过。使用8kD或者10kD的超滤膜包，内毒素截留率通常可以达到99.99%以上。超滤后的液体无相变，无杂质，不影响产品量；可验证；通量高，产品收率高。设备易于清洗消毒除热原，可重复使用。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong超纯水机——去除内毒素等杂质/strong/spanbr//pp style="text-align: center margin-top: 10px "a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C274810.htm" target="_blank"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201708/pic/3f90cbaf-a94c-4eb8-bd04-4b273495e56b.jpg!w300x300.jpg"//a/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "strong点击进入专场，查看更多/stronga href="https://www.instrument.com.cn/zc/478.html" target="_blank"strongspan style="color: rgb(0, 176, 80) "纯水机/span/strong/astrong的信息。/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 15px "span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong2020药典系列文章：/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em margin-top: 10px "strong/strong/ptable style="border-collapse: collapse " align="left"tbodytr class="firstRow"td style="border: 1px solid rgb(255, 255, 255) word-break: break-all " width="433" valign="top"p class="F24 Fw L40 G2"a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200710/553590.shtml" target="_blank"2020药典 |《9306 遗传毒性杂质控制指导原则》解读与对策/a/p/td/trtrtd style="border: 1px solid rgb(255, 255, 255) word-break: break-all " width="433" valign="top"p class="F24 Fw L40 G2"a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200709/553518.shtml" target="_blank"解读2020药典比表面积新增章节 这些仪器五星标注/a/p/td/tr/tbody/table

细菌内毒素检测方法分为两类，凝胶检测技术和光度检测技术。凝胶检测技术又分为凝胶限度法和凝胶半定量法；光度检测技术又分为浊度法和显色法，其中，浊度法分为动态浊度法与终点浊度法，显色法分为动态显色法与终点显色法。在这些方法中，定量分析使用较多的为动态显色法，下表从不同维度比较了不同内毒素动态显色检测系统的区别。Eclipse为您简化内毒素检测程序的每一步——从库存到批次放行Sievers Eclipse月食细菌内毒素检测仪使用微流控自动化和最新的兼容软件来简化您内毒素检测程序的每一步，从供应链和存储到验证、常规检测和签字放行。通过以下方式降低成本并最大程度减少仓储微孔板仅需在室温条件下进行储藏鲎试剂冷藏可降低10倍无需存储RSE或CSE — 内毒素标准品已预先存储于Eclipse微孔板中使用以下方式改进系统实施和cGMP放行几天内即可完成系统验证每个Eclipse微孔板能够验证7种最终产品最少化台式分析仪的维护量 — 无需机器人通过以下方式简化并提高检测量9分钟内即可轻松完成检测，少于30个移液步骤自动执行标准曲线、阳性产品对照PPC和自动混合仅需要简短的分析人员培训出现错误的机会有限省时的模板和附件信息库通过以下方式简化产品放行简化批次检测、数据审核和放行远程数据审核和样品签核全面的专属性检测的审计追踪通过以下方式最大化灵活性并确保合规性企业级的软件解决方案自定义权限数据可靠性和ALCOA+21 CFR Part 11微流体技术的使用让内毒素检测变得轻松、快速。通过简化内毒素检测，制药商可以确保产品安全、同时提高样品检测率并减轻分析员的负担。立刻联系我们，了解更多Eclipse内毒素检测仪的信息。◆ ◆ ◆联系我们，了解更多！

1、体液的组成体液包括血液（血浆、血清）、腹水、髓液、尿以及乳汁等，其中在临床上一般以血液的使用率最为普遍。我们知道血液在心血管系统内是由有形物质（红细胞、白细胞、血小板）及液体状血浆组成。其基本组成如下图： 2、体液测定评价通过对体液中的内毒素含量测定，可以对革兰氏阴性菌所引起的败血症、菌血症、术前术后感染症以及真菌感染症等进行诊断，据国外文献报道正常人血浆中的内毒素水平在3pg/ml左右。通过对血液中的内毒素含量测定可对以下一些症状进行监控和了解。（1）早期诊断；（2）给治疗方案提供理论资料；（3）给药后的治疗效果以及预后判定；（4）一些感染症状的鉴别诊断等。 3、干扰物质的去除由上述简介我们知道，血液的组成十分复杂，因此血中内毒素的测定将会受到来自血浆各种组分的影响，为了获得准确的内毒素测定值，除去这些物质的影响将是十分重要的。目前作为血浆的主要干扰物质有：a2纤维蛋白溶酶抑制剂，抗凝血酶Ⅲ，a1抗凝血蛋白酶，抗凝因子Xa，纤维蛋白酶胰蛋白酶等，对于这些物质的去除方法有很多，如高氯酸法（PCA）法，即在血浆中加入PCA，通过离心将变性物沉淀除去。然后取上清液进行内毒素测定。