人类免疫缺陷病毒核酸定盘检测

据新加坡《联合早报》报道，美国科研人员发现，一种灵敏度较高的核酸检测方法，能够检测得出刚染上人类免疫缺陷病毒(HIV)的病患，而现有的标准检测还无法做到这点。　　加州大学圣地亚哥分校的莫里斯医生等科研人员对3100多人进行了这项研究，安排他们接受标准的HIV病毒检测，以及核酸检测(Nucleic acid test)，即检测HIV病毒的基因物质。　　研究结果发现，有79人感染该病毒 其中有15个病人在接受标准HIV病毒检测时呈阴性结果，但核酸检测的结果却呈现阳性反应。　　研究小组指出，艾滋病患者在染病的最初几天，其血液里含有大量的HIV病毒。他在这段期间内将病毒传染给其他人的可能性也非常高。　　据了解，血库对捐血者采用的正是核酸检测法。HIV病患在开始对HIV病毒产生抗体前的12天，就已经能通过这个检测法确诊。

p style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em "span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong介绍/strong/spanbr//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　急性呼吸道疾病(ARD)在全世界所有急性发病率和死亡率中占很大比例，其中急性病毒性呼吸道感染是主要原因(约80%)。主要病毒病原体包括流感病毒，呼吸道疾病合胞病毒(RSV)，冠状病毒，腺病毒和鼻病毒。在5岁以下的儿童中，仅流感和RSV的全球总死亡率每年就达到300,000例死亡。其他呼吸道病毒(如腺病毒和鼻病毒)的死亡率较低，但发病率很高，造成了巨大的经济负担。 可能引起流行病或大流行的高致病性新兴和复发性冠状病毒，例如严重的急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，已对全球公共卫生构成了巨大威胁。最近，一种新颖的冠状病毒2019-nCoV(https://www.who.int)导致严重的公共卫生事件。该冠状病毒的完整基因组序列已于2020年1月10日发布，与SARS-CoV和蝙蝠型SARS冠状病毒(SL-CoV)超过82%序列相似性。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　对致病性病毒病原进行准确，快速的诊断对于选择适当的治疗方法，挽救人们的生命，制止流行病并减少不必要的抗生素使用非常重要。上述所有病毒均可引起上呼吸道感染和下呼吸道感染，以及重叠的临床表现，如果没有扎实的实验室分析，医生很难区分病原体。常规的诊断方法，例如病毒培养和直接/间接免疫荧光测定(IFA)，既费时又费力，而且灵敏度有限。快速，准确地诊断呼吸道病毒可以帮助进行流行病学监测，以及采取有效的预防措施和实施适当的抗病毒治疗。在过去的几十年中，从常规方法到快速抗原检测，病毒诊断测试一直在发展。最近，已经开发出高灵敏度的核酸扩增试验(NAAT)和即时检验(POCT)。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　在这篇综述中，研究人员描述了目前可用于诊断人类呼吸道病毒感染的各种方法。 预计这些数据将有助于临床实验室快速准确地诊断呼吸道病毒，从而为医生提供及时和适当治疗患者的基本信息。该综述总结了常用的流感病毒，RSV，冠状病毒，腺病毒和鼻病毒的诊断方法，并在下面的评论中进行了详细描述。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong　　流感病毒及其诊断方法/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　流感病毒属于正粘病毒科。 该家族由五个属(甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒，Thogotovirus和Isavirus)组成，它们根据内部核蛋白(NP)和基质(M)蛋白进行分类。 在这些属中，仅甲型和乙型流感病毒引起临床疾病。 乙型流感病毒感染通常引起局部性暴发，而甲型流感病毒是人类感染的主要病原体，因此是大流行性流感的主要原因。基于糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)， 甲型流感病毒位于病毒表面，分为多种亚型。 到目前为止，已鉴定出18种HA(H1-H18)和11种NA(N1-N11)亚型。已使用许多诊断方法，包括病毒分离以及一些新兴的基于分子的方法来检测发生流感的病毒种类。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong人类呼吸道合胞病毒及其诊断方法/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　人RSV是副粘病毒科的无节段，负义和单链RNA病毒。RSV的基因组包括十个编码11种蛋白质的基因。根据基因组序列和单克隆抗体(mAb)对表面糖蛋白(G)和融合蛋白(F)的反应性，RSV可以分为A和B组。RSV是导致严重呼吸道疾病的主要原因。免疫功能低下的人群，例如婴儿和老年人群，在全球范围内具有很高的发病率和死亡率。早期和准确的RSV诊断对于适当的治疗至关重要。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong冠状病毒及其诊断方法/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　冠状病毒属于冠状病毒科。蝙蝠已被公认是各种冠状病毒的天然宿主和载体，并且该病毒已经越过物种壁垒感染人类和许多其他种类的动物，包括鸟类，啮齿动物等。冠状病毒可能引起呼吸系统疾病和神经系统疾病。到目前为止，已鉴定出六种人类冠状病毒(HCoV)，包括HCoV-229E，HCoV-HKU1，HCoV-OC43，HCoV-NL63，严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合症冠状病毒( MERS-CoV)【注：新型冠状病毒2019-nCoV没有统计在内】。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　MERS-CoV是一种人类冠状病毒，于2012年6月首次报道，可引起人类呼吸系统疾病，它被归类为Cβ-冠状病毒谱系，其结构包含约30 kb的正向链，人类MERS-CoV与MERS-CoV来源于骆驼具有超过99.5%的核苷酸同一性，这表明人和骆驼分离物属于同一冠状病毒物种。截至2019年9月30日，实验室确认的2468例MERS-CoV感染病例，包括851例死亡。由于目前尚无用于MERS的商业疫苗或治疗方法，因此快速准确地诊断MERS-CoV对于预防其传播和暴发非常重要。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　当前对冠状病毒的诊断测试包括RT-PCR，实时逆转录PCR(rRT-PCR)，逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP)以及实时RT-LAMP。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　基于靶向SARS-CoV和MERS-CoV保守的S2基因的引物和探针，开发了一种RT-PCR方法。通过使用pUC57SARS-pS2作为SARS-CoV的模板和pGEM-MERSS2作为MERS-CoV的模板，可以实现50-100拷贝/ mL的足够检出限。设计了单重RT-iiPCR检测MERS-CoV包膜基因(upE)和开放阅读框1a(ORF1a)基因分开。与参考单重RT-qPCR检测相比，单重MERS-CoV ORF1a和upE RT-iiPCR检测的灵敏度分别为99.03%和100%。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　有六种基于rRT-PCR的市售MERS-CoV RNA检测试剂盒，包括AccuPower(韩国Bioneer)，Anyplex(韩国Seegene)，DiaPlexQ(韩国Solgenent)，LightMix(瑞士罗氏分子诊断公司)，UltraFast试剂盒(韩国Nanobiosys)和PowerChek(韩国Kogene Biotech)。 因此，上述六种rRT-PCR试剂盒的整体灵敏度和特异性足以诊断MERS-CoV感染。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　在RT-LAMP分析中，构建了两套引物，其中一套针对N基因，一套针对ORF1a基因。两组都显示了高效扩增来自不同MERS-CoV株的靶序列的效果，并且与其他呼吸道病毒没有交叉反应。Huang的研究小组已经建立了一种将RT-LAMP技术和垂直流相结合的核酸可视化技术。可视化条(RT-LAMP-VF)检测MERS-CoV的N基因。RT-LAMP-VF检测方法与多个SARS相关CoV(包括HKU1，HKU4，OC43和229E)无交叉反应的RNA，因此具有很高的特异性。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　上面提到的RT-LAMP和RT-LAMP-VF是用于快速准确检测MERS-CoV感染的检测方法。 Bonhan Kooa的团队设计了一种拱形多目标传感器，该传感器能够通过在临床样品中直接扩增来快速鉴定病原体。该方法能够以高灵敏度和特异性检测包括MERS-CoV在内的多种病毒，并且能够在20分钟内将临床样品中的MERS-CoV与HCoV区分出来。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　 span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong人腺病毒及其诊断方法/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　腺病毒(AdV)感染现在被视为人类或动物发病率和死亡率的重要来源。人腺病毒(hAdV)感染很容易传播，可感染所有年龄段的人群，尤其是婴儿和老年人，以及具有免疫缺陷和器官移植的人群。HAdV具有直径70至100nm的无包膜球形结构。外壳由252个帽壳组成，包括240个六邻体和12个Penton，由二十面体病毒衣壳组成。帽体排列在20个三角形表面上，使壳形成30个边和12个顶点。hAdV的基因组以线性双链DNA的形式存在于衣壳中，大小从34到37 kb以上不等。HAdV属于腺病毒科，已经被分类。根据六邻体和纤维蛋白特性，相对核酸同源性，免疫化学反应，生物学特性和系统发育关系分为7种(A至G)，具有50种以上血清型。该细分具有一定的临床意义，主要是因为不同的hAdV在组织方向和疾病类型上有所不同。HAdV可引起多种疾病，例如呼吸系统疾病(hAdV-B，-C和-E)，肠胃炎(hAdV-F和-G)，角膜结膜炎(hAdV-B和-D)和脑膜脑炎(hAdV-A， -B和-D)。因此，在hAdV进展之前对其进行有效，快速的诊断将提供对hAdV感染的有效监测，并确保及时有效地治疗与hAdV相关的疾病。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong鼻病毒及其诊断方法/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　鼻病毒(RVs)是属于Picornaviridae肠病毒科的RNA病毒，已被分类为3种(A至C)，具有超过160种血清型。RVs是具有二十面体对称的小型单链RNA病毒。RVs是儿童和成人中最常见的呼吸道感染原因。RV-A和RV-C是常见的RV种类，可引起下呼吸道疾病，喘息和急性哮喘，与儿童相比，它们可能导致比RV-B更严重的症状。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　病毒的培养分离和酸稳定试验相结合是RV诊断的经典方法。但是，该测定费时且费力，从而限制了其在临床治疗中的价值。可以通过免疫学方法检测人RV抗体。但是，由于缺乏合适的交叉反应抗原来覆盖大量RV血清型，这些方法的应用受到很大限制。相比之下，一步式实时PCR分析通过使用序列检测RV。该测定法改善了工作流程，减少了准备时间，并消除了从逆转录反应步骤中cDNA可能引入的交叉污染。半嵌套式RT-PCR测定法基于一种极其灵敏的PCR方法，可检测空气传播的RVs的检出限(LOD)约为0.8。随着全基因组测序(WGS)技术的迅速发展，越来越多的实验室可能在临床上对人RV分离株进行WGS 。随着hRV-C的发现，全基因组hRV测序的数据量已大大增加和改善。这将有助于研究人员和临床医生了解RV的进化和重组，可以改善诊断。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong多重呼吸道病毒检测/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　尽管可以在有症状的患者中检测到单个呼吸道病毒，但其他呼吸道病毒也可能同时存在。儿童，尤其是五岁以下的儿童，发生共感染的频率更高。在单个试管中包含多个病毒基因靶标的多重测定法具有快速检测几种潜在病毒病原体的优势。同时。多重实时PCR已允许在短时间内同时检测多种呼吸道病毒。与单重方法相比，多重诊断方法具有更高的样品通量(每次运行96个样品)，更短的周转时间(5h)和更少的样品需求量。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　span style="color: rgb(79, 129, 189) "strong结论/strong/span/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　在全世界所有年龄组中，呼吸道病毒都是症状性呼吸道感染的主要原因。对这些病毒的及时，准确的诊断可以对感染进行适当的治疗。总结了几种常见的呼吸道病毒(如流感病毒，人RSV，冠状病毒，hAdV和鼻病毒)的传统和现代分子诊断方法，以及它们的优点，缺点和原理。但是，这些呼吸道病毒容易因病毒基因中的点突变而引起抗原漂移，基因重排可能导致具有大流行潜力的新菌株。所有这些继续对快速准确地检测人类呼吸道病毒感染提出了新的挑战。/pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "　　因此，鉴定病毒基因组内的突变是非常必要的。但是，为查明人类呼吸道病毒的基因突变所做的努力依赖于使用Sanger测序对单个基因或基因家族进行高通量测序。尽管这种方法取得了丰硕的成果，但Sanger测序的成本和通量通常禁止构成外显子组的?22,000个基因的系统测序。 NGS技术的最新发展通过提供以相对较低的成本快速测序外显子组，转录组和基因组的能力，改变了这种范例。 NGS在呼吸道病原体的诊断和鉴定中的应用，特别是对于重症肺炎或不明原因感染的患者，越来越受欢迎。与传统方法相比，NGS具有检测重症肺炎患者中合并感染的能力，并且在诊断重症肺炎中表现良好。作为一种不经常循环的基因型，病毒株整个基因组的表征将促进对其流行病学和致病性的进一步研究，并有助于诊断新出现的呼吸道病毒。 WGS可以更好地识别传播事件和爆发，这在亚基因组序列中并不总是可能的。/p

新冠病毒核酸检测的重要性不言而喻。那么，随着一天中的时间和人体昼夜节律的变化，病毒的行为会有所不同吗？是否会影响新冠肺炎核酸检测结果呢？据26日发表在《生物节律杂志》上的论文，美国范德堡大学的研究人员发现，新冠病毒核酸检测灵敏度随人体昼夜节律而异。人们在中午进行检测获得准确阳性测试结果的可能性比晚上高2倍。　　研究人员认为，这些数据支持一种假设，即新冠病毒根据自然昼夜节律在人体内的行为有所不同，对其他病毒和细菌感染的研究也暗示了这一点。受感染的细胞将传染性病毒颗粒释放到血液和黏液中，即“病毒散播”，在中午似乎更活跃，因为人体生物钟调节了免疫系统。　　研究结果表明，晚上8点以后病毒载量较低。如果人们选择在这时候进行检测，出现假阴性结果的可能性可能会更高。这不仅不利于患者本人及时接受相应的治疗，也会给周围人群的健康带来威胁。此外，在下午“病毒散播”的高峰期，潜在新冠肺炎患者更有可能与他人接触，也可能会引起病毒传播。　　研究人员表示，还需要进一步的研究来证实导致新冠病毒白天活跃的原因。范德堡大学生物科学教授卡尔约翰逊说，对感染新冠肺炎的患者进行实验测试，看看个人在一天中是否以不同的方式排出病毒，这将对公共卫生产生重要影响。　　研究人员认为，可以利用时间因素来最大限度地发挥干预策略甚至疫苗策略的有效性。为了提高结果的准确性，应该在一天中的最佳时间进行检测，同时还能避免假阴性测试结果的出现，尤其是在无症状感染人群中。

防疫抗疫，病毒检测是关键环节。目前主要手段有两种，一是常规核酸检测，二是抗原快速测试。前者准确率高，但检测时间相对长且需要在实验室完成检测；后者检测速度很快，但准确率相对较低。那是否有一种方法，既可以保证新冠病毒检测的准确率，又能保证检测的效率，而且成本非常可控？答案是，这种发明已经出现了！4月12日，香港理工大学公布一项研究成果——便携式新冠病毒核酸检测仪。香港理工大学介绍称，2020年，在香港特区政府食物及卫生局的支持下，理大的跨学科研究团队获医疗卫生研究基金（Health and Medical Research Fund）拨款逾270万港元开展该检测仪的研究。在过去一年半，团队利用反转录恒温环状扩增法（RT-LAMP）及金纳米粒子（作为核酸扩增显示剂），成功进行精准的新冠病毒检测。临床样本测试结果与反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR）标准完全吻合。据了解，该检测仪可同时放置六个样本，撇除两个阳性及阴性对照样本之外，可同时检测最多四个样本。采集样本后，即可使用检测仪在现场进行检测，无需将样本送回实验室。该仪器会创造摄氏65度的恒温状态，其内置的光学装置，能侦测到金纳米粒子的沉淀情况（阳性样本会沉淀，而阴性样本会保持分散）。相关数据会通过蓝牙即时传送到手机，并以软件进行分析并显示结果。由香港理工大学研发的“便携式新冠病毒检测仪”体积轻巧，仅重约2.4公斤，体积为21厘米×21厘米×10.5厘米，且配备内置电源，充电后便可使用，方便于实验室以外的环境操作。香港理工大学供图。在10至20分钟之间，荧幕上显示的光学数据若呈现上升趋势，即代表该样本为阳性，数据上升速度愈快代表样本的病毒含量愈高，这意味着在25分钟内，可以确认阳性样本，而整个检测约40分钟内完成，检测结果凭肉眼就可以辨识！带领该项研究的香港理工大学医疗科技及资讯学系教授及系主任叶社平教授指出︰“研究的关键在于金纳米粒子显示剂，透过我们研发的检测仪进行的检测，其灵敏度及特异度均能达致100%，与现时新冠病毒核酸检测的‘黄金标准’看齐。”阳性样本（右）的金纳米粒子会沉淀，而阴性样本（左）会保持分散，检测结果可凭肉眼辨识 香港理工大学供图检测仪另一特点，是可于实验室以外的环境操作，且配备内置电源，充电后便可使用，并能在采样后即场完成整个检测程序。团队成员理大生物医学工程学系副教授及副系主任李铭鸿博士解释︰“团队所作的环境样本测试，已成功利用恒温环状扩增法，不用另外萃取核酸，倍大核酸用作检测，大大缩短检测时间，不必使用实验室内的大型核酸检测仪器，在体积细小的检测仪内已能做到准确的核酸检测。即使病毒量低，精准度也不受影响。团队快将展开以人类的原样本（未有萃取核酸）进行的测试。”成本更低适合方舱、口岸、学校、商场等多个场景病毒检测技术比较 参考资料：香港理工大学李铭鸿博士表示，检测仪除了可用于检测人类及环境样本，还能检测不同的病毒和细菌（配合相应引子）。团队表示，希望将研究成果转移，与业界合作将技术在社区普及应用，特别是一些需要在短时间内得到准确检测结果的地方，例如机场、方舱、安老院舍、诊所、口岸、餐厅、商场、学校、体育及康乐设施等，加强个人及环境卫生管理之余，亦有助相关机构制定适切的防控策略，减低社区感染风险。研究团队透露称，该检测仪还未进入量产阶段，难以计算实际成本，但估计新技术的成本更便宜，目前正与一间国际检测机构接洽，希望在上述应用场景普及应用。香港理工大学副校长（研究及创新）赵汝恒教授 (中) 对由医疗科技及资讯学系教授及系主任叶社平教授（左一）及生物医学工程学系副教授及副系主任李铭鸿博士（右一）带领的研究项目─“便携式新冠病毒检测仪”感到鼓舞。香港理工大学供图至于在户外检测会否增加样本受污染风险，研究团队表示，任何检测方法都有受污染风险，因此需专业化验人员进行。李铭鸿补充，样本放进仪器后毋须再打开盖，在密封情况下，污染风险非常低。他认为，若疫情回落至个位数，反而需要灵敏度较高的检测技术，防止病毒量低的患者流入社区，导致疫情再度爆发。至于便携式检测仪将来会否全面取代目前常用的核酸检测，港媒香港01报道称，叶社平教授认为虽然理论上可取代常规核酸检测方法，但两者的关系更应是“取长补短”。香港理工大学副校长（研究及创新）赵汝恒教授对此次研究的成果感到鼓舞，他表示︰“感谢食物及卫生局对理大的信任，透过医疗卫生研究基金拨款，让理大得以发挥跨学科的力量，全力支援和配合政府的抗疫工作，并将研究成果转化应用，惠及社群。”

p　　新型冠状病毒COVID-2019仍然是公众最关注的的话题，红外热成像仪、核酸检测试剂盒、抗体快速测试卡等一大批仪器在这场抗疫战争起到了至关重要的的作用。例如：/pp　　a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200213/521866.shtml" target="_self"红外热成像入校园!体温快速筛查系统在国科大四校区全面启用/a/pp　　a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200217/522086.shtml" target="_self"15分钟现场筛查!南开大学7天研制出新冠病毒抗体快速测试卡/a/pp　　12日在瑞士日内瓦闭幕的新型冠状病毒全球研究与创新论坛将研发更加简便的确诊工具定为短期内最迫切的目标。br//pp　　a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200214/521891.shtml" target="_self"新冠病毒全球论坛聚焦：研发比PCR检测更简便易行的确诊工具/abr//pp　　那么，目前可能适用于新型冠状病毒的检测手段都有哪些?/pp　　strong一、核酸检测方法/strong/pp　　strong1. 全基因组测序/strong/pp　　全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。/pp　　特点：可准确鉴定病毒、在病毒溯源和流行病学调查中有重要作用/pp　　问题：测序时间较长、灵敏度相对较低/pp　　strong2. RT-PCR/strong/pp　　基于病毒基因保守序列的RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的常用方法，本次新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S区位点 可以只检测RdRP基因或者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定量。/pp　　该方法的优点是相较于其他抗原抗体法(如胶体金技术)更为灵敏，检测结果更为准确，但是检测需要专业的仪器和分子检测实验室以及专业的操作人员，操作不当或者实验室条件不足可能会因气溶胶污染造成假阳性，且整个流程需要几个小时，相较于胶体金法时间更长。/pp　　strong3. CRISPR/strong/pp　　CRISPR系统由向导RNA(gRNA)和Cas蛋白组成，gRNA能够指导Cas识别并切割带有特异序列的RNA或者DNA分子。其中Cas13a蛋白在特异性切割靶标RNA时，会继续切割非靶标RNA，利用这一特点，在整个体系中加入带有荧光标记的RNA信号分子，一旦带有荧光的RNA被切开，就会发出荧光信号，该技术与等温扩增技术结合，可高特异性高灵敏性低对病毒核酸进行检测。/pp　　该技术检测时间相较于RT-PCR短，但是CRISPR系统研究出现时间较短，该系统存在有脱靶的可能，其灵敏度和特异性还有待考证。/pp　　strong4. 逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)和实时RT-LAMP/strong/pp　　逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)对2009年H1N1大流行病毒的敏感性为97.8%，特异性为100%。基于LAMP的检测方法也被用于检测高致病性的H5N1和H7N9禽流感病毒，其敏感性比基于RT-PCR的方法具有可比性或更高的灵敏度。/pp　　二、strong病毒分离鉴定/strong/pp　　病毒培养是诊断流感病毒感染的传统方法之一，但是传统的分离鉴定方法需要连续培养多天，敏感性和特异性都会低于核酸检测方法，虽然在前期确定侵害性病原物起到关键作用，但较为耗时，且不便捷，不能满足大量疑似患者筛查需求。/pp　　strong三、免疫学检测方法/strong/pp　　strong1. 直接免疫荧光技术/strong/pp　　将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位，这种检测方法的敏感性低于核酸检测方法。/pp　　strong2. 免疫胶体金层析技术/strong/pp　　胶体金是一种常用的标记技术，是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。用于检测病毒使用的试剂条包被的是人体免疫系统中出现的该病毒特异性抗体或者是检测病毒本身的抗原，检测结果会出现肉眼可见的红色或者粉色条带。/pp　　虽然免疫胶体金层析技术操作简单，出结果快(一般为20分钟)，但是此方法敏感性较差，加入样本后的原理靠的是层析，也就是往外分散，如果材料等质量有误差，会影响检测结果 也会因为病人感染时间较短或者采样部位导致病毒含量较低，导致出现假阴性。另外，该方法由于依赖抗原抗体，对于前期开发时选择包被的抗原/抗体最为关键，短时间内开发出的产品有待确认其特异性和灵敏性。/pp　　strong四、其他方法/strong/pp　　基因芯片技术、酶联免疫吸附测定(ELISA),IgG及IgM免疫荧光检测。/pp　　在本次疫情中，通过临床特征和各项指标的判断，以及核酸检测来最终确诊是否为新冠病毒感染，其中CT影像和核酸检测一直作为诊断标准在疫情诊断中发挥着重要作用。从目前来看，不同检测方法均存在着各自的优势和弊端，只有综合运用各种检测工具，才能实现快速高效的检测，缩短新冠患者的确诊周期。/ppbr//p

p　　6月21日，中国科学院武汉病毒研究所周溪研究员课题组与军事医学科学院微生物流行病研究所秦成峰研究员课题组合作，在抗病毒免疫研究方面取得重要进展，揭示了RNA干扰(RNAi)通路在哺乳动物中具有抗病毒免疫功能。相关研究成果以“Human virus-derived small RNAs can confer antiviral immunity in mammals”(人类病毒来源的小RNA在哺乳动物中产生抗病毒免疫反应)为题发表在Immunity上。/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/07f8ce46-d0a4-462c-b5c0-322f70a48b87.jpg"//pp　　RNAi是一种在真核生物中高度保守的转录后基因沉默机制, 并已被公认在真菌, 植物和无脊椎动物中起到关键的抗病毒免疫作用。在RNAi抗病毒过程中, 病毒RNA复制所产生的双链RNA(dsRNA)被宿主Dicer蛋白识别并切割成小干扰RNA(siRNA)。这些病毒衍生的siRNAs(vsiRNAs)被转移到 RNA 诱导沉默复合体 (RISC), 并介导同源病毒RNA的降解，从而达到抗病毒的目的。尽管RNAi在哺乳动物中也保守存在，并被广泛用于生命科学与技术研究，然而，在哺乳动物中，RNAi是否同样能起到抗病毒免疫作用仍不清楚。/pp　　在该研究中，研究者利用人肠道病毒71型(EV71)感染的人类体细胞及小鼠为模型，发现其非结构蛋白3A具有RNAi抑制子(VSR)功能。3A能够通过与病毒dsRNA结合来阻止Dicer对其剪切，抑制vsiRNAs的产生。当3A的VSR活性被缺失，VSR缺陷型EV71病毒能在细胞与小鼠中激发RNAi反应，并产生大量vsiRNAs。这些vsiRNA通过Dicer剪切病毒dsRNA产生、被装配进RISC、并高效的介导同源病毒RNA的降解。在正常的人体细胞和小鼠中，VSR缺陷型病毒的复制被极大的抑制 而在RNAi通路缺失的细胞中，突变病毒的复制得到显著的拯救。同时，研究者们还证明RNAi在哺乳动物中所发挥的抗病毒作用不依赖于干扰素反应。/pp　　该研究在人类体细胞及动物水平发现了病毒感染可以产生具抗病毒功能的vsiRNA，确证了RNAi在哺乳动物中是一条抗病毒天然免疫通路 同时，也揭示了一种人类病毒在逃逸RNAi天然免疫的具体机制。该工作完善了对哺乳动物抗病毒免疫机制的认识，并为该领域的后续研究以及针对该通路的抗病毒药物设计或免疫疗法研究提供了理论基础。/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/83124831-da0d-461c-9ddc-1d5837657c0c.jpg"//pp style="text-align: left "span style="color: rgb(153, 153, 153) "br//span/pp style="text-align: center "EV71激发与拮抗RNAi天然免疫/p

本文亮点1.总结了各种检测SARS-CoV-2的扩增分析和传感技术。2.生物传感器必须实现定量输出，以获得更准确和便捷的结果。3.小尺寸检测平台的开发可实现在手机APP、LFA、生物传感检测技术等方面的应用。内容简介2019年12月以来，在急性呼吸道疾病患者中发现了一种新的人畜共患病的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。由于其爆炸性的传染速度，迫切需要像PCR和ELISA等临床检测来快速检测该病毒，以便及早识别受感染的患者。然而，这些技术很昂贵且不适用于即时检测(POC)。目前，缺乏快速、可用和可靠的POC检测方法，导致新冠肺炎成为一个可怕的全球性传染的危机。南京林业大学Yasin Orooji教授和电子科技大学Hassan KarimiMaleh教授等回顾了自SARS病毒被发现以来对人类产生致命危害的冠状病毒，并着重系统的总结了SARS-CoV-2病毒现有的病毒检测技术手段和最新的研究进展。本文详细介绍了冠状病毒的一般特征，描述了各种冠状病毒的扩增分析、传感、生物传感、免疫传感和适配检测方法，并将其作为检测SARS-CoV-2的模板。并且讨论了目前用于识别新冠状病毒(SARSCoV2)的每种技术的检测机制、优缺点。I 冠状病毒冠状病毒科是一个单链RNA病毒家族，包含27-32 Kb的阳性病毒基因组，由双层脂质膜覆盖，表面有大量蛋白颗粒或尖峰，直径约120 nm(图1)。该科隶属于套式病毒目(Nidovirales)，分为两个亚科，6个属，23个亚属，约40种。两个亚科，分别为冠状病毒亚科(Coronavirinae)和环曲病毒亚科(Torovirinae)，都可能涉及人类；然而，就涉及的范围和发病率而言，冠状病毒亚科相对更具有危害性。一旦冠状病毒开始感染人细胞，S蛋白就会将病毒颗粒附着在其宿主细胞上，从而促进病毒的脱壳过程并引发感染(图2)。肽酶是用作冠状病毒的主要受体蛋白质，例如SARSCoV和SARSCoV2以及HCoVNL63通过与ACE2或MERSCoV结合感染细胞同时使用DPP4作为进入宿主细胞的方式。图1. 人类冠状病毒的动物来源(自然宿主和中间宿主)；感染SARS-CoV-2的患者的临床表现；以及常见的冠状病毒及其结构。图2. SARS-CoV-2复制周期示意图。II 检测方法与其他病毒特别是呼吸道病毒相比，新型冠状病毒SARS-CoV-2具有很高的传染性，可以通过近距离接触传播、飞沫传播甚至环境传播。尤其是无症状病毒携带者进一步增加了病毒的传染风险。针对新冠肺炎的这些特点，设计针对该病毒的特异性诊断方法尤为重要。图3. SARS-CoV-2不同检测技术发展概况。III 胸部CT胸部CT扫描是一种利用X射线发现肺组织改变的X线摄影和医学成像，通常有助于呼吸道病毒感染(如冠状病毒感染)的非特异性诊断。在中国武汉对新冠肺炎患者进行的一项研究表明，CT扫描的灵敏度约为98%，与RT-PCR71%的灵敏度相比尤为重要。但CT扫描的表现通常是非特异性的，与其他类型的肺炎相同。而将这种影像学与其他诊断技术(例如实时PCR或生物传感)相结合作为确认对识别COVID19患者是非常有意义的。IV 实时PCR在过去的几十年中，基于核酸的病毒检测已被用于确定病毒基因组的特定序列，从而确认根据症状推测的病毒感染类型。与其他类型的PCR技术相比，实时PCR具有一些优点，包括提高过程速度、缩短循环时间、去除等PCR后程序(如凝胶电泳)、减小扩增子大小以及量化病毒检测。尽管实时PCR检测的准确性和特异性很高，但这种检测既耗时又昂贵，而且还需要专业人员。此外，临床标本中冠状病毒RNA的检测需要专业仪器和RNA提取纯化试剂盒，因为细胞RNA也是与病毒RNA一起提取的，这会干扰病毒的扩增和检测机制。因此，该测试不能用作快速测试。另外，考虑到RNA基因组的不稳定性以及RNA的收集和提取方法，假阴性的机会也会增加。而且，RT PCR测试不能判断患者是否接触过这种疾病并已经康复，或者他们是否更有可能感染这种疾病。冠状病毒还可以使其基因发生突变，这可能会使引物无法检测其特定的目标。然而，检测病毒基因组中的保守区可以改善问题的发生率，例如检测在大多数冠状病毒基因中都很保守的5’UTR区。V 环介导恒温扩增(LAMP)分析环介导恒温扩增(LAMP)是一种新型的DNA分子诊断技术，在恒温条件下具有灵敏度高、特异性强、成本低、效率高、快速性好等优点，是常规PCR的10倍以上。不同于传统的PCR需要一系列重复的温度变化和3-40个循环，LAMP不需要温度循环，是在恒温(60-65°C)下进行的。LAMP只使用了一组4个特异引物和一个DNA聚合酶(例如，BST DNA聚合酶的大片段)，具有复制活性和高链置换活性，在不到1小时的时间内扩增出高达109 拷贝的目的基因。LAMP技术也用于使用逆转录酶(RT)和称为RT-LAMP的DNA聚合酶来检测RNA序列。放大的产物可以用光度法测量，直观地显示副产物焦磷酸镁在溶液中沉淀造成的混浊。溶液中的任何变化都可以用肉眼或通过使用SYBR绿等荧光染料进行非常简单的光度技术来观察。这项新技术正被广泛用作检测病毒感染的一种强有力的替代方法。在之前的应用中，RT-LAMP方法被用来在63°C的反应温度下在11分钟内检测到高致病性冠状病毒，如SARS-CoV，这有助于在2003年SARS-CoV暴发期间快速诊断这种感染。LAMP方法有可能成为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2及其相关病态新冠肺炎的装置的候选方法。目前已经有团队设计了一些新的RT-LAMP方法来检测新冠肺炎的病原体，可以在63℃下30分钟内完成检测。甚至还有团队设计出的方案中，检测时长只需要15分钟左右。这种新的方案会更实用，既加快了检测过程，又方便了检测。总而言之，LAMP技术最重要的优点是它提供的时间更少，省去了耗时的过程，并且需要恒定的温度，从而省略了PCR技术中最关键的步骤——热循环器步骤。除优点外，LAMP技术也有一些限制其应用的局限性。LAMP技术使用引物组(在4到6个数字之间)，并针对单个DNA或RNA的几个区域，所以这些引物的设计需要高能力和先进的工具和软件，这些工具和软件比PCR技术要耗时和困难得多。LAMP的其他局限性包括需要使用带有退化序列的引物来检测感染，特别是不同类型的病毒，这只有通过使用PCR检测作为诊断技术才是可行的。LAMP技术中每个靶的大量引物极大地增加了在这一检测过程中引物-引物相互作用的可能性，与PCR相比，这可能会对检测的特异性产生显著影响。LAMP技术的另一个主要缺点和局限性是DNA产物的连续存在，这会导致在凝胶电泳步骤之后出现几条带，而不是在凝胶上有一条带，这使得很难检测到每一条带。VI 酶联免疫吸附测定(ELISA)ELISA检测是基于抗原和抗体之间的相互作用(图4)，使用一种酶以可测量的方式显示和转换读数。到目前为止，已经定义了几种ELISA方法，它们是基于平板底部包被的物质或测定吸光度和准确浓度的方法。一般来说，这项测试有几个问题，这使得它在某些情况下是不合适的。这些问题包括假阴性、样本产生的噪声反应、由于不适当的平板清洗而导致的不特异性反应、耗时、准备的ELISA试剂盒中试剂浓度的差异、价格昂贵，以及需要具有触发免疫分析、使用ELISA读取器和其他相关设备以及计算抗原或抗体的确切数量的操作人员的技能。图4. 检测SARS-CoV-2的ELISA技术。VII 传感方法传感器是出色的分析工具，可以与特定分析物可逆地、选择性地相互作用，并将输入的可测量化学参数转换为特定化合物的浓度和可分析的电响应。到目前为止，各种传感器已经被用来检测各种病毒，如人类冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和寨卡病毒(Zika Virus)等。压电弯曲平面波(FPW)是一种高灵敏度、高灵敏度的超灵敏诊断仪，可以测量振动元件的质量。这些微型器件通常是通过在材料表面或具有压电特性的衬底上形成换能器来创建的。为检测SARS冠状病毒，研制了便携式微型FPW系统。以人血管紧张素转换酶2(HACE2)为功能性受体，研制了检测SARS-S蛋白的功能化FPW生物传感器(图5)。图5. 一种弯曲平面波传感器芯片。基于纸张的DNA比色传感器可作为选择性、灵敏、快速、简便的MERS冠状病毒cDNA检测的替代方法(图6)。纳米颗粒呈现出高度复杂的规格，使它们能够成为任何新颖和有前途的生物创新的一部分。例如，它们的大小和形状可以改变，并且它们的大表面提供了将各种化学基团合并为可用结合位点的平台。正因为如此，通过多重相互作用和主动靶向成像来感知和诊断病毒感染，改变这些纳米材料对靶分子位点检测的生物学功能是可能的。最常见的用于病毒感染治疗或检测的金属纳米粒子有银纳米粒子、金纳米粒子、二氧化硅和介孔纳米粒子、碳纳米管、氧化铁纳米粒子等。图6. 一种基于纸张的DNA比色传感器。VIII 生物传感分析针对不同的病毒，特别是人类冠状病毒，目前报道了各种各样的光学生物传感器，包括等离子体共振(SPR)、椭圆偏振和反射干涉光谱(RIfS)、比色、荧光和表面增强拉曼散射(SERS)等传感器。在这些光学生物传感技术中，SPR生物传感器是非常重要的，因为它们可以直接测量传感器表面光的折射率发生的变化，反映被分析物的浓度。为实现SARS冠状病毒的快速、高通量检测，研制了一种基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器，该传感器是一种实时、无标记的检测系统，可用于SARS冠状病毒的快速、高通量检测。下面介绍两种SPR传感器：8.1 抗体模拟蛋白(AMP)生物传感器基于AMP(纤维连接蛋白)为捕获剂的纳米线生物传感器被引入到SARS冠状病毒的检测中，该传感器对核衣壳蛋白(N)蛋白有很高的亲和力。该蛋白具有很强的抗原性，可能成为一种合适的诊断生物标志物。研究的结果表明，与其他诊断技术如qRT-PCR和ELISA方法所需的较长时间(几个小时)相比，N蛋白可以在亚纳米级的浓度下检测到，反应时间短(~10 min)，并且不需要任何必要的多步分析。这份研究展示了所制造的纳米生物传感器作为一种精确、合适和快速的手段来检测作为SARS-CoV感染生物标志物的N蛋白的能力(图7)。图7. In₂O₃纳米线FET器件外部固定化FN的示意图。8.2 融合蛋白SPR传感器如图8，这里开发了另一种基于SPR的生物传感器，可使用重组蛋白将金结合多肽(GBP)与SARS冠状病毒表面抗原(SCVme)遗传融合而制成，以轻松检测SARS。在这种制备中，具有高金结合亲和力的GBP结构域作为金表面的锚定部分，而SCVme结构域作为识别配体用于检测SCVme抗体。SPR分析表明，融合蛋白通过GBP简单而牢固地固定在金的表面，不需要复杂的表面化学修饰，为抗SCVme的诊断提供了一个独特的、高稳定性的传感平台。图8. GBP-E-SCVme和Anti-SCVme在金微图形上连续结合的示意图。IX 免疫传感分析免疫分析是一种生物分析方法，其中分析物(即抗原)和抗体的相互作用是测量特定分析物的基础。在这一点上，免疫传感试验被指定为一种使用抗体或抗体部分来识别生物分子的分析方法。免疫传感分析中产生的信号与抗原-抗体结合事件的发生率直接相关。在这方面，应用于免疫检测传感过程中的标记应具有许多特点：化学稳定性、低成本、对结合性能的负面影响、可行性、安全性和适用的仪器。值得一提的是，免疫传感技术常用于各种病毒的高灵敏度检测，如SARS CoV-2、HIV、HBV和HCV等。最近，有研究介绍了一种基于侧向流动免疫分析的便携式快速检测装置，它可以在15 min内同时检测感染患者血液中的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，可以区分不同疾病阶段的患者。侧向流动测试，也称为侧向流动免疫色谱分析，是一种简单直接的纸基设备，其设计目的是识别流体样本中客观分析物的存在，而不需要任何特定和过高的硬件。另外，电化学免疫传感器具有灵敏度高、成本相对较低、使用方便、响应时间短和小型化的可能性等优点，已被认为是一种极具吸引力的选择。最近，一种新的基于电化学免疫传感器的间接竞争检测方法被引入到MERS-CoV病毒的检测中。该生物传感器是基于固定化的MERS-CoV蛋白与游离病毒之间的间接竞争，在由金纳米颗粒改变的碳电极(DEP)阵列上对样品(图9)添加的抗体进行固定数量的竞争。该免疫传感器是在DPE阵列上研制的，可以同时快速检测各种类型的冠状病毒。图9. MERS-CoV免疫传感器的制备方案和识别过程。该生物传感器包括在纳米金结构的DEP阵列电极上进行的竞争性免疫分析，以实现对各种冠状病毒的多重识别。X 适配子(Apta)分析Apta被归类为传感方法，是由三组科学家(Robertson和Joyce，Tuerk和Gold，以及Ellington和Szostak)同时推出的短链寡核苷酸(RNA或单链DNA)。使Apta分析独一无二的主要性质之一是它们非凡的亲和力，这是它们的灵活性和与靶结合时折叠的能力的结果。它们具有体积小、靶分子特异性高、体内外适用性好、生物相容性好、生产成本低、分子稳定性高、检测下限低等优点。尽管适配子具有优势和多功能性，但也有可能限制其用途的缺点；这些限制是对核酸酶降解敏感，不能与一些缺乏官能团的靶结合，与抗体的结合比靶分析物更强(对酶消化敏感)。SARS-CoV核衣壳蛋白(N)是含量最丰富的结构蛋白，具有准确、灵敏地检测病毒的识别标志作用。筛选出一种高亲和力的RNA适配子，它能与N蛋白结合，解离常数为1.65 nM。结果表明，所选适配子可以选择性地鉴定在N蛋白的C区，具有很高的特异性。分离的核酸适体可以作为N蛋白分子的捕捉剂，用于制备基于核酸适体的化学发光免疫分析和纳米阵列核酸适体。所制备的核酸适体-抗体杂交免疫分析方法可检测低水平的N蛋白(2 pg mL⁻1)，具有较高的灵敏度和选择性。该适配子-抗体联合免疫分析法可用于SARS-CoV N蛋白的快速检测，具有较高的灵敏度。N蛋白是早期检测SARS冠状病毒感染最重要的抗原之一。为快速诊断SARS冠状病毒N蛋白，设计了一种基于量子点(QDs)连接RNA适体平台的高灵敏度、高特异性光学生物传感器。量子点是半导体材料中的一种胶体纳米材料，与传统的荧光团相比，量子点具有荧光寿命长、稳定性高、发射光谱可调等独特的光学性质，在纳米医学领域，尤其是成像系统中引起了极大的关注。为此，固定在玻片表面的SARS-CoV N蛋白可以有效地与量子点偶联RNA适配子杂交，产生荧光信号。荧光信号的强度与SARS N蛋白的浓度有关。这种基于光学量子点-RNA适体芯片的小型化装置可以检测浓度低至0.1 pg mL-1的SARS-CoV N蛋白。该图形化SARS-CoV N蛋白检测方法具有灵敏度高、准确度高、简便易行等优点。总结与展望目前，由于缺乏任何快速、可用和可靠的检测方法，导致新冠肺炎传播成为一个可怕的全球性危机。本文介绍了各种类型冠状病毒的几种重要检测方法，包括临床检测方法和基于传感器的检测方法：1）以免疫分析为基础的方法，如ELISA，是检测各种病毒来源的抗原或其相应抗体的常用方法，用于诊断疾病或确定疫苗接种的效率。但SARS-CoV-2 IgG/IgM的敏感性仍有待研究。结果受阻是严重的问题之一，可能是由于一系列问题(假阴性、噪音、非特异性反应)造成的。一般来说，ELISA试剂盒价格昂贵，需要熟练的人员进行操作使用设备、解释和报告结果。这些挑战需要开发其他方法来克服这些问题。2）免疫-聚合酶链反应(IPCR)是一种既利用抗体-抗原的特异性又利用PCR的敏感性的方法。ELISA的灵敏度不足以鉴定低抗体的病毒蛋白，它可以检测任何蛋白，PCR不利用抗体，不能直接用于病毒蛋白的检测。IPCR可重复检测，可提高从血清/尿液中检测皮飞克分析物的灵敏度(10到1000倍)，同时由于ELISA和PCR组合(通过抗体-寡核苷酸结合物)提供了多重选择。3）病毒的精细检测和计数是由一种名为实时RT-PCR的优秀工具完成的，其中通过使用SYBR Green或许多荧光探针化学试剂对每个周期产生的改进产物进行定量，以诊断SARS-CoV-2；尽管RT-qPCR具有特异性，但由于漏诊的严重后果，其假阴性率不容忽视。4）在分子方法和PCR或病毒疾病识别之间研究的其他方法中，基于LAMP的方法因其众多优点而具有重要意义。LAMP检测最显著的优点是使用较少的设备、可用、廉价、快速检测以及技术上可靠的测试但LAMP反应的假阳性还需要进一步研究。5）CT扫描和RT-qPCR对SARS-CoV-2的诊断有重要意义；大多数临床医生建议CT扫描应作为一种必要的辅助诊断方法。由于RT-qPCR筛查阴性、临床怀疑感染的患者比RT-qPCR更敏感，因此反复RT-qPCR检测与胸部CT扫描相结合可能是有帮助的。6）基于免疫传感器的技术的设计和使用完全是为了消除旧的临床方法的缺点，因此具有重要的意义。它们具有几个优点，包括快速检测、低成本、可获得性以及能够检测所需材料的低浓度。这些技术也适用于检测冠状病毒颗粒的几个部分，可以解决冠状病毒变异和假阴性结果的问题。LFA(侧向流动分析)是一种更重要、更有吸引力的检测设备，具有广泛的应用前景。它们能提供的重要好处是测试过程简单，样品量要求低，分析速度快，不需要专家人员，性能成本低，使用方便，而且性价比高。7）简而言之，开发具有这些特征的医疗点生物传感器和纳米传感器可以提供在人群中快速筛查SARS-COV2病毒的机会，并限制病毒的传播。

在此次新型冠状病毒疫情中，作为最终确诊的关键性技术，核酸检测发挥了及其重要的作用。但是近期关于核酸检测准确性问题的讨论甚嚣尘上，如何提高检测的准确性，如何减少假阴性/假阳性成为困扰检测工作者的重要难题。从目前已有的资料来看，很多方面得到了讨论，如：冠状病毒感染人体后，病变主要发生肺部，即下呼吸道，上呼吸道咽部病毒含量低，通过咽拭子检测常常出现阴性，再加上其他一些因素，比如：采样不规范，运输和存储等造成病毒RNA降解，核酸检测试剂盒的快速审批入市，质量参差不齐等等，这些环节都可能导致假阴性的发生。同时各环节操作的不规范，还容易出现假阳性的发生。而从核酸提取质量，荧光定量PCR各品牌，各型号的对核酸检测试剂的适应性的讨论就不多见了，本文就病毒核酸提取、qPCR检测、体系加样等环节，在耶拿公司产品的基础上提出了一系列解决方案， 供大家参考。一、核酸提取：作为核酸检测的起始步骤，病毒核酸能否被高效安全的从样本中提取出来，将会成为整个核酸检测至关重要的一步。在多数核酸提取的过程中，操作者将面临如下几类问题：1、咽拭子、血清、血浆等上样量不足，现在普遍是200μL的上样体积，病毒获得不足，产生假阴性结果；2、病毒富集效率低、裂解不充分，导致核酸产物收率较低而引起的假阴性结果；3、提取产物富含高浓度盐分、有机物等PCR抑制剂残留，对后续定量PCR检测产生抑制产生假阴性结果；4、提取过程中过度的剪切力将本来含量不高的病毒核酸破环，病毒核酸完整度差，无法作为后续荧光定量PCR模板而导致的假阴性结果；5、手工提取过程复杂，步骤繁多增加交叉污染概率而导致的假阳性结果；6、常规磁棒法全自动核酸提取仪因磁棒磁力下降导致磁珠残留，进而导致交叉污染出现假阳性/假阴性结果。解决方案德国耶拿公司InnuPure C16 touch全自动核酸提取仪，Cybio-Felix全能型工作站将人们从繁琐的核酸提取纯化过程中解放出来，大大提高了工作效率和产物质量。您只需要加入样本，选择相应的提取程序，按下“开始”即可轻松获得纯净的核酸。l 耶拿公司的C16 Touch核酸提取仪，最大上样体积可到600μL，加大上样量可以获得更多核酸，降低假阴性的产生l 产物无磁珠残留，有效防止交叉污染，降低假阳性；提取结果重复性、均一性更好其配套的针对病毒提取的相关试剂拥有如下两项专利：◆ Dual Chemistry Technology2005年耶拿公司发明了专利性的核酸提取技术DC-Technology（双缓冲液技术），采用独特的裂解缓冲液和新型的结合缓冲液，无需使用高盐结合，提高核酸提取得率，以及更为完整的核酸片段，降低假阴性可能。◆ Smart Extraction技术—新一代核酸提取技术 2016年耶拿公司又发明了专利性的新一代提取技术Smart Extraction，该技术打破常规核酸提取需要借助介质吸附核酸的传统，提取过程无需酚/氯仿、无需离子交换、无需离心柱、无需硅胶膜、无需磁珠，仅需tip上下吹打即可完成。提取得到的核酸得率高、完整度高，纯度好，降低假阴性的可能性。二、荧光定量PCR检测：当检测工作者收获了高质量、低杂质的样本核酸后，荧光定量PCR过程中的检测灵敏度、特异性、重复可靠性就成为了获取高质量检测结果最至关重要的因素了。1、基于仪器老化、设计缺陷等原因导致的荧光定量PCR仪温度控制的准确性、均一性不高，结果扩增效率较低或者批次内和批次间的重复性不佳，导致假阴性结果；2、不同型号仪器采用不同的激发光源对结果会有一定影响，某些光源使用一定时间没有更换，对付近期的高强度检测工作会进一步降低仪器的灵敏度，导致假阴性结果；3、各类荧光定量PCR所采用的检测器灵敏度是存在差异的，导致假阴性结果。基于以上问题德国耶拿公司qTOWER3系列荧光定量PCR仪，以其卓越的温控系统带来快速稳定的实验结果，先进的光学检测系统带来高灵敏度的检测。l 镀金纯银样品槽，采用热传递性非常好的银质材料，快速的升降温速率能够加快实验速度，缩短实验时间，提高实验效率。准确的温度控制带来优异的温度均一性，进而带来各样品间以及各批次间稳定的定量PCR扩增结果。l 采用蓝色、绿色、红色、白色四个高强度长寿命LED固态光源，确保在整个光谱检测范围内都有很强的激发光强，有利于较弱信号的采集，从而提高实验检测灵敏度，减少假阴性可能。LED光源寿命长，免维护，节约后续的使用成本。l 采用定量PCR仪上最新一代的通道式光电倍增管（CPM）检测器，有效降低背景噪音信号，检测灵敏度比CCD或PMT（普通光电倍增管）高，提高检测灵敏度，减少假阴性可能。三、液体处理过程：近期，各类关于检测工作繁重，人员压力大，复检次数众多等，相继被各类媒体争相报道。由此可见，面对如此重大的疫情，检测人员所面对的工作压力是非常巨大的。1、在复杂的检测工作中试剂、样本的错加、漏加都成为假阴性、假阳性产生的主要来源之一；2、液体处理中的交叉污染也成为了检测假阳性结果的主要原因。在如今的新时代，各类全自动液体处理工作站已经在全球各个生命科学、疾病药物诊断研发、政府机构的高通量检测领域中得到广泛的使用。德国耶拿公司建议除了前面提到的核酸提取步骤可以采用全自动液体处理工作站高效的完成之外，PCR的体系构建等工作也可以采用类似的方法来解决。德国耶拿公司Cybio-Felix全能型液体处理工作站，可自动完成定量PCR反应中涉及到的各类预混液、引物、模板、去离子水 等的加样，代替手工快速、准确、高效地进行定量PCR反应体系的构建，适用于各类PCR体系及成品试剂盒的液体处理。1、超高的移液准确性：确保在小体积量程下实现准确地加入模板内并且准确地分装反应体系，有效的减少因加样产生的假阴性结果；2、PCR体系构建快速高效，提高检测效率，让更多的疑似患者能够尽快明确：可在半小时内实现整版PCR体系构建；若采用整板的预混Mix，则完成速度更快；3、有效避免交叉污染：仪器运行时完全封闭，避免环境污染；采用带滤芯的tip，避免移液头污染；UV灯灭菌，避免批间污染。且PCR体系构建速度较快能减少模板中DNA的挥发，减少系统内核酸气溶胶的浓度大幅减少假阳性的发生概率；4、提供可放置入于生物安全柜中的型号，避免各类污染，保护实验人员安全。核酸检测结果是否可信，并不能一概而论，如果检测仪器、试剂盒都没有问题，且每个实验环节都控制的很好，那么结果就非常可信，反之则无法判断。让我们齐心协力，用我们自己的专业知识来共同对抗疫情。

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center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/535b780e-209f-499c-8eac-4b2660e45d03.jpg" title="1.png" style="width: 400px height: 244px " width="400" vspace="0" hspace="0" height="244" border="0"//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/66d725c7-b535-4688-a237-f7d2519803e6.jpg" title="2.png" style="width: 400px height: 267px " width="400" vspace="0" hspace="0" height="267" border="0"//pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"油气管道缺陷漏磁成像检测仪是由strong清华大学黄松岭教授科研团队/strong结合多年的管道电磁无损检测理论研究与工程经验，设计并研发的可strong针对不同口径/strong油气管道进行缺陷检测的系列化产品。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"油气管道缺陷漏磁成像检测仪采用本项目开发的先进的strong复合伸缩式柔性采集技术/strong，能够保证检测仪在强烈振动、管道局部变形等情况下与管道全方位有效贴合，在越障、管道缩径、过弯等特殊工况下表现出优异性能，并通过strong分布式磁路结构/strong优化和strong并行数字采集/strong单元实现了检测仪的轻型化、智能化。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"相比于国内外同类检测仪器，本项目油气管道缺陷漏磁成像检测仪在诸多关键技术指标上具有明显优势，检测仪能适应的管道strong最小转弯半径为1.5D/strong（D为管道外径），strong管道变形通过能力为18%D/strong，strong缺陷检测灵敏度为5%t/strong（t为壁厚），性能指标处于国际领先水平。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"检测仪还配套开发了strong数据自动分析智能专家系统/strong，能够对对管道缺陷及附属特征进行strong自动识别、量化、成像与评估/strong，支持先验判断和人工辅助分析，并基于管道压力评估和金属损失评估，提供在役管道评估维修策略。缺陷strong长度量化误差小于8mm、宽度量化误差小于20mm、深度量化误差小于10%t/strong。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"基于本项目的关键技术，已strong授权国内外发明专利112项/strong， 形成了完整的自主知识产权体系。开发的系列化油气管道缺陷漏磁成像检测仪已应用于西气东输、胜利油田、加拿大西部油气管道等国内外检测工程中，积累了丰富的仪器研发和工程检测经验，项目技术还可推广应用于铁路、钢铁、汽车、核能、航天等领域。/span/p/td/trtr style=" height:75px"td colspan="4" style="border-color: currentcolor windowtext windowtext border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 0px 7px " width="633" height="75"p style="line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family: 宋体"应用前景：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"油气管道缺陷漏磁成像检测仪适用于电磁无损检测领域，主要应用在石油和天然气输送管道的在线缺陷检测工程中，可及时发现油气管道的腐蚀缺陷以便采取积极措施进行修复，保障油气管道的正常运行、油气资源的安全输送。且本项目的关键技术成果还可推广应用于铁路、钢铁、汽车、核能、航天等领域的铁磁性构件的缺陷检测，如动车空心轴、金属管棒材、活塞杆、核电换热管、航空复合管等，对诸多行业的设备结构健康安全检测有积极的推动作用。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"经贸委于2000年发布《石油天然气管道安全监督与管理暂行规定》，要求“新建管道必须在一年内检测，以后视管道安全状况每一至三年检测一次”，相比于国外工程检测，本项目工程检测费用仅为国外检测费用的三分之一，具有较强的竞争优势。且本项目开发的系列油气管道缺陷漏磁成像检测仪已在西气东输、胜利油田、加拿大西部油气管道等众多油气管道检测工程中应用，积累了丰富的工程检测经验，缺陷识别准确率高、用户反馈良好。近年来，在“一带一路”战略框架下，我国将进一步加大与周边国家在油气领域的战略合作，这对油气安全输送与管道缺陷检测提出了更高的要求，且随着越来越多的油气管道投入运行和在役管道使用年限的增长，以及本项目开发的系列油气管道缺陷漏磁成像检测仪在检测性能、价格等方面的诸多优势，将拥有更多的工程检测需求和更广阔的市场应用前景。/span/p/td/trtr style=" height:72px"td colspan="4" style="border-color: currentcolor windowtext windowtext border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 0px 7px " width="633" height="72"p style="line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family: 宋体"知识产权及项目获奖情况：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"研发的油气管道缺陷漏磁成像检测仪具有自主知识产权，围绕油气管道检测理论研究及仪器研发核心关键技术，申请并授权了国内外发明专利112项，开展的相关项目获得多项省部级及行业奖项。/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"知识产权情况：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"中国发明专利：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"海底油气管道缺陷高精度内检测装置，ZL201310598517.0/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"一种全数字化高精度三维漏磁信号采集装置，ZL201310460761.0/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"油气管道缺陷内检测器里程测量装置，ZL201310598590.8/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"管道三维漏磁成像检测浮动磁化组件，ZL201410281568.5/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"浮动式管道内漏磁检测装置的手指探头单元，ZL201310598515.1/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"三维漏磁检测缺陷复合反演成像方法，ZL201510239162.5/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"管道三维漏磁成像缺陷量化方法，ZL201410799732.1/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"基于交直流复合磁化的漏磁检测内外壁缺陷的识别方法，ZL200810055891.5/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"基于三维有限元神经网络的缺陷识别和量化评价方法，ZL200610164923.6/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"管道腐蚀缺陷类型识别方法，ZL200410068973.5等/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"美国发明专利：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"IMAGING METHOD AND APPARATUS BASED ON MAGNETIC FULX LEAKAGE TESTING, US2016-0161448/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"AN INNER DETECTING DEVICE FOR SUBSEA OIL AND GAS PIPELINE/spanspan style=" line-height: 150% font-family:宋体"，US2015-0346154/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"METHOD AND APPARATUS FOR QUANTIFYING PIPELINE DEFECT BASED ON MAGNETIC FLUX LEAKAGE TESTING, US2016-0178580/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"等/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"英国发明专利：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"An inner detecting device for subsea oil gas pipeline, GB2527696/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"日本发明专利：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"海中の石油ガスパイプライン用の内部検出装置，JP6154911 /span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"加拿大发明专利：/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"AN INNER DETECTING DEVICE FOR SUBSEA OIL AND GAS PIPELINE/spanspan style=" line-height: 150% font-family:宋体"，CA2,888,756/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"strongspan style=" line-height:150% font-family:宋体"项目获奖情况：/span/strong/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"2017/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"年湖北省技术发明一等奖/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"2014/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"年北京市科学技术奖一等奖/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"2014/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"年国家知识产权局中国专利优秀奖/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"2013/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"年中国产学研创新成果奖/span/pp style="text-indent:28px line-height:150%"span style=" line-height:150% font-family:宋体"2009/spanspan style=" line-height:150% font-family:宋体"年石油和化工自动化行业科学技术一等奖/span/p/td/tr/tbody/tablepbr//p

摘要晶圆表面缺陷检测在半导体制造中对控制产品质量起着重要作用，已成为计算机视觉领域的研究热点。然而，现有综述文献中对晶圆缺陷检测方法的归纳和总结不够透彻，缺乏对各种技术优缺点的客观分析和评价，不利于该研究领域的发展。本文系统分析了近年来国内外学者在晶圆表面缺陷检测领域的研究进展。首先，介绍了晶圆表面缺陷模式的分类及其成因。根据特征提取方法的不同，目前主流的方法分为三类：基于图像信号处理的方法、基于机器学习的方法和基于深度学习的方法。此外，还简要介绍了代表性算法的核心思想。然后，对每种方法的创新性进行了比较分析，并讨论了它们的局限性。最后，总结了当前晶圆表面缺陷检测任务中存在的问题和挑战，以及该领域未来的研究趋势以及新的研究思路。1.引言硅晶圆用于制造半导体芯片。所需的图案是通过光刻等工艺在晶圆上形成的，是半导体芯片制造过程中非常重要的载体。在制造过程中，由于环境和工艺参数等因素的影响，晶圆表面会产生缺陷，从而影响晶圆生产的良率。晶圆表面缺陷的准确检测，可以加速制造过程中异常故障的识别以及制造工艺的调整，提高生产效率，降低废品率。晶圆表面缺陷的早期检测往往由经验丰富的检测人员手动进行，存在效率低、精度差、成本高、主观性强等问题，不足以满足现代工业化产品的要求。目前，基于机器视觉的缺陷检测方法[1]在晶圆检测领域已经取代了人工检测。传统的基于机器视觉的缺陷检测方法往往采用手动特征提取，效率低下。基于计算机视觉的检测方法[2]的出现，特别是卷积神经网络等神经网络的出现，解决了数据预处理、特征表示和提取以及模型学习策略的局限性。神经网络以其高效率、高精度、低成本、客观性强等特点，迅速发展，在半导体晶圆表面缺陷检测领域得到广泛应用。近年来，随着智能终端和无线通信设施等电子集成电路的发展，以及摩尔定律的推广，在全球对芯片的需求增加的同时，光刻工艺的精度也有所提高。随着技术的进步，工艺精度已达到10纳米以下[5]。因此，对每个工艺步骤的良率提出了更高的要求，对晶圆制造中的缺陷检测技术提出了更大的挑战。本文主要总结了晶圆表面缺陷检测算法的相关研究，包括传统的图像处理、机器学习和深度学习。根据算法的特点，对相关文献进行了总结和整理，对晶圆缺陷检测领域面临的问题和挑战进行了展望和未来发展。本文旨在帮助快速了解晶圆表面缺陷检测领域的相关方法和技能。2. 晶圆表面缺陷模式在实际生产中，晶圆上的缺陷种类繁多，形状不均匀，增加了晶圆缺陷检测的难度。在晶圆缺陷的类型中，无图案晶圆缺陷和图案化晶圆缺陷是晶圆缺陷的两种主要形式。这两类缺陷是芯片故障的主要原因。无图案晶圆缺陷多发生在晶圆生产的预光刻阶段，即由机器故障引起的晶圆缺陷。划痕缺陷如图1a所示，颗粒污染缺陷如图1b所示。图案化晶圆缺陷多见于晶圆生产的中间工序。曝光时间、显影时间和烘烤后时间不当会导致光刻线条出现缺陷。螺旋激励线圈和叉形电极的微纳制造过程中晶圆表面产生的缺陷如图2所示。开路缺陷如图2 a所示，短路缺陷如图2 b所示，线路污染缺陷如图2 c所示，咬合缺陷如图2d所示。图1.（a）无图案晶圆的划痕缺陷；（b）无图案晶圆中的颗粒污染。图2.（a）开路缺陷，（b）短路缺陷，（c）线路污染，以及（d）图案化晶圆缺陷图中的咬合缺陷。由于上述晶圆缺陷的存在，在对晶圆上所有芯片进行功能完整性测试时，可能会发生芯片故障。芯片工程师用不同的颜色标记测试结果，以区分芯片的位置。在不同操作过程的影响下，晶圆上会产生相应的特定空间图案。晶圆图像数据，即晶圆图，由此生成。正如Hansen等在1997年指出的那样，缺陷芯片通常具有聚集现象或表现出一些系统模式，而这种缺陷模式通常包含有关工艺条件的必要信息。晶圆图不仅可以反映芯片的完整性，还可以准确描述缺陷数据对应的空间位置信息。晶圆图可能在整个晶圆上表现出空间依赖性，芯片工程师通常可以追踪缺陷的原因并根据缺陷类型解决问题。Mirza等将晶圆图缺陷模式分为一般类型和局部类型，即全局随机缺陷和局部缺陷。晶圆图缺陷模式图如图3所示，局部缺陷如图3 a所示，全局随机缺陷如图3b所示。全局随机缺陷是由不确定因素产生的，不确定因素是没有特定聚类现象的不可控因素，例如环境中的灰尘颗粒。只有通过长期的渐进式改进或昂贵的设备大修计划，才能减少全局随机缺陷。局部缺陷是系统固有的，在晶圆生产过程中受到可控因素的影响，如工艺参数、设备问题和操作不当。它们反复出现在晶圆上，并表现出一定程度的聚集。识别和分类局部缺陷，定位设备异常和不适当的工艺参数，对提高晶圆生产良率起着至关重要的作用。图3.（a）局部缺陷模式（b）全局缺陷模式。对于面积大、特征尺寸小、密度低、集成度低的晶圆图案，可以用电子显微镜观察光刻路径，并可直接进行痕量检测。随着芯片电路集成度的显著提高，进行芯片级检测变得越来越困难。这是因为随着集成度的提高，芯片上的元件变得更小、更复杂、更密集，从而导致更多的潜在缺陷。这些缺陷很难通过常规的检测方法进行检测和修复，需要更复杂、更先进的检测技术和工具。晶圆图研究是晶圆缺陷检测的热点。天津大学刘凤珍研究了光刻设备异常引起的晶圆图缺陷。针对晶圆实际生产过程中的缺陷，我们通过设备实验对光刻胶、晶圆粉尘颗粒、晶圆环、划痕、球形、线性等缺陷进行了深入研究，旨在找到缺陷原因，提高生产率。为了确定晶圆模式失效的原因，吴明菊等人从实际制造中收集了811,457张真实晶圆图，创建了WM-811K晶圆图数据集，这是目前应用最广泛的晶圆图。半导体领域专家为该数据集中大约 20% 的晶圆图谱注释了八种缺陷模式类型。八种类型的晶圆图缺陷模式如图4所示。本综述中引用的大多数文章都基于该数据集进行了测试。图4.八种类型的晶圆映射缺陷模式类型：（a）中心、（b）甜甜圈、（c）边缘位置、（d）边缘环、（e）局部、（f）接近满、（g）随机和（h）划痕。3. 基于图像信号处理的晶圆表面缺陷检测图像信号处理是将图像信号转换为数字信号，再通过计算机技术进行处理，实现图像变换、增强和检测。晶圆检测领域常用的有小波变换（WT）、空间滤波（spatial filtering）和模板匹配（template matching）。本节主要介绍这三种算法在晶圆表面缺陷检测中的应用。图像处理算法的比较如表1所示。表 1.图像处理算法的比较。模型算法创新局限小波变换 图像可以分解为多种分辨率，并呈现为具有不同空间频率的局部子图像。防谷物。阈值的选择依赖性很强，适应性差。空间滤波基于空间卷积，去除高频噪声，进行边缘增强。性能取决于阈值参数。模板匹配模板匹配算法抗噪能力强，计算速度快。对特征对象大小敏感。3.1. 小波变换小波变换（WT）是一种信号时频分析和处理技术。首先，通过滤波器将图像信号分解为不同的频率子带，进行小波分解 然后，通过计算小波系数的平均值、标准差或其他统计度量，分析每个系数以检测任何异常或缺陷。异常或缺陷可能表现为小波系数的突然变化或异常值。根据分析结果，使用预定义的阈值来确定信号中的缺陷和异常，并通过识别缺陷所在的时间和频率子带来确定缺陷的位置。小波分解原理图如图5所示，其中L表示低频信息，H表示高频信息。每次对图像进行分解时，图像都会分解为四个频段：LL、LH、HL 和 HH。下层分解重复上层LL带上的分解。小波变换在晶圆缺陷特征的边界处理和多尺度边缘检测中具有良好的性能。图5.小波分解示意图。Yeh等提出了一种基于二维小波变换（2DWT）的方法，该方法通过修正小波变换模量（WTMS）计算尺度系数之间的比值，用于晶圆缺陷像素的定位。通过选择合适的小波基和支撑长度，可以使用少量测试数据实现晶圆缺陷的准确检测。图像预处理阶段耗费大量时间，严重影响检测速度。Wen-Ren Yang等提出了一种基于短时离散小波变换的晶圆微裂纹在线检测系统。无需对晶圆图像进行预处理。通过向晶圆表面发射连续脉冲激光束，通过空间探针阵列采集反射信号，并通过离散小波变换进行分析，以确定微裂纹的反射特性。在加工的情况下，也可以对微裂纹有更好的检测效果。多晶太阳能硅片表面存在大量随机晶片颗粒，导致晶圆传感图像纹理不均匀。针对这一问题，Kim Y等提出了一种基于小波变换的表面检测方法，用于检测太阳能硅片缺陷。为了更好地区分缺陷边缘和晶粒边缘，使用两个连续分解层次的小波细节子图的能量差作为权重，以增强每个分解层次中提出的判别特征。实验结果表明，该方法对指纹和污渍有较好的检测效果，但对边缘锋利的严重微裂纹缺陷无效，不能适用于所有缺陷。3.2. 空间过滤空间滤波是一种成熟的图像增强技术，它是通过直接对灰度值施加空间卷积来实现的。图像处理中的主要作用是图像去噪，分为平滑滤镜和锐化滤镜，广泛应用于缺陷检测领域。图6显示了图像中中值滤波器和均值滤波器在增加噪声后的去噪效果。图6.滤波去噪效果图：（a）原始图像，（b）中值滤波去噪，（c）均值滤光片去噪。Ohshige等提出了一种基于空间频率滤波技术的表面缺陷检测系统。该方法可以有效地检测晶圆上的亚微米缺陷或异物颗粒。晶圆制造中随机缺陷的影响。C.H. Wang提出了一种基于空间滤波、熵模糊c均值和谱聚类的晶圆缺陷检测方法，该方法利用空间滤波对缺陷区域进行去噪和提取，通过熵模糊c均值和谱聚类获得缺陷区域。结合均值和谱聚类的混合算法用于缺陷分类。它解决了传统统计方法无法提取具有有意义的分类的缺陷模式的问题。针对晶圆中的成簇缺陷，Chen SH等开发了一种基于中值滤波和聚类方法的软件工具，所提算法有效地检测了缺陷成簇。通常，空间过滤器的性能与参数高度相关，并且通常很难选择其值。3.3. 模板匹配模板匹配检测是通过计算模板图像与被测图像之间的相似度来实现的，以检测被测图像与模板图像之间的差异区域。Han H等从晶圆图像本身获取的模板混入晶圆制造工艺的设计布局方案中，利用物理空间与像素空间的映射，设计了一种结合现有圆模板匹配检测新方法的晶圆图像检测技术。刘希峰结合SURF图像配准算法，实现了测试晶圆与标准晶圆图案的空间定位匹配。测试图像与标准图像之间的特征点匹配结果如图7所示。将模式识别的轮廓提取技术应用于晶圆缺陷检测。Khalaj等提出了一种新技术，该技术使用高分辨率光谱估计算法提取晶圆缺陷特征并将其与实际图像进行比较，以检测周期性2D信号或图像中不规则和缺陷的位置。图7.测试图像与标准图像之间的特征点匹配结果。下接：晶圆表面缺陷检测方法综述【下】

6月18日下午，2020中关村国际前沿科技创新大赛病毒检测技术专场决赛“云”上PK，新羿生物带来的基于数字PCR的新型冠状病毒核酸检测产品，为清华大学成果转化项目，该产品的特点是可实现核酸单分子级检测且不依赖于标准曲线的定量。新羿生物所自主研发的微液滴数字PCR技术，不仅可用于新型冠状病毒核酸检测，更是可在感染、肿瘤和出生缺陷领域广泛应用的下一代分子诊断新平台。该项目凭借其技术上明显优势得到评委的高度认可和好评，成功登顶TOP10榜首。新羿生物新冠解决方案新羿生物新冠病毒数字PCR检测产品，除了可用于新冠筛查外，有望在抗疫中可发挥如下独特作用：有接触史的无症状感染者排查；疑似患者复核，可用于荧光PCR检测可疑样本判定；新冠病毒感染患者治疗评估，观察病毒载量动态变化；新冠药物评价；新冠患者病毒转阴复核，用于指导出院。新羿TD-1数字PCR系统新冠病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒新羿生物新冠解决方案特点灵敏度高：检测下限3copies/反应；定量准确：无需标准品和标准曲线；通量较高：一次PCR可以完成96样本；操作简便：一步上样，操作简单；封闭检测：全封闭体系检测，可防止气溶胶污染，预防假阳性；特异性好：与其他常见呼吸道病原体（病毒、细菌、真菌）无交叉反应。新羿生物抗疫之路2020年初，新冠疫情发生后，新羿生物及时联合清华大学生物医学工程系等单位协同开展科技攻关，在新羿数字PCR系统的基础上开发了新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（数字PCR法）。春节也坚持做攻关研发，每个新羿人都要为新冠抗疫贡献自己的力量。近日的北京疫情风险升高，新冠战斗警报再次拉响。新冠病毒的核酸检测是确诊过程中的重要环节，新羿人会加快科技攻关，为打赢疫情防控阻击战提供强大科技支撑。新羿新冠产品经多家疫情防控重点医院和重点实验室使用，产品的技术优势得到了多方专业机构的认可，并已获欧盟CE市场准入资质。

p style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="text-indent: 2em font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "文章译自浙江大学蔡圣老师团队发表于Journal of Pharmaceutical Analysis（JPA）期刊的一篇综述。原标题为：《Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus》/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 500px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/b00ed559-de44-4762-9e48-494779d5be71.jpg" title="新冠病毒.jpeg" alt="新冠病毒.jpeg" width="500" height="500" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的肺炎暴发对全球公共卫生构成了巨大威胁。因此建立快速的标准诊断测试以检测传染病（COVID-19），防止继发性传播尤为重要。聚合酶链反应（PCR）被视为具有高灵敏度和特异性的病毒和细菌感染分子诊断的金标准。等温核酸扩增因为其在恒温条件下无需热循环仪即可快速操作的基本优势，被认为是一种非常有前途的候选方法。这篇综述总结了目前可用于冠状病毒核酸的检测方法，有助于研究人员和临床医生开发更好的技术，以及时有效地检测冠状病毒感染。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong1 基于PCR的方法/strong/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "PCR是一种酶学方法，可通过分离包含基因片段的两条DNA链，用引物标记其位置，并使用DNA聚合酶在每个片段旁边组装一个拷贝并连续复制这些拷贝来产生基因的多个拷贝，该技术被广泛用于扩增微量生物材料。由于它的高灵敏度和高序列特异性，基于PCR的方法已成为用于检测冠状病毒常规和可靠的技术。通常操作是，通过逆转录将冠状病毒RNA转移到cDNA中，然后，进行PCR扩增，最后通过特定的检测方法或仪器检测PCR产物。在这些中，凝胶可视化和测序是PCR技术之后用于检测冠状病毒方法，然而，由于其过程耗时且成本较高，这些方法在临床样品中并不常用。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong实时逆转录PCR（RT-PCR）技术/strong目前被冠状病毒检测所青睐，因为它具有特异性强，简便进行定量分析的优势。此外，在早期，实时RT-PCR比常规RT-PCR测定法能够诊断出更多感染者。因此，实时RT-PCR测定法仍然是一个主要的方法被应用于检测各种冠状病毒的检测。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "尽管RT-PCR已经在本次战“疫”中大显身手，但科学界依然投入大量精力来改进实时RT-PCR技术。因为RT-PCR方法容易受到污染，并且样品处理和PCR后数据分析耗时。因此，van Elden等描述了基于TaqMan的实时RT-PCR，可以在常规诊断设置中轻松实现HCoV的检测。此外，为了进一步提高灵敏度，Yip等人使用2个TaqMan探针代替1个探针设计了SARS-CoV的实时定量RT-PCR分析。使用双TaqMan探针进行定量的这种简单修饰方法在需要超敏性的领域具有广泛的应用，SARS-CoV检测限为每个反应1个拷贝RNA。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "在临床检测中，缺乏安全和稳定的外部阳性对照（EPC）可能成为冠状病毒诊断中的严重问题，该问题已引起了广泛关注。Yu等开发了一种实时RT-PCR分析，其中装甲RNA被用作EPC来检测SARS-CoV，检测极限为10拷贝/μL。同时，冠状病毒的快速突变性质凸显了对准确检测遗传多样性冠状病毒的需求。因此，为了提高精确检测冠状病毒的能力并降低由基因组序列变异引起的假阴性结果的风险，研究人员建立了多重实时RT-PCR方法，对冠状病毒的多靶点检测具有良好的敏感性。Hadjinicolaou等使用耐错配的分子信标开发了实时RT-PCR测定法，以区分致病菌株和非致病菌株。该测定法包含四个信标，除了内部阳性对照外，还靶向四个基因。它已使用临床样品进行了验证，该样品具有目标检测能力和特异性，每个反应的检测极限为5个拷贝。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong2 基于核酸等温扩增的方法/strong/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong2.1 基于常规的LAMP方法/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "LAMP是高效的新型等温核酸扩增方法。它通常用于DNA和RNA的扩增，由于其指数扩增特性，且分别由4种不同的引物同时鉴定的6个不同的靶序列而显示出很高的灵敏度和高特异性。另一方面，LAMP技术测定快速且不需要昂贵的试剂或仪器，因此，LAMP检测的应用可能有助于降低检测冠状病毒的成本。目前，很多企业已经开发了基于LAMP的冠状病毒检测方法并将其应用于临床诊断。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "凝胶电泳通常用于分析扩增产物以进行终点检测。潘等人报告了一种用于SARS诊断的简单LAMP检测方法，并证明了使用该技术检测SARS-CoV的可行性。选择SARS-CoV的ORF1b区域用于SARS诊断，并在6个引物的存在下通过LAMP反应进行扩增，然后通过凝胶电泳对扩增产物进行分析。LAMP分析中SARS-CoV的检测率和灵敏度与常规基于PCR的方法相似。Pyrc等成功地将LAMP用于琼脂糖凝胶电泳检测HCoV-NL63，在细胞培养物和临床标本中具有良好的灵敏度和特异性。值得注意的是，检测极限是每个反应1个RNA拷贝。可以检测到焦磷酸镁或荧光染料的沉淀。通过监测焦磷酸盐或荧光的浊度，可以使该方法实时进行，从而有效地解决了终点检测的局限性。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "Shirato等人以这种方式开发了一种有用的RT-LAMP测定法，用于诊断和监测人类MERS-CoV的流行病学。该技术能够检测到3.4份MERS-CoV RNA，并且具有高度特异性，与其他呼吸道病毒无交叉反应。Thai等开发了一种单步单管加速实时定量RT-LAMP测定法，该测定法通过在光度计中实时测量浊度进行监控，以早期和快速诊断SARS-CoV。在临床样品中，发现该检测方法的灵敏度比常规RT-PCR高100倍，检出限为0.01个噬菌斑形成单位（PFU）。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong2.2 基于特定序列的LAMP方法/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "然而，如果这些方法依赖于非特异性信号转导方案，例如荧光染料插入任何双链DNA扩增子中，或者由于聚合过程中焦磷酸盐的释放而导致溶液浑浊，则不能排除由引物二聚体或非引物反应产生的意外信号的可能性。一种用于监视LAMP和其他等温扩增反应的序列特定且可靠的方法，可以轻松地将真实信号与非特异性噪声区分开来，解决此问题。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "Shirato等通过使用淬灭探针（QProbe）监测信号改进了RT-LAMP测定，在检测MERS-CoV方面与标准实时RT-PCR测定具有相同的性能。此外，黄等建立了一种将RT-LAMP和垂直流可视化条带（RT-LAMP-VF）结合使用检测MERS-CoV的核酸可视化技术。如图1A 所示，等温扩增中涉及的两个环引物（LF和LB）分别用异硫氰酸荧光素（FITC）和生物素标记。扩增后，用生物素标记的扩增子可以结合与链霉亲和素缀合的胶体金颗粒，形成复合物，随后被包被在条带文本行上的抗FITC抗体捕获（图1 B），从而呈现出肉眼可见的彩色线。在这种情况下，MERS-CoV RNA的检出限为10拷贝/μL。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/597f993e-e365-41f1-9251-841a8a4e351f.jpg" title="图片1.jpg" alt="图片1.jpg"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "图1. RT-LAMP-VF分析的示意图。（A）用于RT-LAMP的扩增反应和（B）在可视化条上检测。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "埃灵顿小组的科学家做了很多工作，既可以提高LAMP检测的特异性，又可以使读数更简单、更可靠。他们用称为单步链置换（OSD）的介导链交换反应代替了通常用于实时荧光监测的嵌入染料，并将其用于LAMP扩增子的实时序列特异性验证。所得检测结果可在30-50分钟内检测出感染细胞培养上清液中的0.02-0.2 PFU（5-50 PFU / mL）的MERS-CoV，并且不会与常见的人类呼吸道病原体发生交叉反应还开发了其他链交换信号转导，以使LAMP反应易于使用。如图2所示，Du等通过将LAMP与热稳定的转化酶结合，可以直接将MERS冠状病毒模板转导为葡萄糖信号，通过商业血糖仪轻松读取信号，可检测20–100拷贝/μL。人绒毛膜促性腺激素（hCG）也被用作信号进行分析。hCG与DNA寡核苷酸位点特异性结合，从而在基于LAMP的病毒测定中允许通过链交换将信号转导到hCG的捕获（信号关闭）和释放（信号打开）中。当人血清和唾液中仅有20拷贝病毒模板时，通过该方法也能准确检测到。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 371px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/64543db7-a0cb-4e3a-88f7-88658e4822d5.jpg" title="图片2.png" alt="图片2.png" width="600" height="371" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center "图2 使等温扩增适应血糖仪的方案。 /pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "同时，LAMP在65° C左右显示最佳性能，这限制了其应用。蔡等开发了一种LAMP版本，该版本使用了硫代磷酸酯化引物（PS-LAMP），能够在生长辅酶的末端更有效地形成和延伸发夹，从而在较低的温度下工作。研究表明，在40° C下用PS-LAMP检测扩增子的灵敏度和选择性与65° C下的常规LAMP反应相当。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strong2.3 基于滚环扩增放大的方法/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "滚环扩增（RCA）在核酸检测中已经获得了相当大的关注。在等温条件下，RCA能够在90分钟内将每个圆的信号放大10sup9/sup倍。有学者在液相和固相中都建立了通过RCA检测SARS-CoV的有效方法，并在少量临床呼吸道标本上提供了初步结果。RCA的主要优点是，它可以在恒温条件下用最少的试剂进行操作，并且避免了假阳性结果的产生，而这在基于PCR的测定中经常遇到。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "3 基于微阵列的方法/span/strong/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "微阵列法是一种快速且高通量的检测方法。在这种方法中，冠状病毒RNA将首先通过逆转录产生用特定探针标记的cDNA。然后将这些标记的cDNA加载到每个孔中，并与固定在微阵列上的固相寡核苷酸杂交，然后进行一系列洗涤步骤以去除游离DNA。最后，可以通过检测特定探针来检测冠状病毒RNA。由于其快速、高通量的优越性，微阵列分析已广泛用于冠状病毒的检测。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "Shi等根据TOR2的序列设计了一个60 mer的寡核苷酸微阵列，并将其成功地用于临床样品中SARS冠状病毒的检测。但是，考虑到SARS-CoV的快速突变，Guo等开发了一种微阵列，可在样本检测中以100％的准确度检测SARS-CoV的尖峰（S）基因中的24个单核苷酸多态性（SNP）突变。Luna等设计了一种无荧光的低成本，低密度寡核苷酸阵列，用于检测整个冠状病毒属，其灵敏度与各个实时RT-PCR的灵敏度相同，Hardick等（2002）评估了一种基于微阵列芯片的新型，便携式和近POC诊断平台，即移动分析平台（MAP），它在识别病毒和可接受的检测限方面具有良好的性能。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong4 新开发的方法/strong/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "相关酶的Cas13 RNA靶向CRISPR最近已适于核酸[快速和便携式传感。Zhang的研究小组证明，Cas13可以被编程为靶向并破坏多种哺乳动物单链RNA病毒的基因组（图3）。他们开发了一个名为SHERLOCK（特定的高灵敏度酶报告分子解锁）的平台，该平台将等温预扩增与Cas13结合使用，以检测RNA或DNA的单分子。它可以检测登革热或Zika病毒单链RNA以及患者液体活检样品中的突变。网站（https://broad.io/sherlockprotocol）上报道了他们最近关于COVID-19的协议，题为“使用CRISPR诊断程序检测COVID-19的协议”，该协议可能为有兴趣进一步研究的研究人员提供一些参考点该诊断系统突出了其作为核酸的可复用，便携式，快速和定量检测平台的潜力。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/e3b9db04-4081-4ff5-8097-1f37685d19e8.jpg" title="图片3.png" alt="图片3.png"//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-align: center "图3 使用Cas13检测RNA病毒的方案。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong总结与展望/strong/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "当前，COVID-19的诊断主要依赖于冠状病毒RNA的检测。选择适当的检测方法非常重要。但是，上述每种方法都有其独特的优点和不可避免的缺点。PCR以高灵敏度和特异性广泛用于病毒鉴定，但其分析需要各种专业设备和受过专业培训的分析人员，而这只能由完善的实验室来完成。LAMP是一种超灵敏的核酸扩增方法，通常可以在大约一个小时内检测少量的DNA或RNA模板，但是高温的要求仍然限制了其适用性。至于微阵列，高成本不可避免地限制了它在冠状病毒检测中的进一步应用。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "迄今为止，科学家们已经做出了很大的努力来改善冠状病毒的检测，并且已经开发了各种改进的或新的方法。在实际应用中，通常将几种方法结合起来，以尽量避免使用单一方法的弊端。简而言之，随着新技术和方法的飞速发展，我们相信未来将开发出更加出色和高效的检测方法，这将为科学家/临床医生提供更多选择。同时，只有根据特定目的平衡各种检测方法的优缺点，才能获得最经济，最优化的选择。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "作者蔡圣/span/strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "：现任浙江大学药学院副教授，硕士生导师。主要从事药物分析新方法新技术研究，包括功能纳米材料、核酸适配体技术在蛋白及药物检测中的应用；核酸扩增方法在药物和药物效应分子检测和成像中的应用。/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em "strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "关于JPA/span/strongspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "：JPA于2011年创刊，是一本药物分析研究领域的英文专业期刊，由教育部主管、西安交通大学主办，与Elsevier合作出版，西安交通大学药物分析研究所贺浪冲教授担任主编。/span/p

2020年注定是不平凡的一年，而在每个平凡工作岗位上的我们，总希望能在这个特殊的时期做点什么，哪怕微小的贡献，汇集在一起，一定会成为改变的推动力。所以，小编梳理了一下在抗病毒药物、疫苗研发生产等相关领域的工作中，我们的微孔板检测及成像设备能够开展的实验和项目，希望能够对在攻坚岗位上奋斗的老师们有所帮助。病毒，可以是恶魔，也可以是工具我们都知道，病毒（virus)由一种核酸分子（dna或rna）与蛋白质（protein）构成或仅由蛋白质构成（如朊病毒）的有机形态，它介于生命与非生命之间，超然在五界之外（传统的五界分类法）。这样一种看起来无比“简单而低级”的东西，却在人类历史上留下持续至今挥之不去的阴影，比如ebola，比如hiv，比如，现在全国上下一心对抗的新冠病毒。但是，拥有高级智慧的人类，怎会轻易被这些简单而低级的玩意儿打败？所以，我们有了疫苗，有了抗病毒药物，聪明的人类还利用病毒感染宿主细胞进行自我复制的机制，把恶魔变成工具，应用到人类的生产生活中，比如通过病毒进行花卉育种，利用病毒作为载体进行生物研究、基因治疗等等。所以今天，我们首先分享一些围绕抗病毒药物研发、疫苗生产等相关领域，微孔板检测和成像设备的应用方向，后续我们会为大家继续分享微孔板相关设备在如何“利用”病毒开展生物研究工作。病毒的数量与感染性测定病毒感染哺乳动物细胞后，除了通过rt-pcr的方法，可以通过细胞病变效应、红细胞吸附和免疫标记检查法等评价病毒在细胞中的增殖情况。细胞病变效应（cytopathic effect, cpe），是指病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。大多数动物病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现改变，例如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等，正是因为cpe的表现，我们可以在体外细胞水平评价病毒感染宿主细胞的情况。病毒毒价测定是病毒学相关研究中最基本的技术手段，无论疫苗研发、抗病毒药物评估或者是病毒重组载体构建，均需要在不同环节评定病毒毒价，而目前主要方法包括蚀斑实验、tcid50测定和免疫染色法等。病毒蚀斑实验病毒蚀斑是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。方法：将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,pfu)。通常以每毫升病毒液的空斑形成单位既 pfu/ml表示。上图来自武汉大学基础医学院，病毒感染6孔板细胞后形成空斑病灶，使用中性红染色后，通过cytation的4x物镜明场模式对全孔进行拼接成像，软件分析识别孔中的空斑病灶个数。tcid50法tcid50法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。方法：一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察cpe、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法（reed muench法）计算出50%组织细胞感染量（ 50%tissue culture infectious dose,tcid50)。免疫染色法空斑实验法或常规tcid50测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or ifu/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法（pfu/ml）更短。其中，免疫染色法包括hrp组化或免疫荧光染色等。同样类型方法也适用于表达荧光报告基因的重组病毒的毒价测定。例如，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以hrp-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数的换算，即可得出病毒的滴度（ifu/ml）。输问题：无论是plaque assays还是tcid50，均涉及较多微孔的细胞计数或阴/阳性孔判断，常规的显微镜观测法，操作不便且对研究者伤害较大。因此biotek为大家提供了更加自动化的解决方法：通过cytation/lionheartfx自动化成像设备进行cpe或者plaque的成像及计数。上图：cytation5自动化成像系统支持明场、彩色明场、荧光场等模式自动化成像检测，并且可选择大视野成像模式，4倍镜一个视野可覆盖384孔板整孔，提高全孔、整板成像的检测速度。上图：两种病毒感染细胞后，通过红色/绿色荧光探针标记的抗体进行免疫荧光染色，采用cytation双荧光通道自动成像，并对病毒感染的细胞病灶进行识别成像。上图：对24孔板进行自动成像，并且定量分析每孔内的病灶个数。无论是cytation系列还是lionheart系列，均能对6-384孔板进行多通道整孔成像，极大减少了人工识别cpe及plaque的工作。疫苗研发生产中的应用疫苗效力评价最有效的方法是中和抗体水平检测及中和抗体活力评价。普通病毒疫苗效果的评价，可以通过收集减毒或灭活病毒疫苗免疫后人或动物血清，与自然源性病毒进行中和抑制试验，以检测中和抗体效价及中和抗体活力。中和抗体的原理是抗体与相应的病毒粒子特异性结合，使病毒丧失感染细胞的能力，一般采用的是固定病毒—稀释血清法。固定病毒—稀释血清法将不同稀释度的血清与固定量的病毒（200tcid50、eid50或ld50）混合，一般37°条件下感作一定时间以后（通常为1h），再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，每一稀释度接种3～6只（个、管）试验动物(或鸡胚、细胞)，记录每组样品的动物死亡数、累积死亡数和累积存活数，按此前提到的reed-muench法或karber法计算其半数保护量（pd50），即该血清的50%中和效价(pd50)。可见，对于抗病毒疫苗中和抗体的测定方法中，最终的检测指标也可以用cpe计数、或荧光标记的病毒灶来评估，而完整的中和抗体检测需要测定大量的细胞样本，通常要对整板96孔板的整孔进行观测。这样的应用中，biotek能够建立标准化的实验方案流程，样品的拍摄、病灶的分析计数到结果的输出可以自动完成：上图：cytation对96孔板内的荧光标记的病毒灶进行全孔、整板成像。上图：通过图像分析评价不同浓度的免疫血清抑制病毒感染细胞的能力，pos表示该孔内有病毒病灶形成，neo表示改孔无病灶。根据此结果，后续可计算pd50。抗病毒药物筛选相关应用针对不同种类的病毒，科学家们的前期工作已经积累了较多的筛选策略，比如，对于目前来势汹汹的冠状病毒，在抗击sars及mers的经验中对于此类cov新药的主要靶点可以围绕cov表面结构的棘突糖蛋白、靶向宿主受体的单克隆抗体、进入途径有关的宿主蛋白酶抑制剂、以cov复制结构基因为靶点的sirnas等（zumla a, nature reviews drug discovery, 2016, 15(5): 327.。对于hiv等逆转录病毒，研发策略可倾向于受体拮抗剂、整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂这些方向；对于hcv病毒可采用rna复制酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等（nature reviews drug discovery 6, 1001-1018）。基于微孔板的高通量及高内涵筛选平台为以上策略提供了灵活的解决方案，比如下面这篇文章，可以为大家提供一些基于微孔板筛选抗病毒药物的思路，文中选择的靶点是ns3解旋酶，hcv解旋酶是一种蛋白酶，位于病毒多功能非结构蛋白3 (ns3)的c端三分之二。因此，抑制解旋酶可作为抗生素或抗病毒药物。构建hcv ns3h（ns3 lacking the protease domain），使用dna寡核苷酸序列代替rna序列，通过fp、htrf和alphascreen筛选能够抑制ns3-dna复合体形成的化合物。这是一种比较新颖的思路，采用抑制dna复合物的方法来筛选hcv解旋酶抑制剂。所用的化合物库来自sigma’s library of pharmacologically active compounds (lopac)。上图展示了基于荧光偏振的筛选思路以及得到的4个候选化合物剂量效应曲线。文章展示了使用多功能微孔板检测设备在筛选hcv抗病毒药物的有效性，并且表明其采用的这三种方法均是较为成熟的商品化方案，篇幅所限，感兴趣的老师可以在原文中阅读其他方法的筛选结果和思路。biotek为大家提供的synergyneo2是顶尖的微孔板药物筛选平台，能够快速高效的实现以上的荧光分子互作的筛选技术平台。上图：synergyneo2高通量微孔板检测仪能够提供高速、高效的trf、fp、htrf、alphascreen技术检测平台。除了采用分子互作技术针对性的开展基于靶点的筛选，也可以采用基于表型的方法，例如cpe病灶改变、细胞活力等进行快速化合物筛选，这里就不一一赘述了。病毒的临床诊断病毒临床诊断方面的应用主要集中在免疫学检测，通过测定患者血液样本中的病毒抗体或表面抗原的含量判断是否存在病毒感染。比如hbv表面抗原（hbsag）是病毒外膜的主要组成蛋白，一直是hbv感染最重要的血清学检测指标，也是最直接的病原学证据之一。目前针对hbv, hcv, hiv等多种病毒均有临床可用的商品化解决方案，除了常见的吸收光elisa测定，也有诸多试剂开发团队研发了灵敏度更高，检测更为便捷的时间分辨荧光免疫检测法，即trfia技术。输值得一提的是，当下新冠状病毒2019-ncov的临床诊断虽然主要依赖核酸检测，但是由于核酸检测的取样位置、患者的免疫状态等原因，单纯依靠荧光定量pcr的核酸检测有一定的局限性。目前，已经有试剂公司开发出针对新冠状病毒的igm和igg抗体检测elisa试剂盒，能够为临床提供血清学诊断辅助证据，可联合核酸检测方法进行使用。biotek的synergyh1多功能微孔板检测仪拥有中华人民共和国医疗器械注册证，能够为一线临床诊断岗位的医疗工作者提供精准的基于吸收光、荧光、发光、时间分辨荧光及荧光偏振的免疫检测结果。上图：synergyh1多功能微孔板检测仪，能够支持elisa、trfia、lia等多种模式的免疫检测。在这场人类和病毒旷日持久的战“疫”中，相信会有越来越多的检测手段迅速发现病毒，也会有更新的，更具针对性的药物和治疗方案也会相继出现，我们能做的，就是坚守好自己的岗位，持续为大家提供坚实的硬件和技术保障。心系武汉湖北加油!

国内多地出现感染，暂无疫苗和药物近期，人偏肺病毒备受关注。今年以来，我国与美国间人员往来已逐步恢复，存在HMPV感染者输入我国的可能。但考虑到美国当前HMPV疫情已显著降低，以及我国目前已进入夏季，气候条件不适宜疫情传播，因此可以预计美国前期HMPV高发疫情对我国影响有限。目前暂时尚无hMPV疫苗上市，部分实验性候选疫苗正处于临床前研发阶段。关于人偏肺病毒人偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV）：属于肺病毒科，偏肺病毒属，有包膜的单股负链RNA病毒。2001年，由荷兰学者首次从未知病原体引起呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物样本中检出。血清学研究表明其存在至少60年，在世界各地均有分布，是常见呼吸道病原体之一。电镜下的HMPV（中国疾控中心）2021年8月18日，中国疾病预防控制中心在《Nature communications》发表了一项历时11年的来自于全国106个城市的277家哨点医院和92个参考实验室的呼吸道传染病监测数据研究。根据监测数据显示，在引起急性呼吸道感染的8种主要呼吸道病毒中，HMPV在全年龄段的阳性率占比为4.1%，其中在儿童和老年人中的阳性率占比分别为4.8%和4.7%。中国疾控中心对2009-2019年呼吸道传染病监测数据分析表明，在引起急性呼吸道感染的8种病毒中，HMPV排名第8位，阳性率占比为4.1%，远低于流感病毒的28.5%。传播方式：HMPV主要通过咳嗽和打喷嚏产生的飞沫或气溶胶传播，与感染者密切接触和接触病毒污染的环境也可能造成传播。一般来说，感染后潜伏期约3-5天，HMPV诱发的免疫保护较弱，反复感染常见。HMPV全年均有检出，但以冬春季检出率最高。此外，HMPV感染也可以引起暴发流行。核酸检测可明确诊断hMPV感染HMPV感染诊断技术包括病毒培养、核酸检测、抗原检测和血清学抗体检测。人偏肺病毒HMPV感染诊断技术一览核酸检测RT-PCR 是目前检测 HMPV 感染最敏感、最常用的方法抗体检测病毒感染和特异性抗体出现之间存在窗口期，抗体检测不能及时反映感染情况，对于病原体的早期诊断意义不大抗原检测HMPV 抗原检测的主要方法为直接免疫荧光法，检测快速但其灵敏度远远低于 RT- PCR。病毒培养因HIPV 在病毒培养中生长缓慢且仅有轻微的细胞病变效应，故病毒培养不适用于 HMMPV 检测。国内首个人偏肺病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）达安基因6月5日在互动平台表示，公司有人偏肺病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)产品，并已获得国家药品监督管理局的颁发的医疗器械注册证。在HMPV发现的过去21年里，由于缺乏相关精准、有效的检测产品，国内对于HMPV感染的检测存在不足，很大程度上影响了HMPV的整体检出率。临床症状|如何预防？HMPV可致上、下呼吸道感染，临床表现可从轻度呼吸道症状到重症肺炎。临床表现与RSV感染相似，表现为咳嗽、喘息、发热、紫绀等，其中30%~40%患儿出现发热症状，70%~80%患儿出现喘息症状。住院患者的临床表现包括细支气管炎或哮喘加重以及重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征。与防控其他常见呼吸道病毒类似，公众应保持生活规律和良好心态，前往人员密集场所或环境最好佩戴口罩，同时做到勤洗手、勤通风、科学消毒等预防措施可有效降低感染HMPV的机会。——会议推荐——（点击下图报名）一、主办单位仪器信息网二、会议时间2023年6月28日-30日三、会议日程第七届PCR前沿技术与应用网络会议(iCPCR 2023)时间专场主题6月28日 上午新产品与新技术6月28日 下午分子诊断应用6月29日 上午药品/生物制品应用6月29日 下午农林育种应用6月30日 上午动植物疫病应用（上）6月30日 下午动植物疫病应用（下）详细日程点击查看：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icpcr2023/ 扫码直达报名页面温馨提示1) 报名后，直播前一天助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。

9月12日，2010全国妇幼保健热点论坛在广州举行。47岁的中国工程院院士程京欣然接受南方日报专访，畅谈生物芯片的研究进展与前景。他表示，针对广东“地方病”地中海贫血的基因检测芯片，预计明年面世。　　一出生就做基因芯片检测，可预防“一针致聋”　　从去年以来，程京已经自主研发了遗传性耳聋检测基因芯片、分枝杆菌菌种鉴定基因芯片、结核分枝杆菌耐药检测基因芯片、自身免疫性疾病检测蛋白芯片等4种新型疾病检测产品。目前均进入临床使用，广东省妇幼保健院等多家广东医院已可检测。　　程京举例说，中国每年新增4万个遗传性耳聋患者，其中很大部分是药物致聋。像《千手观音》中美丽的聋哑演员邰丽华，就是因为两岁时高烧注射链霉素而失去了听力。“假如邰丽华在刚刚出生时做过基因芯片检测，得知自己是药物性耳聋基因的携带者，只要在今后不使用氨基糖甙类的抗生素药物，就可以避免药物性耳聋的发生。”甚至更早一步，如果她的母亲在怀孕前做检测，确定携带药物性致聋基因，由于这个基因是通过母系遗传的，孩子肯定也会有，可以更早知道，预防“一针致聋”。　　与广东合作研制基因检测芯片，减少出生缺陷　　近年我国新生儿出生缺陷率持续攀升，广东高达2.7%。程京透露，生物芯片北京国家工程研究中心出生缺陷领域分中心将落户广东省妇幼保健院，将与广东合作研发生物芯片。　　广东是地中海贫血高发省份，约有10%—15%人群携带地贫基因。如果夫妇两人均携带地贫基因，所生孩子有1/4的几率是重型地贫患者，给家庭带来沉重负担。省妇幼保健院优生优育遗传与产前诊断中心副主任医师尹爱华透露，目前已和程京院士合作研制地贫基因检测芯片，预计在明年面世，减少新生儿出生缺陷。　　据了解，目前地贫基因的试剂盒检测程序麻烦，有20多个步骤是人工操作，容易出现误诊，而且限于技术问题县级医院无法开展。如果地贫基因芯片研制成功，就可大批量做检测，医院一天检测量可从目前的100个标本上升到上万个，而且检测费用会便宜很多。

新型冠状病毒肺炎(Coronavirusdisease2019,COVID-2019)是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）所引起的高传染性病毒疾病，对世界人口造成了灾难性影响，导致全球380多万人死亡，成为继1918年流感大流行以来影响最大的全球卫生危机。 新冠病毒不断变异的RNA病毒 作为单链结构的RNA病毒，新型冠状病毒的一大特点就是极其容易变异。随着感染人数的增加和疫情的持续，新型冠状病毒不断进化和变异，陆续产生多种新冠病毒变异株。世界卫生组织（WHO）根据新冠病毒变异株的传播力、致病力等将其分为VOCs(Variant of concern)和VOIs(Variant of interest)。新冠病毒VOCs的分类 新冠病毒VOIs的分类 目前市场对新冠病毒筛查主要采用荧光 PCR 方法，该方法检测灵敏度高，但成本也相对较高，并且单机通量小，容易被污染，制约了大规模病毒检测速度，对当前不同变异毒株区分荧光PCR方法存在一定难度。随着病毒感染多元化和疫情防控常态化的推进，市场急需一种更快速、准确、高通量的检测方法，用于满足大样本量的检测、基层的日常防控筛查，以及不同变异株的区分。 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）主要用于分析包括蛋白质及核酸在内的生物大分子，该技术应用于核酸检测具有高通量、高灵敏、高准确率的特点。其主要工作原理是结合延伸分析法和碱基特异裂解分析法，将扩增后的核酸产物通过离子源使样品离子化，产生不同质荷比的离子，再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量，按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱，并根据检测项目不同给出相应的检测报告。该技术在遗传病筛查、肿瘤变异检测、甲基化检测、用药指导、病原体检测及功能医学健康管理等多个领域的应用日益深入，已经成为精准医学不可或缺的分子诊断技术。MALDI-TOF MS检测新型冠状病毒方法为通过特定引物扩增目标基因片段，再通过靶向位点探针特异性单碱基延伸，然后通过质谱技术检测延伸位点的碱基，判断病毒种类和变异类型。该方法灵敏度高、操作简单、成本低廉、人员需求低、通量高，可实现6小时384样本出报告，以后每1小时出384份样品报告。新冠病毒流行初期，Autof ms1000系统建立了完成病毒检测检测体系，对病毒毒株进行了精准检测（图3）。随着研究深入，Autof ms1000检测核酸的体系也日渐成熟，针对当前多变异毒株情况，研究人员通过合理设计扩增引物和探针，可实现单个样品，单芯片位点检测，一次区分当前所有可认知的新冠病毒变异株。随着疫情斗争的持续进行，病毒变异也不断发生，后续可能出现更多更复杂的病毒变异株，MALDI-TOF MS技术基于其检测原理，在大样本多病毒变异株检测方面的优势将日渐突出。随着人们对该技术的认知度的日渐加深，未来该技术在核酸检测方向的应用将出现更多的思路和方法，MALDI-TOF MS在临床应用领域中将会发挥更大的作用。

上接：晶圆表面缺陷检测方法综述【上】4. 基于机器学习的晶圆表面缺陷检测机器学习主要是将一个具体的问题抽象成一个数学模型，通过数学方法求解模型，求解该问题，然后评估该模型对该问题的影响。根据训练数据的特点，分为监督学习、无监督学习和半监督学习。本文主要讨论这三种机器学习方法在晶圆表面缺陷检测中的应用。机器学习模型比较如表2所示。表 2.机器学习算法的比较。分类算法创新局限监督学习KNN系列对异常数据不敏感，准确率高。复杂度高，计算强度高。决策树-Radon应用Radon以形成新的缺陷特征。过拟合非常熟练。SVMSVM 可对多变量、多模态和不可分割的数据点进行高效分类。它对多个样本不友好，内核函数难以定位。无监督学习多层感知器聚类算法采用多层感知器增强特征提取能力。取决于激活函数的选择。DBSCAN可以根据缺陷模式特征有选择地去除异常值。样本密度不均匀或样本过大，收敛时间长，聚类效果差。SOM高维数据可以映射到低维空间，保持高维空间的结构。目标函数不容易确定。半监督学习用于增强标记的半监督框架将监督集成学习与无监督SOM相结合，构建了半监督模型。培训既费时又费时。半监督增量建模框架通过主动学习和标记样本来增强模型性能，从而提高模型性能。性能取决于标记的数据量。4.1. 监督学习监督学习是一种学习模型，它基于该模型对所需的新数据样本进行预测。监督学习是目前晶圆表面缺陷检测中广泛使用的机器学习算法，在目标检测领域具有较高的鲁棒性。Yuan，T等提出了一种基于k-最近邻（KNN）的噪声去除技术，该技术利用k-最近邻算法将全局缺陷和局部缺陷分离，提供晶圆信息中所有聚合的局部缺陷信息，通过相似聚类技术将缺陷分类为簇，并利用聚类缺陷的参数化模型识别缺陷簇的空间模式。Piao M等提出了一种基于决策树的晶圆缺陷模式识别方法。利用Radon变换提取缺陷模式特征，采用相关性分析法测度特征之间的相关性，将缺陷特征划分为特征子集，每个特征子集根据C4.5机制构建决策树。对决策树置信度求和，并选择总体置信度最高的类别。决策树在特定类别的晶圆缺陷检测中表现出更好的性能，但投影的最大值、最小值、平均值和标准差不足以代表晶圆缺陷的所有空间信息，因此边缘缺陷检测性能较差。支持向量机（SVM）在监督学习中也是缺陷检测的成熟应用。当样本不平衡时，k-最近邻算法分类效果较差，计算量大。决策树也有类似的问题，容易出现过度拟合。支持向量机在小样本和高维特征的分类中仍然具有良好的性能，并且支持向量机的计算复杂度不依赖于输入空间的维度，并且多类支持向量机对过拟合问题具有鲁棒性，因此常被用作分类器。R. Baly等使用支持向量机（SVM）分类器将1150张晶圆图像分为高良率和低良率两类，然后通过对比实验证明，相对于决策树，k-最近邻（KNN）、偏最小二乘回归（PLS回归）和广义回归神经网络（GRNN），非线性支持向量机模型优于上述四种晶圆分类方法。多类支持向量机在晶圆缺陷模式分类中具有更好的分类精度。L. Xie等提出了一种基于支持向量机算法的晶圆缺陷图案检测方案。采用线性核、高斯核和多项式核进行选择性测试，通过交叉验证选择测试误差最小的核进行下一步的支持向量机训练。支持向量机方法可以处理图像平移或旋转引起的误报问题。与神经网络相比，支持向量机不需要大量的训练样本，因此不需要花费大量时间训练数据样本进行分类。为复合或多样化数据集提供更强大的性能。4.2. 无监督学习在监督学习中，研究人员需要提前将缺陷样本类型分类为训练的先验知识。在实际工业生产中，存在大量未知缺陷，缺陷特征模糊不清，研究者难以通过经验进行判断和分类。在工艺开发的早期阶段，样品注释也受到限制。针对这些问题，无监督学习开辟了新的解决方案，不需要大量的人力来标记数据样本，并根据样本之间的特征关系进行聚类。当添加新的缺陷模式时，无监督学习也具有优势。近年来，无监督学习已成为工业缺陷检测的重要研究方向之一。晶圆图案上的缺陷图案分类不均匀，特征不规则，无监督聚类算法对这种情况具有很强的鲁棒性，广泛用于检测复杂的晶圆缺陷图案。由于簇状缺陷（如划痕、污渍或局部失效模式）导致难以检测，黄振提出了一种解决该问题的新方法。提出了一种利用自监督多层感知器检测缺陷并标记所有缺陷芯片的自动晶圆缺陷聚类算法（k-means聚类）。Jin C H等提出了一种基于密度的噪声应用空间聚类（DBSCAN）的晶圆图案检测与分类框架，该框架根据缺陷图案特征选择性地去除异常值，然后提取的缺陷特征可以同时完成异常点和缺陷图案的检测。Yuan， T等提出了一种多步晶圆分析方法，该方法基于相似聚类技术提供不同精度的聚类结果，根据局部缺陷模式的空间位置识别出种混合型缺陷模式。利用位置信息来区分缺陷簇有一定的局限性，当多个簇彼此靠近或重叠时，分类效果会受到影响。Di Palma，F等采用无监督自组织映射（SOM）和自适应共振理论（ART1）作为晶圆分类器，对1种不同类别的晶圆进行了模拟数据集测试。SOM 和 ART1 都依靠神经元之间的竞争来逐步优化网络以进行无监督分类。由于ART是通过“AND”逻辑推送到参考向量的，因此在处理大量数据集时，计算次数增加，无法获得缺陷类别的实际数量。调整网络标识阈值不会带来任何改进。SOM算法可以将高维输入数据映射到低维空间，同时保持输入数据在高维空间中的拓扑结构。首先，确定神经元的类别和数量，并通过几次对比实验确定其他参数。确定参数后，经过几个学习周期后，数据达到渐近值，并且在模拟数据集和真实数据集上都表现良好。4.3. 半监督学习半监督学习是一种结合了监督学习和无监督学习的机器学习方法。半监督学习可以使用少量的标记数据和大量的未标记数据来解决问题。基于集成的半监督学习过程如图 8 所示。避免了完全标记样品的成本消耗和错误标记。半监督学习已成为近年来的研究热点。图8.基于集成的半监督学习监督学习通常能获得良好的识别结果，但依赖于样本标记的准确性。晶圆数据样本可能存在以下问题。首先是晶圆样品数据需要专业人员手动标记。手动打标过程是主观的，一些混合缺陷模式可能会被错误标记。二是某些缺陷模式的样本不足。第三，一些缺陷模式一开始就没有被标记出来。因此，无监督学习方法无法发挥其性能。针对这一问题，Katherine Shu-Min Li等人提出了一种基于集成的半监督框架，以实现缺陷模式的自动分类。首先，在标记数据上训练监督集成学习模型，然后通过该模型训练未标记的数据。最后，利用无监督学习算法对无法正确分类的样本进行处理，以达到增强的标记效果，提高晶圆缺陷图案分类的准确性。Yuting Kong和Dong Ni提出了一种用于晶圆图分析的半监督增量建模框架。利用梯形网络改进的半监督增量模型和SVAE模型对晶圆图进行分类，然后通过主动学习和伪标注提高模型性能。实验表明，它比CNN模型具有更好的性能。5. 基于深度学习的晶圆表面缺陷检测近年来，随着深度学习算法的发展、GPU算力的提高以及卷积神经网络的出现，计算机视觉领域得到了定性的发展，在表面缺陷检测领域也得到了广泛的应用。在深度学习之前，相关人员需要具备广泛的特征映射和特征描述知识，才能手动绘制特征。深度学习使多层神经网络能够通过抽象层自动提取和学习目标特征，并从图像中检测目标对象。Cheng KCC等分别使用机器学习算法和深度学习算法进行晶圆缺陷检测。他们使用逻辑回归、支持向量机（SVM）、自适应提升决策树（ADBT）和深度神经网络来检测晶圆缺陷。实验证明，深度神经网络的平均准确率优于上述机器学习算法，基于深度学习的晶圆检测算法具有更好的性能。根据不同的应用场景和任务需求，将深度学习模型分为分类网络、检测网络和分割网络。本节讨论创新并比较每个深度学习网络模型的性能。5.1. 分类网络分类网络是较老的深度学习算法之一。分类网络通过卷积、池化等一系列操作，提取输入图像中目标物体的特征信息，然后通过全连接层，根据预设的标签类别进行分类。网络模型如图 9 所示。近年来，出现了许多针对特定问题的分类网络。在晶圆缺陷检测领域，聚焦缺陷特征，增强特征提取能力，推动了晶圆检测的发展。图 9.分类网络模型结构图在晶圆制造过程中，几种不同类型的缺陷耦合在晶圆中，称为混合缺陷。这些类型的缺陷复杂多变且随机性强，已成为半导体公司面临的主要挑战。针对这一问题，Wang J等提出了一种用于晶圆缺陷分类的混合DPR（MDPR）可变形卷积网络（DC-Net）。他们设计了可变形卷积的多标签输出和一热编码机制层，将采样区域聚焦在缺陷特征区域，有效提取缺陷特征，对混合缺陷进行分类，输出单个缺陷，提高混合缺陷的分类精度。Kyeong和Kim为混合缺陷模式的晶圆图像中的每种缺陷设计了单独的分类模型，并通过组合分类器网络检测了晶圆的缺陷模式。作者使用MPL、SVM和CNN组合分类器测试了六种不同模式的晶圆映射数据库，只有作者提出的算法被正确分类。Takeshi Nakazawa和Deepak V. Kulkarni使用CNN对晶圆缺陷图案进行分类。他们使用合成生成的晶圆图像训练和验证了他们的CNN模型。此外，提出了一种利用模拟生成数据的方法，以解决制造中真实缺陷类别数据不平衡的问题，并达到合理的分类精度。这有效解决了晶圆数据采集困难、可用样品少的问题。分类网络模型对比如表3所示。表3. 分类网络模型比较算法创新Acc直流网络采样区域集中在缺陷特征区域，该区域对混合缺陷具有非常强的鲁棒性。93.2%基于CNN的组合分类器针对每个缺陷单独设计分类器，对新缺陷模式适应性强。97.4%基于CNN的分类检索方法可以生成模拟数据集来解释数据不平衡。98.2%5.2. 目标检测网络目标检测网络不仅可以对目标物体进行分类，还可以识别其位置。目标检测网络主要分为两种类型。第一种类型是两级网络，如图10所示。基于区域提案网络生成候选框，然后对候选框进行分类和回归。第二类是一级网络，如图11所示，即端到端目标检测，直接生成目标对象的分类和回归信息，而不生成候选框。相对而言，两级网络检测精度更高，单级网络检测速度更快。检测网络模型的比较如表4所示。图 10.两级检测网络模型结构示意图图 11.一级检测网络模型结构示意图表4. 检测网络模型比较算法创新AccApPCACAE基于二维主成分分析的级联辊类型自动编码。97.27%\YOLOv3-GANGAN增强了缺陷模式的多样性，提高了YOLOv3的通用性。\88.72%YOLOv4更新了骨干网络，增强了 CutMix 和 Mosaic 数据。94.0%75.8%Yu J等提出了一种基于二维主成分分析的卷积自编码器的深度神经网络PCACAE，并设计了一种新的卷积核来提取晶圆缺陷特征。产品自动编码器级联，进一步提高特征提取的性能。针对晶圆数据采集困难、公开数据集少等问题，Ssu-Han Chen等首次采用生成对抗网络和目标检测算法YOLOv3相结合的方法，对小样本中的晶圆缺陷进行检测。GAN增强了缺陷的多样性，提高了YOLOv3的泛化能力。Prashant P. SHINDE等提出使用先进的YOLOv4来检测和定位晶圆缺陷。与YOLOv3相比，骨干提取网络从Darknet-19改进为Darknet-53，并利用mish激活函数使网络鲁棒性。粘性增强，检测能力大大提高，复杂晶圆缺陷模式的检测定位性能更加高效。5.3. 分段网络分割网络对输入图像中的感兴趣区域进行像素级分割。大部分的分割网络都是基于编码器和解码器的结构，如图12所示是分割网络模型结构示意图。通过编码器和解码器，提高了对目标物体特征的提取能力，加强了后续分类网络对图像的分析和理解。在晶圆表面缺陷检测中具有良好的应用前景。图 12.分割网络模型结构示意图。Takeshi Nakazawa等提出了一种深度卷积编码器-解码器神经网络结构，用于晶圆缺陷图案的异常检测和分割。作者设计了基于FCN、U-Net和SegNet的三种编码器-解码器晶圆缺陷模式分割网络，对晶圆局部缺陷模型进行分割。晶圆中的全局随机缺陷通常会导致提取的特征出现噪声。分割后，忽略了全局缺陷对局部缺陷的影响，而有关缺陷聚类的更多信息有助于进一步分析其原因。针对晶圆缺陷像素类别不平衡和样本不足的问题，Han Hui等设计了一种基于U-net网络的改进分割系统。在原有UNet网络的基础上，加入RPN网络，获取缺陷区域建议，然后输入到单元网络进行分割。所设计的两级网络对晶圆缺陷具有准确的分割效果。Subhrajit Nag等人提出了一种新的网络结构 WaferSegClassNet，采用解码器-编码器架构。编码器通过一系列卷积块提取更好的多尺度局部细节，并使用解码器进行分类和生成。分割掩模是第一个可以同时进行分类和分割的晶圆缺陷检测模型，对混合晶圆缺陷具有良好的分割和分类效果。分段网络模型比较如表5所示。表 5.分割网络模型比较算法创新AccFCN将全连接层替换为卷积层以输出 2D 热图。97.8%SegNe结合编码器-解码器和像素级分类层。99.0%U-net将每个编码器层中的特征图复制并裁剪到相应的解码器层。98.9%WaferSegClassNet使用共享编码器同时进行分类和分割。98.2%第6章 结论与展望随着电子信息技术的不断发展和光刻技术的不断完善，晶圆表面缺陷检测在半导体行业中占有重要地位，越来越受到该领域学者的关注。本文对晶圆表面缺陷检测相关的图像信号处理、机器学习和深度学习等方面的研究进行了分析和总结。早期主要采用图像信号处理方法，其中小波变换方法和空间滤波方法应用较多。机器学习在晶圆缺陷检测方面非常强大。k-最近邻（KNN）、决策树（Decision Tree）、支持向量机（SVM）等算法在该领域得到广泛应用，并取得了良好的效果。深度学习以其强大的特征提取能力为晶圆检测领域注入了活力。最新的集成电路制造技术已经发展到4 nm，预测表明它将继续朝着更小的规模发展。然而，随着这些趋势的出现，晶圆上表面缺陷的复杂性也将增加，对模型的可靠性和鲁棒性提出了更严格的挑战。因此，对这些缺陷的分析和处理对于确保集成电路的高质量制造变得越来越重要。虽然在晶圆表面缺陷分析领域取得了一些成果，但仍存在许多问题和挑战。1、晶圆缺陷的公开数据集很少。由于晶圆生产和贴标成本高昂，高质量的公开数据集很少，为数不多的数据集不足以支撑训练。可以考虑创建一个合成晶圆缺陷数据库，并在现有数据集上进行数据增强，为神经网络提供更准确、更全面的数据样本。由于梯度特征中缺陷类型的多功能性，可以使用迁移学习来解决此类问题，主要是为了解决迁移学习中的负迁移和模型不适用性等问题。目前尚不存在灵活高效的迁移模型。利用迁移学习解决晶圆表面缺陷检测中几个样品的问题，是未来研究的难题。2、在晶圆制造过程中，不断产生新的缺陷，缺陷样本的数量和类型不断积累。使用增量学习可以提高网络模型对新缺陷的识别准确率和保持旧缺陷分类的能力。也可作为扩展样本法的研究方向。3、随着技术进步的飞速发展，芯片特征尺寸越来越小、越来越复杂，导致晶圆中存在多种缺陷类型，缺陷相互折叠，导致缺陷特征不均匀、不明显。增加检测难度。多步骤、多方法混合模型已成为检测混合缺陷的主流方法。如何优化深度网络模型的性能，保持较高的检测效率，是一个亟待进一步解决的问题。4、在晶圆制造过程中，不同用途的晶圆图案会产生不同的缺陷。目前，在单个数据集上训练的网络模型不足以识别所有晶圆中用于不同目的的缺陷。如何设计一个通用的网络模型来检测所有缺陷，从而避免为所有晶圆缺陷数据集单独设计训练模型造成的资源浪费，是未来值得思考的方向。5、缺陷检测模型大多为离线模型，无法满足工业生产的实时性要求。为了解决这个问题，需要建立一个自主学习模型系统，使模型能够快速学习和适应新的生产环境，从而实现更高效、更准确的缺陷检测。原文链接:Electronics | Free Full-Text | Review of Wafer Surface Defect Detection Methods (mdpi.com)

近日，国家卫生健康委临床检验中心公布了2020年度新型冠状病毒核酸检测第2次室间质量评价结果，报告显示融智生物以满分成绩通过所有检测项目。融智生物此次参加室间质评所使用仪器是QuanPLEX微流控芯片实时定量PCR分析仪。室间质量评价(EQA, External Quality Assessment)是指，多家实验室分析同一标本，由外部独立机构收集、分析和反馈实验室检测结果，评定实验室常规工作的质量，观察实验室的准确性，通过实验室的比对判定实验室的校准、检测能力及稳定性的质量评价程序。国家卫生健康委临检中心室间质评是目前国内对实验室室间质评的最高标准，此次新型冠状病毒核酸检测室间质评是帮助临床实验室发现检测中存在的问题并进行改进，使得核酸检测在疾病防控工作中更好地得到应用。融智生物由资深质谱研发专家创立，专业致力于生命科学分析仪器设备、耗材及解决方案的研发、生产、销售及服务。此次在新型冠状病毒核酸检测的室间质评中以满分通过，充分证明了融智生物具备了专业的检测技术和严格的质量控制能力。融智生物将以此为动力，持之以恒地为高端生命科学仪器的国产化、国人医疗健康水平的提高做出贡献。

近日，中国科学技术大学生命科学学院、医学中心和中科院天然免疫与慢性疾病重点实验室江维、周荣斌和金腾川研究组与复旦大学丁琛研究组合作，发现一个在天然免疫抗病毒反应中起关键作用的蛋白TRIM65。相关研究成果于2016年12月28日以“TRIM65-catalized ubiquitination is essential for MDA5-mediated antiviral innate immunity”为题，在线发表在生物医学顶级期刊《J Exp Med》上。　　在机体抵抗病毒感染过程中，天然免疫抗病毒受体尤其是RIG样受体起着非常关键的作用。他们通过识别病毒复制中产生的RNA，激活下游信号通路，促进机体产生I型感染素，从而抑制病毒复制。MDA5是一种胞内的RIG样受体，在抵抗脑心肌炎病毒和脑脊髓炎病毒等病毒的感染中起重要作用，但是到目前为止其活化和信号转导机制还很不清楚。该研究通过免疫共沉淀/质谱的方法，发现E3泛素连接酶TRIM65与MDA5之间存在特异的相互作用，且抑制TRIM65表达后EMCV病毒诱导的MDA5介导的感染素的产生完全被阻断，说明TRIM65对MDA5的活化和信号转导非常重要。机制研究发现，TRIM65能够介导MDA5的泛素化和多聚化从而促进其活化。利用脑心肌炎病毒感染小鼠模型也发现，TRIM65缺陷后小鼠不能产生感染素且对脑心肌炎病毒敏感性显著增加。该项研究不仅发现了MDA5信号通路中的一个关键蛋白，还为泛素化在MDA5活化中的关键作用提供了确实证据。　　 本研究得到了基金委、科技部、中科院和中组部的支持。

p style="text-align: justify text-indent: 2em "strong核酸检测呈阳性，表明又一例新型冠状肺炎病例被确诊了，但核酸检测阳性报告是如何出炉的呢？核酸检测需要经历哪些流程呢？/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "从接收样本开始，核酸病毒实验室工作人员，这群离新型冠状病毒最近的“隐形战士”，都是三级防护，strong他们需要对样本灭活，核酸提取、扩增等，然后对结果进行分析，并最终出报告，这个过程要持续6个小时/strong。如果检测结果为“阳性”，则需要更换试剂再次重复操作一次，进行复核。也就是说，strong一份新冠核酸阳性报告出炉，至少需要12小时。/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "整个操作中，他们都需要十分小心，特别是在安全柜内打开样本盖子提取核酸时，需要讲究手法，需要轻轻地、温柔地打开盖子，一不小心就可能形成气溶胶，污染安全柜，也可能让其他样本交叉感染，形成“假阳性”。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/c26655b1-c4ca-413e-b624-4045bd69edd9.jpg" title="摄图网_501114917_wx.jpg" alt="摄图网_501114917_wx.jpg"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong接收样本/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong安全柜内打开转运箱/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong3层密封，每打开一层都要消毒/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "每次展开工作前，都要用75%乙醇对实验室内的生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪进行消毒。实验室内摆放着多个仪器，一旦开始实验，就要等到实验结束才能出来，而消毒是每次进行新冠病毒核酸检测前都必须做的准备工作。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "消毒完成，工作人员需要互相帮忙，穿着防护衣、护目镜、隔离衣，并戴上N95口罩、双层手套，套上脚套等，按照三级防护的标准穿戴好，进入实验室，对送到的装有标本的转运箱进行消毒，然后将标本转运箱放入生物安全柜。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "随后，工作人员要坐在生物安全柜前，双手伸进柜里，慢慢打开标本转运箱。因为转运箱是密封的，工作人员需要相互配合，一人开箱，一人用75%乙醇进行消毒。转运箱共有3层密封，每打开一层就要进行消毒，并确定密封是否完好。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong病毒灭活/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong56℃水浴30分钟，静置20分钟/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong降低开盖导致的气溶胶污染/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "工作人员在取出转运箱中的样本后，在生物安全柜内用75%乙醇对装有标本的密封袋进行喷洒消毒，用吸水纸擦拭后，小心地将样本拿到实验室内的水浴箱中内，放置在水浴箱中的试管架上。水浴箱温度预热至56℃，样本灭活时间为30分钟，灭活之后，需常温静置20分钟，这个过程就是‘病毒灭活’。”/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "病毒灭活是非常重要的一步，可以在不影响检测结果的情况下，确保检测人员安全，病毒灭活后，操作人员感染风险会大大降低。虽然是一个简单的将病毒放入水浴箱的操作，但工作人员的护目镜上会因此蒙上了一层水雾，视线受到限制。在整个检测的时间里，工作人员因为穿着防护服，交流必须大声说话，但为了防止口渴喝水上厕所，他们又只能少说话，等待的时候，多数时候坐在凳子上，看着时间。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong提取核酸/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong开盖要温柔，还要讲究手法/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong一不小心就可能形成气溶胶/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "待样本灭活静置后，工作人员开始再次配合操作，一人拿样本，一人编号。随后，他们拿出样本采集管，需要非常温柔地打开盖子，用移液设备吸取一定量的样本，然后加入核酸提取试剂，把病毒外层蛋白质破坏，让核酸释放出来，提取完成后，立即将提取物进行封盖处理。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "提取核酸是最危险的一个操作步骤，打开样本采集管的盖子，必须要轻轻地、非常温柔，有时还要讲究手法，如果开盖的力度大了，很可能就会形成气溶胶，这样会污染生物安全柜，也会污染手套，甚至有可能让安全柜内的样本交叉感染，形成‘假阳性’。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong报告出炉/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong检测结果如果是阳性/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong需换试剂再重复一次操作/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "在生物安全柜内将提取核酸加至PCR扩增反应体系中，花了差不多近3个小时。随后，工作人员将扩增体系放入扩增仪，核对扩增程序是否正确，启动扩增程序，待反应开始后离开实验室，等待报告出炉。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "经过6个小时的程序，检测报告出来，如果某份是阳性，则需要更换试剂再进行复核检测，整个流程和第一次一样，重复操作一次，又需要6个小时。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong核酸检测工作人员一般为三人一组，共有三个小组，每天2-3班倒，他们都是‘隐形战士’。虽然他们防护很到位，但毕竟是和新冠病毒近距离接触，工作人员讲：“刚开始那两天，我回到家中，都不敢抱两岁的孩子，害怕有风险；而晚上也很难睡着，闭上眼就是白天的检测经过。”/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong在这场抗击疫情战斗中，这些一线的检测人员是战斗的主角，值得大家尊敬，预祝他们早日凯旋归来。/strong/pp style="margin-top: 0em margin-bottom: 1em padding: 0px color: rgb(68, 68, 68) font-family: 宋体, " Arial Narrow" white-space: normal text-align: justify text-indent: 2em "span style="margin: 0px padding: 0px text-indent: 2em "众志成城，抗击疫情。防控新型冠状病毒感染的肺炎疫情，全国在行动，仪器及检测人也在行动!仪器信息网作为科学仪器行业的专业门户网站，充分发挥科学仪器行业专业媒体资源优势，整合科学仪器及检验检测多方资源，第一时间推出/spana href="https://www.instrument.com.cn/zt/xxgzbd" target="_blank" style="margin: 0px padding: 0px color: rgb(84, 141, 212) text-decoration-line: none text-indent: 2em "span style="margin: 0px padding: 0px "strong style="margin: 0px padding: 0px "“抗击新冠疫情，仪器人在行动”/strong/span/aspan style="margin: 0px padding: 0px text-indent: 2em "专题，全力支援疫情抗击工作。/span/pp style="margin-top: 0em margin-bottom: 1em padding: 0px color: rgb(68, 68, 68) font-family: 宋体, " Arial Narrow" white-space: normal text-indent: 2em "strong style="margin: 0px padding: 0px "/strong/pp style="margin-top: 0em margin-bottom: 1em padding: 0px color: rgb(68, 68, 68) font-family: 宋体, " Arial Narrow" white-space: normal text-align: center text-indent: 2em "a href="https://www.instrument.com.cn/zt/xxgzbd" target="_blank" style="margin: 0px padding: 0px color: rgb(102, 102, 102) text-decoration-line: none "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/a767565f-df49-479b-8f08-ac6296a275ee.jpg" title="ae723130-0e56-4376-8be7-ad82428ada84.jpg" alt="ae723130-0e56-4376-8be7-ad82428ada84.jpg" style="margin: 0px padding: 0px border: 0px max-width: 100% max-height: 100% "//a/pp arial="" white-space:="" text-align:="" style="margin-top: 0em margin-bottom: 1em padding: 0px color: rgb(68, 68, 68) font-family: 宋体, " Arial Narrow" white-space: normal text-align: center "span style="margin: 0px padding: 0px color: rgb(84, 141, 212) "a href="https://www.instrument.com.cn/zt/xxgzbd" target="_blank" style="margin: 0px padding: 0px color: rgb(84, 141, 212) text-decoration-line: none "点击图片查看专题详情/a/span/pp style="margin-top: 0em margin-bottom: 1em padding: 0px color: rgb(68, 68, 68) font-family: 宋体, " Arial Narrow" white-space: normal text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/63b2fa31-6e48-4b20-8924-9b0e251db168.jpg" title="企业微信截图_1581300750743.jpg" alt="企业微信截图_1581300750743.jpg" width="400" height="400" border="0" vspace="0" style="margin: 0px padding: 0px border: 0px max-width: 100% max-height: 100% width: 400px height: 400px "//p

p 世界卫生组织(WHO)2月1日宣布，将寨卡病毒及小头症列为全球紧急公共卫生事件，国际社会应当协调应对。这是继甲型H1N1流感、脊髓灰质炎及埃博拉疫情后，世卫组织发布的第四个国际关注的突发公共卫生事件。寨卡（Zika）病毒正在美洲“爆炸式蔓延”，目前已在全世界24个国家和地区有疫情报道，并已发现超过4000例新生儿小头畸形病例。中国大陆目前尚未发现寨卡病毒病例，但存在病例输入风险。国家卫计委提醒，随着气候逐渐回暖，到了春夏季后，广东等南方省份需要格外警惕。br//pp 2月3日，国家卫计委公布《寨卡病毒病诊疗方案（2016第一版）》，其中规定：病毒荧光PCR核酸检测为病原学检查和病例确诊依据。br//pp 针对此次疫情，天隆科技紧急启动 “寨卡（ZiKa）病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”的项目并已设计完成，随时等待量产工作。该试剂盒将第一时间走进疫情防控部门，为疑似病例的及时、有效检测工作提供保障。/pp style="text-align: center " 寨卡（ZiKa）病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）/ppimg width="640" height="520" title="试剂图片.png" style="width: 640px height: 520px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201602/uepic/68321558-2536-4c51-b099-3cfd86b55d96.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//ppstrong检测原理：/strong/pp 寨卡病毒核酸为单股正链RNA，全基因长度约为11Kb，天隆科技选择其中多个保守靶基因片段作为检测目标，实现多靶点同时检测，并结合高特异的探针技术（LNA技术)，有效地避开其他黄病毒的干扰，确保检测的高敏感度和特异性，可对血清中寨卡病毒实现实时定量分析，其检测灵敏度可达50copies/ml。br//pp 该检测试剂盒配合天隆自主研发生产的自动化核酸提取仪、提取试剂及荧光定量PCR仪，从样本的提取到核酸定量检测、报告的出具仅需2个小时，大大缩短了检测周期。特有内参基因的扩增检测，对实验过程（核酸提取、PCR扩增）进行全程监控，最大程度上保证结果的可靠性。br//ppstrong试剂盒参数：/strongbr/灵敏度：50copies/mlbr/规 格：25测试/盒br/有效期：-20℃保存，有效期12个月。br//ppstrong什么是寨卡（Zika）病毒？/strong/pp寨卡（Zika）病毒属于黄病毒科中之黄病毒属的RNA病毒，与乙型脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒近亲。该病毒主要通过伊蚊叮咬在人际间传播。该病毒于1947年首次在乌干达被科学家一只发病的恒河猴体内分离出来，当时这只猴子是准备用来进行黄热病研究的。/pp style="text-align: center "br/img title="1.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201602/uepic/5108dc86-f78c-48b3-8977-5e4cd2a6555f.jpg"//ppstrong寨卡(ZiKa)病毒模式图/strong/pp 寨卡病毒病感染以症状和流行病史为诊断基础（比如，蚊子叮咬，或者到已知存有寨卡病毒的地区旅行）。由于寨卡病毒与登革热、西尼罗河病毒和黄热病等其它黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法做出诊断可能较为困难。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和血中病毒分离培养可以确诊。起病7天内，如果检测到外周血清中寨卡病毒RNA阳性可以诊断，但由于RT-PCR阳性窗比较短（3-7天），也就是病毒血症期短，因此阳性窗之外阴性结果不能除外感染。br//pp 寨卡病毒病主要通过蚊子（伊蚊）叮咬传播，血液和性传播罕见。多数病人仅出现轻微发热、红疹（多数为斑丘疹），另有一些病人会出现头痛、关节痛以及非化脓性结膜炎等症状，大多持续2至7天后自愈，极少出现死亡。近期有研究结果提示，病毒感染可导致少数人出现神经和自身免疫系统症状，孕妇感染后可能导致新生儿小头畸形，并可导致小儿夭折，其因果关系尚待进一步研究确证。br/　 目前该病主要通过对症治疗，尚无针对性的药物和疫苗，但可通过防止蚊虫叮咬有效预防。建议采取以下措施：使用驱虫剂；穿戴尽可能覆盖身体各部位的衣服，而且最好是浅色衣服；采用纱网、门窗紧闭等物理屏障；蚊帐内睡觉。要保护自己免患寨卡病毒和其它蚊媒疾病，每个人都应当采取上述措施，避免受到蚊子叮咬。孕妇或者计划怀孕的妇女应当遵循这一建议，当前往已经出现寨卡病毒疫情的地区旅行时也可征求当地卫生部门的意见。 /pp　 天隆产品早在HIN1、H7N9、埃博拉、中东呼吸综合征等突发公共卫生事件中做出了重要贡献。br//pul class=" list-paddingleft-2" style="list-style-type: disc "lip2009年，陕西首例H1N1。天隆荧光PCR仪检出陕西首例甲型H1N1流感病例；/p/lilip2013年，H7N9。人感染H7N9禽流感防控期间，天隆荧光PCR仪和核酸提取仪及试剂装备了浙江大学第一附属医院、湖州市CDC等重点单位，完成了数千例流感样H7N9病毒核酸提取和筛查；/p/lilip2014年，埃博拉疫情。天隆科技快速响应进行埃博拉病毒核酸检测试剂（PCR-荧光探针法）的研发和生产，在塞拉利昂疫区，我国援非医疗检测队利用该试剂完成了348例埃博拉出血热疑似病例的临床研究，检出阳性标本166例。该试剂盒经过CFDA严格考核，通过了应急审批，获得了国家注册证，已正式列入我国及西非诊断埃博拉病毒和疫情防控的应急储备产品；/p/lilip2015年，中东呼吸综合征冠状病毒（ MERS-CoV）。天隆设备一旦发现MERS疑似病例，最快2小时内就能出结果，MERS检测试剂发往多个省级CDC、医院并出口至韩国，用于国家定点医院、流感检测网中心对流感、发热病人的初筛。/p/lilipbr//p/li/ulpbr//pp“为人类健康，创造一流分子诊断产品”是天隆科技的追求，我们将一如既往地为人类健康提供优良的产品及全方位的支持服务。/p

日前，国家药监局发布了《猴痘病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）》，审评要点主要包括监管信息、综述资料、产品技术要求及检验报告、分析性能研究、稳定性研究、阳性判断值研究其他非临床研究资料等，并对每一项进行了详细的陈述。详情如下：国家药监局器审中心关于发布猴痘病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）的通告（2022年第31号） 　　为规范猴痘病毒核酸检测试剂技术审评工作，国家药监局器审中心组织编写了《猴痘病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）》，现予发布。特此通告。　　附件：猴痘病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）.doc国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心2022年7月15日附件猴痘病毒核酸检测试剂技术审评要点（试行）本审评要点旨在指导注册申请人对猴痘病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门提供参考。本审评要点是对猴痘病毒核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。一、适用范围本审评要点适用于猴痘病毒核酸检测试剂注册申请和变更注册申请的情形，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家药品监督管理局公告2021年第122号）等相关法规要求。二、注册审查要点（一）监管信息1.产品名称及分类编码产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第48号）及相关法规的要求，如猴痘病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为6840。2.其他信息还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。（二）综述资料综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。应详细说明产品所采用的技术原理及检测流程。提供不同适用机型的检测通量，即一次检测最多可检测的样本数。提供核酸提取（手工和自动提取方式应分别明确）和PCR扩增的时间，以及检测全过程所需的时间。不同检测流程，分别提供最少和最多检测样本量下的检测时间。与已上市同类产品进行比较，比较内容包括样本类型，检测原理，检测靶基因区域，组成成分，内标，质控品，判读规则，分析性能和临床性能等。（三）产品技术要求及检验报告注册申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、前期评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献资料，结合产品特性按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（2022年第8号）的要求编写。该类产品作为第三类体外诊断试剂，应当以附录形式明确主要原材料以及生产工艺要求。猴痘病毒核酸检测试剂如有国家标准品，技术要求中应体现国家标准品的相关要求，并使用国家标准品对三批产品进行检验。猴痘病毒核酸检测试剂的检出限水平应符合国家相关指南文件规定申报产品对国家灵敏度标准品的检测结果应与声称的检出限水平相当。如有适用的国家标准、行业标准，产品技术要求的相关要求应不低于相应的要求。（四）分析性能研究注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。如果样本的阴阳性或浓度值由其他单位提供，需要由该单位出具盖章的样本信息文件。 分析性能评估中如使用稀释样本，应采用与适用样本类型一致的阴性基质。分析性能评估用样本应当为真实样本，可采用境内或境外样本进行研究。对于各项性能中采用的样本，在下述各项性能研究资料中分别提供样本信息列表。建议着重对以下分析性能进行研究。1.反应体系1.1样本采集和处理根据适用样本类型，进行样本采集研究。提供样本采集器具和保存液等的详细研究资料，明确保存液或裂解液等的成分、浓度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需验证检出限和重复性。提供样本灭活、处理方式、处理过程的研究。1.2核酸提取和反应体系研究确定最佳核酸提取和反应体系，包括核酸提取方法与过程、提取用样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取质量的情况下尽量扩大总反应体系和加样量，以提高检测灵敏度。提交不同适用机型基线和阈值循环数的确定资料。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。2.样本稳定性对采集后各阶段的样本进行稳定性研究，包括不同保存液、裂解液，不同灭活方式处理后的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。建议对每种样本类型均进行稳定性研究。如核酸提取液可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。3.适用的样本类型列明产品适用的样本类型，如皮肤病变标本（包括病变皮疹、痘疱表面和/或渗出物的拭子，痘疱液，痘疱表皮或痘痂等）、咽拭子、全血或血清样本，应分别进行分析性能评估。4.核酸提取/纯化性能在进行核酸检测之前，建议有核酸提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的DNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。5.精密度应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：阴性样本：待测物浓度为零浓度，阴性检出率应为100%（n≥20）。临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。6.分析特异性6.1交叉反应首先应采用生物信息学分析方法进行研究，应当包括人基因组和所有已知病原体。样本验证：交叉反应研究样品除特殊说明外，应采用灭活的临床样本或添加了灭活病原体培养物的阴性临床样本，样本基质应与预期检测样本类型一致，交叉反应研究用样本主要考虑以下几方面：6.1.1其他近缘病毒：天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、传染性软疣病毒、特纳河痘病毒（假病毒）、亚巴猴病毒（假病毒）等。6.1.2引起出疹症状等的其他病毒：水痘-带状疱疹病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒-1/-2、人类疱疹病毒 6、人类疱疹病毒 7、人类疱疹病毒8、麻疹病毒、肠道病毒、梅毒螺旋体、登革病毒等。6.1.3适用样本中可能存在的其他细菌/真菌：金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、丙酸杆菌、类白喉杆菌等。6.1.4高浓度人类基因组DNA。注：病毒培养液的浓度单位可采用TCID50或PFU/mL，细菌培养物浓度单位可采用CFU/mL。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106 CFU/mL或更高，病毒为105 PFU/mL或更高。也可采用其他合理方法定值的浓度，例如核酸浓度107 copies/mL，如病原体样本或培养物不能符合上述要求，申请人应详细说明理由。申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别信息和浓度确认等试验资料。6.2干扰研究6.2.1干扰试验应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证，验证推荐物质见表1。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的猴痘病毒样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的 Ct 值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。表1 用于干扰试验的物质类别具体物质粘蛋白、白蛋白血液（人类）适用样本类型为咽拭子缓解咽部症状的含片、喷剂等适用样本类型为血液时血脂、胆红素、血红蛋白、抗凝剂（如适用）过敏性症状缓解药物盐酸组胺、氯雷他定、西替利嗪抗病毒药物抗生素左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、美罗培南解热镇痛药物扑热息痛、对乙酰氨基酚、阿司匹林全身性抗菌药物妥布霉素维生素A样本采集和处理期间引入的物质6.2.2竞争性干扰申请人应结合产品适用的样本类型，充分考虑临床上容易与猴痘病毒合并感染的病原体，在高浓度的情况下对低浓度（例如检出限浓度）猴痘病毒核酸检测的影响，进行竞争性干扰研究。7.检出限7.1检出限的确定将不同来源的至少3个样本梯度稀释于与适用样本一致的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度最少重复3次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检出限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样本，每个浓度至少重复20次检测，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。7.2检出限的验证选择另外3个不同来源的样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。如包括多个检测靶标，应分别进行研究。8.包容性8.1应当采用生物信息学分析方法对产品检测的包容性进行研究，应当包括所有已公布的猴痘病毒核酸序列。8.2验证具有时间和区域特征性的至少10个不同来源的阳性样本，包含西非分支、刚果盆地分支和不同的变异株。研究应包括检出限和重复性的验证。注意包容性研究样本和检出限研究样本不能重复。9.企业参考品验证根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。（五）稳定性研究申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括具体的实施方案、详细的研究数据以及统计分析结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。（六）阳性判断值研究阳性判断值一般为申报产品检测病毒核酸阳性的Ct值。阳性判断值研究用样本来源应具有多样性和代表性，考虑不同时间、地域、不同的感染阶段和生理状态等因素，尽量纳入较多弱阳性和高阴性水平的样本。在条件允许的情况下，建议覆盖目前的流行株进行阳性判断值研究。采用ROC曲线分析建立阳性判断值，并确定产品的判读规则。如判定值存在灰区，应提供灰区的确认资料。如果产品适用不同样本类型，需要对各样本类型进行阳性判断值的验证。提交阳性判断值研究所用样本的背景信息列表，至少包括性别、年龄、临床诊断信息、样本来源机构、检测结果等信息。提供内标检测结果范围的确定方法和研究资料。（七）其他非临床研究资料1.主要原材料研究该类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品、企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量控制标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供资料包括：选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。供应商应固定，不得随意更换。1.1引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、靶序列的基因位点及两者的对应情况。建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，通过序列比对和功能性试验等方式，对病毒进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，其中序列比对包括与已公布猴痘病毒序列的比对，及与易产生交叉反应的其他病原体的序列比对；功能性试验包括对不同来源、不同滴度的猴痘病毒核酸阳性样本，和不同的近缘病原体的检测。通过筛选确定最佳的引物和探针组合。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。1.2脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，应分别对酶活性、功能性等进行评价和验证。1.4质控品试剂盒一般包含阴性质控品和阳性质控品。阳性质控品应包含试剂盒检测的靶序列，可采用假病毒制备，建议制备浓度为弱阳性。质控品需参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。提交试剂盒质控品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料，对质控品的检测结果Ct值范围做出明确的要求。1.5内标内标，又称内对照，可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增。申请人需对内标的引物、探针设计和相关反应体系的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。明确内标的检测结果Ct值范围。建议科学设置内标，对待测样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。1.6企业参考品制备申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品、精密度参考品。应提交企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度确认方法或试剂等相关验证资料。阳性参考品应包含不同浓度水平的目标核酸阳性样本至少5例。 阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况，建议包括水痘-带状疱疹病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、人类疱疹病毒、天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、化脓性链球菌、白色念珠菌等。检出限参考品应包含95%阳性检出水平或略高于检出限的水平，如100%阳性检出水平。精密度参考品应包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。2.生产工艺研究资料介绍产品主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。提交主要生产工艺的确定及优化研究资料。（八）临床评价1.临床试验机构建议申请人在相关流行病学多发区域选择临床试验机构，应是经备案的医疗器械临床试验机构（包括各级疾病预防控制中心）。临床试验机构数量应不少于3家，且具有分子生物学方法检测的优势，实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，试验体外诊断试剂和对比方法均应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。2.临床试验设计2.1 与对比方法/试剂的比较研究2.1.1申请人可采用核酸序列测定方法作为参比方法，验证试验体外诊断试剂检测结果与核酸序列测定（测序）结果之间的一致性。临床研究中应对选用的测序方法做详细介绍，并对委托测序服务的机构（如涉及）资质和选择依据作简要说明或提供相关资料。同时申请人应进行部分与病毒分离培养鉴定进行比对的临床试验。2.1.2 如有已上市同类产品，临床试验可选择已上市的同类产品作为对比试剂，对比试剂的选择应考虑样本类型、产品性能等方面应与试验体外诊断试剂具有良好的可比性。2.2 与临床参考标准的比较研究除上述比对试验外，还应考虑试验体外诊断试剂与临床参考标准进行对比。临床参考标准即按照国家卫生健康委员会发布的《猴痘诊疗指南》及《猴痘防控技术指南》等文件进行病例诊断的方法。3.临床试验入组人群临床试验的入组人群应为产品的预期适用人群，该产品的适用人群为猴痘的疑似病例，申请人在进行临床试验时应依据国家卫生健康委员会发布的《猴痘诊疗指南》中对“疑似病例”的定义，按照该定义入组病例进行临床研究。同时还应入组部分需要进行鉴别诊断的其它发热出疹性疾病，如水痘、带状疱疹、单纯疱疹、麻疹、登革热等进行特异性的评价。如试验体外诊断试剂包括血液样本类型，应注意针对该样本类型，入组人群应为急性期发病7日内的病例。4.临床试验样本类型临床样本的采集建议按照《猴痘病毒实验室检测技术指南》进行。临床试验过程中，如临床试验过程中样本确实难以获得，经提取后的核酸提取液亦可作为样本进行临床试验。如采用核酸提取液进行临床试验，建议临床试验中明确该核酸提取液对应的样本类型及样本保存液/采样液（如适用），同时明确核酸提取试剂盒，临床前应对临床试验中所涉及的样本类型、样本保存液及核酸提取试剂进行充分的性能评估，临床试验中所用样本保存液及核酸提取试剂应严格满足考核试剂及对比试剂要求。如申报产品适用于不同的样本类型，如皮肤病变标本（包括皮疹/痘疱渗出物的拭子；痘疱液；痘痂等）、咽拭子、全血或血清样本，应在临床试验中分别进行临床评价。针对全血和血清两种样本类型，申请人可通过同源比对的方式进行评价。样本类型的选择，应参考国家卫生健康委员会发布的《猴痘诊疗指南》及《猴痘防控技术指南》等文件的相关要求。5.临床试验样本量与对比方法/试剂比较研究的临床试验样本量应满足统计学要求，可采用适当的统计学方法进行估算。临床试验可依据试验用体外诊断试剂相对于对比方法的阴阳性符合率分别估算最低阴阳性样本例数。临床样本量的估算建议采用如下样本量公式计算，公式中，n为样本量；Z1-α、Z1-β为显著性水平和把握度的标准正态分布的分数位，P0为评价指标的临床可接受标准，PT为试验体外诊断试剂评价指标预期值。其中，阴阳性符合率的临床可接受标准（P0）建议不低于90%。获得临床试验数据后，证明产品相对于对比方法的阴阳性符合率（置信区间下限）不低于预设的临床可接受标准（P0）。当评价指标P接近100%时，上述样本量估算方法可能不适用，应考虑选择更加适宜的方法进行样本量估算和统计学分析，如精确概率法等。如申报试剂包含不同样本类型，建议针对皮肤病变标本、咽拭子、血液样本分别按照上述方法进行统计学估算。皮肤病变标本中，皮疹/痘疱渗出物的拭子、痘疱液、痘痂等均应有一定例数。病毒分离培养应入组一定数量的阳性及阴性病例，考察试验体外诊断试剂与病毒分离培养结果的一致性，纳入的例数也应进行统计学估算，可采用抽样精度的公式进行样本量估算。与临床参考标准的比较研究，建议参考与对比方法/试剂比较研究部分的样本量估算方法，设定合理的临床可接受标准。6.临床试验结果的统计分析此类产品的临床试验目的在于验证试验体外诊断试剂与已上市同类产品及临床参考标准的一致性，统计分析一般以四格表的形式对结果进行总结，并据此计算试验体外诊断试剂与对比方法的阳性/阴性符合率、临床灵敏度、临床特异度及其置信区间。应将试验体外诊断试剂与对比方法检测结果一致性、试验体外诊断试剂检测结果与临床参考标准的一致性、试验体外诊断试剂检测结果与病毒分离培养鉴定结果的一致性分别进行统计分析，以评价产品临床性能。临床试验建议对入组人群的人口学进行分析，包括年龄、性别、临床诊断背景等。临床试验中包含不同样本类型的，应在总样本数（各样本类型总和）进行统计分析的基础上，每个样本类型分别进行统计分析。临床试验中所有不一致结果均应结合患者的流行病学背景、临床症状、疾病转归等信息进行充分的分析。7. 境外临床试验数据的认可境外临床试验数据应符合《接受医疗器械境外临床试验数据技术指导原则》和《使用体外诊断试剂境外临床试验数据的注册审查指导原则》的相关要求。提交完整的临床试验方案、报告和伦理审查意见，以及该数据适用于中国患者人群的论证资料、境内外临床试验质量管理差异的对比资料和临床试验质量管理差异对于临床试验结果影响的论证资料。注册申请人应根据上述临床试验技术审评要求，论证境外临床试验数据的充分性。8. 临床证据的形式要求申请人应按照《体外诊断试剂注册与备案管理办法》、《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等法规文件要求提交各机构伦理审查意见、临床试验方案、临床试验小结、临床试验报告以及临床试验数据库。临床试验数据汇总表作为临床试验报告的附件提交。数据表中应包括检测病例的编号、年龄、性别、样本类型、临床诊断结果、发病时间、试验体外诊断试剂检测结果（含各基因的Ct值）、对比方法的检测结果（各基因的Ct值）等，如临床试验中所用样本为核酸提取液，应明确该样本样本保存液（如涉及）、核酸提取试剂等。临床应用的数据集中每一病例编号应能够溯源。关于测序试验，申请人应提供以下关于测序部分的详细试验资料，需有临床试验单位的签章确认。（九）产品说明书和标签样稿产品说明书格式应满足《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求。产品说明书中技术内容应与注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，应以规范格式进行标注，并单独列明文献的相关信息。新冠病毒核酸检测试剂说明书编写应重点关注以下内容。1．【预期用途】本试剂盒用于体外定性检测猴痘疑似病例、其他需要进行猴痘病毒感染诊断或鉴别诊断者的xx样本中猴痘病毒核酸。有关“疑似病例”等人群的定义参照《猴痘诊疗指南》及《猴痘防控技术指南》等文件执行。该产品在使用上应当遵守《猴痘诊疗指南》及《猴痘防控技术指南》等文件的相关要求。开展猴痘病毒核酸检测，应符合《猴痘病毒实验室检测技术指南》等的要求，做好生物安全工作。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊断的唯一标准。建议结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。2.【检验原理】简述产品的核酸提取和扩增原理，检测能够覆盖的目标基因序列特征。明确内标基因名称及其作用。如采用了防污染措施，进行简要描述。3.【主要组成成分】明确试剂盒中各组分及具体成分。明确需要但未提供的材料，例如核酸提取试剂，病毒保存液等的产品名称，生产厂家，货号及注册证号、备案号等信息。4.【样本要求】需详细描述样本采集和处理方式，包括采样步骤，适用的拭子材质（如适用），保存液及使用体积、适用的抗凝剂类型（如适用），灭活方式等。描述样本及核酸提取液的保存稳定性。5.【检验方法】明确核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积，阴、阳性质控品与待测样本同步进行核酸提取操作。明确各适用机型的反应参数设置。明确质控品和内标的检测结果Ct值范围，作为实验有效性的标准。6.【检验结果的解释】通过扩增曲线和Ct值进行结果阴阳性的判断，列明结果阴性、阳性、复测、无效等所有情形。7.【检验方法的局限性】7.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。7.2有关假阳性结果的可能性分析7.2.1 如果样本在运输、处理过程中发生交叉污染，则可能导致假阳性结果；7.2.2 实验环境有PCR产物等气溶胶污染，则可能导致假阳性结果；7.2.3 实验过程中使用的耗材、设备等受污染，则可能导致假阳性结果。7.3有关假阴性结果的可能性分析7.3.1不合理的样本采集、转运、储存及处理、样本中病原体含量过低均有可能导致假阴性结果；7.3.2该病原体待测靶序列的变异或其他原因导致的序列改变可能会导致假阴性结果；7.3.3 未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果。8.【产品性能指标】简述以下性能指标：8.1国家标准品（如有）和企业参考品的符合率。8.2检出限：简要介绍评价方法、所用样本情况以及评价结果。8.3对包容性的研究情况进行总结。包括不同分支样本和猴痘病毒变异株的检出限和重复性性能并描述猴痘病毒变异株生物信息学分析结果。8.4对精密度的研究情况进行总结。8.5分析特异性8.5.1交叉反应：详述交叉反应验证的病原体种类，及有/无交叉反应的浓度水平。8.5.2干扰试验：说明验证的干扰物质种类及有/无干扰反应的浓度水平。8.6临床试验：简要介绍试验方法、受试者及样本、试验结果和结论等。9.【注意事项】9.1本产品仅用于体外诊断。9.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》等有关分子生物学实验室要求。9.3试剂保存运输及使用过程中多种因素可能导致性能变化，如保存运输不当、样本采集、样本处理及检测过程操作不规范等，请严格按照说明书操作。因拭子等样本采集过程及病毒感染过程本身的特点，可能存在采集到的样本量不足等原因带来的假阴性结果，应结合临床其他诊疗信息综合判断，必要时复测。9.4生物安全防护相关内容9.5避免实验室污染的措施

据了解，之所以出现这些说法，是因为有人在家用橘子汁做抗原检测，结果显示“两道杠”。视频中，操作人员直接把橘子汁液挤在新冠抗原试剂检测盒上，随后T区和C区均出现紫红色的横线。这些内容，导致不少人产生恐慌，纷纷询问是真是假，甚至表示不敢吃橘子了。目前正是橘子、橙子等水果大量上市的季节，也有网友表示，最近家里常吃这些水果，自己和家人的核酸检测均无异常。网友在家用橘子汁做抗原检测，结果呈阳性（网络截图）为验证传言的真实性，11月27日晚，央广网记者随机找到一处核酸检测便民服务点，在食用了橘子约2分钟后，且在没有饮水及食用其他食物的情况下，参与了核酸采样。记者吃下橘子后，立刻参与了核酸采样。11月28日早上7点，记者打开北京健康宝进行核酸自查，结果显示：阴性记者本人11月28日的健康码自查询结果吃橘子到底会不会影响抗原检测和核酸检测结果？橘子汁让抗原检测呈现阳性结果是为什么？带着这些问题，央广网记者采访了应急总医院检验科主任许慧。用橘子汁做抗原检测或者核酸检测，结果无意义许慧主任表示，样本检测是个“精细活”，需要进行全流程的质量控制，即在采样前、采样中、采样后确保操作准确，才能确保结果的准确性。首先要明确抗原检测和核酸检测是不一样的。抗原检测病毒的衣壳上的蛋白质，使用的胶体金方法的快速测试卡；而核酸检测病毒衣壳内部的核酸，方法通常为实时荧光定量扩增检测（RT-PCR）。网友用橘子汁作试验检测的是病毒抗原。抗原检测或核酸检测要获得准确的检测结果，规范取样是最关键的一环。新冠病毒抗原试剂盒的适用样本为“人鼻黏膜上皮细胞”，将橘子汁作为样本滴入试剂盒，本身就不符合取样标准。因此，无论呈现出何种结果，都是无意义的。用橘子汁做抗原检测，为什么会出现假阳性？其实2021年就有德国研究人员做过类似的实验，不只是橙子的汁液，研究人员将可口可乐、零度可乐、芬达、红牛、伏特加、威士忌、白兰地、苏打水等多种饮料分别直接滴加在新冠抗原检测孔中，过一段时间，都会出现提示阳性的T线。但对这些饮料进行核酸检测，并没有检测到新冠病毒。“这是因为，抗原检测试剂盒只有在正确的使用方式下，检测结果才有效力。做抗原检测时，需要将拭子取样后放入含有样本处理液的采样管中，洗脱后滴入试剂板条。同样，研究人员把这些饮料与样本处理液混合后再滴加到样本孔中做检测，抗原检测并不会出现T区红线的结果。”秘密就在样本处理液中。新冠抗原检测试剂盒的原理简单来说，就是通过特异抗体捕获特定抗原，但抗原抗体的结合需要维持适当的PH值（酸碱度），样本处理液里含有缓冲体系，可以保证抗原抗体在合适的PH值下结合。”橙汁或者各类饮品直接加到试剂板条上，破坏了适宜的PH环境，造成抗原抗体的非特异性结果，这才产生了假阳性。吃橘子是否会影响抗原检测结果？多虑了据了解，检测过程中，确实会有一些干扰因素影响最终检测结果，出现假阳性等情况。但使用抗原检测试剂无需担心吃橘子这一问题，因为新冠抗原检测试剂盒一般使用取样位置相对较浅、更便于大众操作的鼻拭子作为标本。做抗原检测时，鼻拭子的采样部位位于鼻腔内，吃了哪些食物并不会对检测结果造成影响。专家提示，抗原检测时，应严格按照说明操作。要注意，取样部位为鼻腔黏膜上皮细胞。因此，最好在取样前先擤个鼻涕，清除鼻腔内的“多余”物质。吃橘子是否影响核酸检测结果？不必担心目前，大多数核酸检测点提取的样本都是口咽拭子，许慧主任介绍，核酸检测主要是通过测定致病微生物病毒的核酸来判定结果。提取核酸的过程中要经过洗脱、纯化。因此，其他物质对核酸检测结果的影响微乎其微。专家建议，检测前30分钟受检者最好不要喝水、饮酒或嚼口香糖，采样前2小时应避免进食，以防止咽拭刺激反射性呕吐。核酸检测结果与抗原检测结果不一致怎么办？2022年3月10日印发的《关于印发新冠病毒抗原检测应用方案（试行）的通知》第五部分“核酸检测的确认”中明确指出，核酸检测是新冠病毒感染的确诊依据。在进行核酸检测确认的过程中，如核酸检测阳性，不论抗原检测结果是阳性还是阴性，均按照新冠病毒感染者或新冠肺炎确诊患者采取相应措施；如核酸检测阴性但抗原检测阳性，则视同新冠病毒感染者采取集中隔离等措施，密切观察，连续进行核酸检测。因此，抗原检测可以作为判断是否感染病毒的一个补充手段，不建议作为日常筛查的主要方式。

5月25日，国家医疗保障局办公室、国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组发布关于进一步降低新冠病毒核酸检测和抗原检测价格的通知。通知指出进一步下调公立医疗机构新冠病毒核酸检测的政府指导价，各省份要将单人单检降至不高于每人份16元；多人混检统一降至不高于每人份5元。各省份应在2022年6月10日前完成调价工作。此外，国家药监局已批准104个新冠病毒检测产品，其中包括37个核酸检测产品，35个抗体检测产品和32个抗原检测产品。《通知》全文：国家医疗保障局办公室　国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组关于进一步降低新冠病毒核酸检测和抗原检测价格的通知医保办发〔2022〕10号各省、自治区、直辖市及新疆生产建设兵团应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制（领导小组、指挥部）、医疗保障局：为贯彻落实新冠病毒肺炎疫情防控要求，配合做好大规模筛查和常态化检测工作，降低群众负担和社会成本，现就进一步降低医疗机构新冠病毒核酸检测和抗原检测价格的相关事项通知如下：一、进一步下调公立医疗机构新冠病毒核酸检测的政府指导价。各省份要将单人单检降至不高于每人份16元；多人混检统一降至不高于每人份5元。实行检测价格和试剂价格分开计价收费的省份，要按照不高于上述水平设置封顶标准。二、进一步下调公立医疗机构新冠病毒抗原检测的政府指导价。公立医疗机构开展的新冠病毒抗原检测服务，按照“价格项目+检测试剂”的方式收费。其中，“新冠抗原检测”医疗服务价格项目的政府指导价降至不高于每人份2元；新冠抗原检测试剂（含采样器具）按照实际采购价格零差率销售；“价格项目+检测试剂”收费总额的封顶标准降至不高于每人份6元。三、各省份制定的新冠病毒核酸检测、抗原检测政府指导价均为最高限价，公立医疗机构实际收费标准不得上浮，下浮不限。对于政府组织的大规模筛查、常态化检测，要充分考虑到规模效应和基层组织、志愿者对成本的分担效应，新冠病毒核酸多人混检按照不高于每人份3.5元的标准计费，检测机构仅提供样本转运及检测服务的，需进一步降低计费标准。四、各省份医保部门参考目前全国已有的挂网采购价格，在6月10日之前，通过组织实施集中采购、竞价挂网、参与跨省联盟采购、区域价格比较等多种方式，使公立医疗机构可以将新冠核酸检测所需扩增试剂、提取试剂、采样器具等物耗成本降至单人单检价格的40%以内。五、公立医疗机构开展新冠病毒核酸检测服务，应同时提供单人单检和多人混检两种服务选项，在符合疫情防控规定的前提下，允许“愿检尽检”的群众自愿选择。非公立医疗机构，以及医学检验实验室等社会检测机构提供新冠病毒核酸检测服务，定价应当遵循“公平、合法和诚实信用”的原则，体现保本微利、质价相符，不得借疫生不义之财，倡导参照当地公立医疗机构新冠核酸检测价格。六、各省份应在2022年6月10日前完成调价工作。涉及降低公立医疗机构新冠病毒核酸检测和抗原检测价格的其它相关事项，按照医保办发〔2021〕45号、医保办发〔2022〕5号、医保办函〔2022〕13号文件执行。本通知自印发之日起生效。国家医疗保障局办公室 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组 （国家卫生健康委医政医管局代章）　　2022年5月22日 5月20日，国家药监局再次审查批准2个新冠病毒检测产品，此次获批的产品分别为上泰普生物科学（中国）有限公司研发生产的2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)和厦门宝太生物科技股份有限公司研发生产的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）。截至今日，国家药监局已批准104个新冠病毒检测产品，其中包括37个核酸检测产品，35个抗体检测产品和32个抗原检测产品。国家药监局新型冠状病毒检测产品名单：国家药监局新型冠状病毒检测试剂注册信息序号注册证号产品名称注册人1国械注准20203400057新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海之江生物科技股份有限公司2国械注准20203400058新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海捷诺生物科技有限公司3国械注准20203400059新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）华大生物科技（武汉）有限公司4国械注准20203400060新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）华大生物科技（武汉）有限公司5国械注准20203400063新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）中山大学达安基因股份有限公司6国械注准20203400064新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）圣湘生物科技股份有限公司7国械注准20203400065新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海伯杰医疗科技有限公司8国械注准20203400176新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（胶体金法）广州万孚生物技术股份有限公司9国械注准20203400177新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）英诺特（唐山）生物技术有限公司10国械注准20203400179新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）北京卓诚惠生生物科技股份有限公司11国械注准20203400182新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司12国械注准20203400183新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司13国械注准20203400184新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）迈克生物股份有限公司14国械注准20203400198新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）厦门万泰凯瑞生物技术有限公司15国械注准20203400199新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）广东和信健康科技有限公司16国械注准20203400212新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）武汉明德生物科技股份有限公司17国械注准20203400239新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）南京诺唯赞医疗科技有限公司18国械注准20203400240新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）珠海丽珠试剂股份有限公司19国械注准20203400241新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）杭州优思达生物技术有限公司20国械注准20203400299新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海复星长征医学科学有限公司21国械注准20203400300新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RNA捕获探针法）上海仁度生物科技有限公司22国械注准20203400301新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增-金探针层析法）武汉中帜生物科技股份有限公司23国械注准20203400302新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（双扩增法）武汉中帜生物科技股份有限公司24国械注准20203400322新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）北京金豪制药股份有限公司25国械注准20203400365新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）丹娜（天津）生物科技有限公司26国械注准20203400366新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）丹娜（天津）生物科技有限公司27国械注准20203400367新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（胶体金法）上海芯超生物科技有限公司28国械注准20203400384新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）江苏硕世生物科技股份有限公司29国械注准20203400457新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）北京新兴四寰生物技术有限公司30国械注准20203400494新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）郑州安图生物工程股份有限公司31国械注准20203400495新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）郑州安图生物工程股份有限公司32国械注准20203400496新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（直接化学发光法）迈克生物股份有限公司33国械注准20203400497新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（直接化学发光法）迈克生物股份有限公司34国械注准20203400498新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（化学发光法）博奥赛斯（天津）生物科技有限公司35国械注准20203400499新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（化学发光法）博奥赛斯（天津）生物科技有限公司36国械注准20203400520新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）浙江东方基因生物制品股份有限公司37国械注准20203400523新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（上转发光免疫层析法）北京热景生物技术股份有限公司38国械注准20203400535新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）深圳联合医学科技有限公司39国械注准20203400536新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（量子点荧光免疫层析法）北京金豪制药股份有限公司40国械注准20203400537新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）北京纳捷诊断试剂有限公司41国械注准20203400567新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）北京华大吉比爱生物技术有限公司42国械注准20203400644新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）卡尤迪生物科技宜兴有限公司43国械注准20203400749新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）中山大学达安基因股份有限公司44国械注准20203400769新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司45国械注准20203400770新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司46国械注准20203400776新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG 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自新冠病毒爆发以来，治疗新型肺炎的药物和疫苗的研发进展备受瞩目。近期，连续传来好消息：浙江海正药业股份有限公司研制的“法维拉韦”（原名“法匹拉韦”）正式获得国家药监局批准上市、美国吉列德的“瑞德西韦”目前正在武汉金银潭医院等 11 家医院开展多中心临床试验验证、康复者的血浆抗体被用于治疗。在新药研发过程中，非常关键的一环就是评估药物引起的免疫反应，这将决定药物能否上市，能否用来治疗新型肺炎患者。免疫是人体的一种重要的生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的危险物质，如抗原、病原体（如病毒、细菌）和炎症刺激。人体免疫系统是人抵御外来感染的防线，而淋巴细胞就是这道防线的哨兵。淋巴细胞包括 B 淋巴细胞和T淋巴细胞。B 淋巴细胞亦称 B 细胞，主要功能是产生抗体，介导体液免疫应答；T 淋巴细胞亦称 T 细胞，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。这两种淋巴细胞分工明确，共同杀伤和清除入侵体内的病原体。代谢是细胞合成和分解营养物质的过程，是所有活细胞维持生存、增殖和行使功能的必须生理过程。近些年来，代谢在免疫系统中的作用被越来越多的研究者发现。代谢被视为调控免疫细胞功能与分化的主要因子。在 T 细胞分化过程中，初始 T 细胞、效应 T 细胞和记忆 T 细胞对于能量的需求各异，因此这三种 T 细胞依赖氧化磷酸化和糖酵解的能力各不相同。由此可见，代谢对于免疫系统的功能至关重要。Seahorse 技术作为检测能量代谢的金标准，在病原体感染与免疫方向有着非常广泛的应用，为科学家提供强有力的武器来研究病毒与免疫系统的攻防。1、 巴尔病毒（EBV）诱导 B 细胞进行单碳代谢，驱动 B 细胞转化EBV 可以导致多种 B 细胞淋巴瘤。人们对 EBV 感染 B 细胞后，B 细胞如何快速增殖的机制知之甚少。剑桥大学和哈佛医学院的科学家们 2019 年在 Cell Metabolism 上发表的文章为大家揭开了这个谜题[1]。他们的研究发现，EBV 会重塑 B 细胞的代谢通路，诱导 B 细胞进行单碳叶酸代谢，从而促进 B 细胞获得营养，快速增殖。EBV 上调 B 细胞对外源丝氨酸的摄入，目的是为了支持线粒体的单碳代谢（图 1 ）。他们的工作为开发新的线粒体单碳代谢抑制剂来治疗 EBV 的感染的 B 淋巴瘤提供了理论基础。图 1. Seahorse 的结果表明，丝氨酸的缺失会降低新感染细胞的呼吸作用。（E）EBV 感染 4 天的原代 B 细胞在含有丝氨酸和缺乏丝氨酸的培养基中生长，测量氧气消耗速率（OCR）。（F）根据图E的结果计算得到的代谢参数。2、 调控 CD8 阳性 T 细胞的代谢可以对抗流感病毒感染CD8 阳性 T 细胞在不同的分化阶段，由初始细胞向效应和记忆细胞转换的过程中，线粒体的呼吸是被精密调控的。代谢状态的改变可以满足不同种类 CD8 阳性 T 细胞对能量的需求，有利于它们进行增殖。美国佛蒙特大学的 Champagne 等研究者于 2016 年在 Immunity 上发表成果，揭示 MCJ 蛋白是 CD8 阳性 T 细胞线粒体呼吸的负调控因子（图 2）[2]。MCJ 缺陷的记忆 CD8 阳性 T 细胞对流感病毒的感染具有更强的保护能力。T 细胞代谢与流感病毒感染之间的关系由此可见一斑。此研究揭示 MCJ 可以作为一个治疗靶点来增加 CD8 阳性 T 细胞的反应。图 2. MCJ 缺陷的效应 CD8 阳性 T 细胞氧化磷酸化升高。野生型和 MCJ 缺陷的 CD8 阳性 T 细胞经 CD3 和 CD28 抗体激活 2 天。（A）细胞在无刺激培养基中静置 4 小时后 ATP 的浓度。（B）Seahorse 线粒体压力试验测量静置 12 小时的细胞的 OCR。（C）Seahorse 糖酵解压力试验测量细胞的 ECAR。3、 艾滋病病毒（HIV）感染和抗逆转录病毒疗法对免疫细胞功能的影响大家对 HIV 应该很熟悉了。HIV 是一种逆转录病毒，它能够攻击人体免疫系统，在慢性 HIV 感染中，免疫细胞会变得越来越不正常，最终衰竭。2019 年发表在 JCI Insight 上的一篇文章探讨了 HIV 感染以及相应的抗转录病毒疗法对免疫细胞代谢的影响[3]。德国杜伊斯堡大学 Korencak 等人的研究结果表明，在 HIV 感染时，大多数免疫细胞的呼吸作用都会大幅降低，而这种代谢的变化与慢性免疫激活和衰竭是联系在一起的。当用抗逆转录病毒疗法治疗 HIV 感染的患者时，除了 CD4 阳性 T 细胞以外，其他类型的免疫细胞的呼吸作用可以得到恢复（图 3 ）。这一最新的研究成果为评估抗病毒药物对于人体免疫功能的副作用提供了一个很好的方法。图 3. 与 HIV 阴性的患者相比，HIV 阳性、未治疗的患者和抗逆转录病毒疗法治疗的患者显示基础呼吸和最大呼吸降低。（A）Seahorse 线粒体压力测试比较 HIV 阳性、未治疗和治疗患者，以及健康人的 CD4 阳性 T 细胞的基础和最大线粒体呼吸。（B）Seahorse 糖酵解压力测试结果表明，CD4 阳性 T 细胞的糖酵解能力在三组患者中没有显著性差异。免疫代谢是一个快速增长的研究领域。代谢与免疫细胞的功能息息相关，为研究免疫生物学提供了新的策略。安捷伦 Seahorse 在免疫学研究中的应用囊括了免疫学的各个方面。参考文献1. Wang, L. W. et al. Epstein-Barr-Virus-Induced One-Carbon Metabolism Drives B Cell Transformation. Cell Metab30, 539-555 e511, doi:10.1016/j.cmet.2019.06.003 (2019).2. Champagne, D. P. et al. Fine-Tuning of CD8(+) T Cell Mitochondrial Metabolism by the Respiratory Chain Repressor MCJ Dictates Protection to Influenza Virus. Immunity44, 1299-1311, doi:10.1016/j.immuni.2016.02.018 (2016).3. Korencak, M. et al. Effect of HIV infection and antiretroviral therapy on immune cellular functions. JCI Insight4, doi:10.1172/jci.insight.126675 (2019).推荐阅读：1. 战胜新冠病毒可用之利器 | 安捷伦 Seahorse 助力抗病毒研究 https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/news_522313.htm2. 抗击新型冠状病毒，安捷伦核酸/蛋白质质量控制产品从这些方面入手！ https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/news_521879.htm 关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

注意：该试剂盒仅供研究使用，且不在中国大陆销售。最近一段时间以来，除了大家日夜关注的新冠病毒疫情以外，另外一种传染性疾病——猴痘，时不时地就会登上热搜，出现在我们的眼前。猴痘（monkeypox）听上去是不是有些陌生？我们好像只听说过牛痘cowpox，还有一个英文很像的是天花（smallpox）。没错，他们都是亲戚，都属于正痘病毒属（orthopoxvirus）这个家族。猴痘其实也并不是一种新发现的病毒，世卫组织早在1970年，于非洲刚果第一次发现有人感染猴痘。而猴痘疫情也并不是很久没有出现了，美国2003年、2021年，英国2018、 2019、2021都有报道过猴痘。2022年5月初以来，已有20多个非地方性流行国家发现多例猴痘病例，且已出现人际传播。而这次特殊的一点是，出现了明显的社区传播。由于图片容易引起不适，这里就不放图了2022年7月1日，国家卫健委印发《猴痘防控技术指南（2022年版）》。指南介绍，猴痘是由猴痘病毒感染所致的一种病毒性人兽共患病，临床表现主要为发热、皮疹、淋巴结肿大。既往接种过天花疫苗者对猴痘病毒存在一定程度的交叉保护力，据WHO的数据，天花疫苗对猴痘病毒的保护率约为85%，而未接种过天花疫苗的人群对猴痘病毒普遍易感。指南指出，疾病控制旨在实现早发现、早报告、早诊断、早调查、早处置。各级各类医疗卫生机构日常接诊发热伴出疹病人时，应注意询问病例流行病学史，同时进行病原学筛查。针对近期国际上出现人际传播的猴痘病毒，PerkinElmer公司开发了对应的病原体核酸检测试剂盒，即PKamp Monkeypox Real-time PCR RUO Kit V1，该试剂盒基于多重实时荧光PCR技术，从纯化的核酸中定性检测猴痘病毒(MPXV)的核酸（DNA）。该试剂盒与天花病毒(VARV)和其他非天花正痘病毒(NVAR) 的DNA无交叉反应。正痘病毒属包含感染人类的四种病毒：天花病毒(variola，VARV)、猴痘病毒(monkeypox，MPXV)、牛痘病毒(vaccinia，VACV)(包括水牛痘，buffalopox)和牛痘病毒(cowpox，CPXV)。该试剂盒包含阳性和阴性对照，用于质控，确保报告结果的准确。另外，还添加了用于检测内源性基因RNase P的引物/探针组合，能够有效监测人类生物样本采集和核酸提取效率。特异性：针对猴痘病毒特异性F3L基因灵敏度：20拷贝/PCR反应自动化：与PerkinElmer自动化核酸检测流程完美兼容chemagen自动化核酸提取技术PerkinElmer通过结合自动化核酸提取和RT-PCR技术方面的专业知识，在提供高质量的自动化分子检测工作流程方面表现出色，这一点在新冠病毒核酸自动化检测方面得到了充分展现。在进行分子检测时，纯化的核酸质量是至关重要的，因为降解、杂质和酶抑制剂都会对最终检测数据的质量产生重大影响。PerkinElmer旗下chemagen自动化核酸提取技术完美解决了相关的问题挑战，可以高效地对目标核酸分子进行提取纯化，适用于荧光PCR检测和基因测序分析等下游应用。推荐使用chemagic™ 360全自动核酸提取仪搭配chemagic™ Viral DNA/ RNA 300 Kit H96 (货号：CMG-1033-S) 试剂盒对猴痘病毒进行提取纯化。Chemagic 360全自动核酸提取仪JANUS G3 PCR体系构建工作站基于液体驱动的移液系统，可提供超高精度的小体积加样，从容应对PCR体系构建过程中小体积移液需求；搭配灵活的4/8通道Varispan移液机械臂，间距可调，兼容不同规格的实验耗材；移液器腔体的连接管路可实时冲洗，避免气溶胶污染或者携带污染。JANUS G3 PCR体系构建工作站全自动化机器人整合系统（ARS）可实现样本从原始管上样、核酸提取到RT-PCR检测全流程的完全无人值守，更高通量根据提取仪数量的不同可达到几十块96孔板不等的连续工作。该系统整合了存储板栈、JANUS G3液体处理工作站、chemagic™ 360全自动核酸提取仪、封膜机以及主流荧光定量PCR仪，多台设备以机器人手臂为核心由中控软件统一控制，时序编排与控制软件管理设备间的协同工作，高通量样品进入流水线工作，可实现新冠病毒核酸提取与检测全流程无人值守，不仅有效提高样本检测效率，还保护实验人员免于感染风险。全自动化机器人整合系统（ARS）试剂盒信息试剂盒货号：SDX-62669试剂盒名称：PKamp™ Monkeypox Virus Real-time PCR RUO Kit V1试剂盒组成：试剂A酶混合液阴性对照MPXV试剂B1试剂盒包装规格：192测试/盒保存条件：-25℃~-15℃保存，有效期为24个月。阳性对照阳性对照货号：SDX-62670阳性对照品名：PKamp™ Monkeypox Virus V1 Positive Controls阳性对照包装规格：20次反应猴痘并没有那么可怕，但对其仍需重视，为潜在的传播风险做好预防、检测和治疗的准备。我们也在不断努力，践行我们的口号，INNOVATING FOR A HEALTHIER WORLD

导读2023年以来，国内关于非洲猪瘟的消息就此起彼伏，从北到南覆盖众多省份，本篇将主要介绍核酸质谱技术在鉴定非洲猪瘟方面的内容……非洲猪瘟（Infection with African swine fever virus，简称：ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，简称：ASFV）感染家猪和各种野猪而引起的一种急性出血性的烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热（达40～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。非洲猪瘟疫情严重危害生猪养殖及相关产业的发展。其病程短、传播快，致死率高，控制难度极大。因保护性免疫反应的复杂性，目前尚无有效的疫苗进行预防，从而被称作养猪业的“天敌”。自1921年非洲猪瘟首次被确认起，在百年间的几次暴发，都可称为养殖业的灾难。2018年8月开始非洲猪瘟在我国广泛流行，席卷大半个中国，给我国养猪业带来的损失相当严重。而由于ASFV传播的隐蔽性和复杂性，该流行病仍未解决。尽管人类早就发现了ASF，但缺乏安全有效的疫苗。因此，寻找有效可靠的诊断方法对控制ASF疫情至关重要。非洲猪瘟病毒基因分型的意义ASFV是一种双链DNA病毒，具有24种已知基因型。该病毒由四层蛋白质外壳和一个内源性基因组组成，其结构比许多其他病毒复杂得多。此外，其多层结构对其复制和存活起着重要作用。目前非洲猪瘟病毒的主要检测方法及局限性目前针对非洲猪瘟的病原学诊断技术包括抗原检测、活病毒检测和核酸检测等。主要分为针对病毒抗原、抗体反应的免疫学技术和针对病毒DNA的核酸检测技术等。酶联免疫吸附试验（ELISA）：是当前最为常用的免疫学诊断技术，抗体必须要感染病毒达到一定程度才会出现，无法对ASFV的早期感染做出诊断。在猪感染非洲猪瘟病毒的早期，借助于聚合酶链式反应（PCR）等分子生物学技术可实现对病毒核酸的检测。具有较低的敏感性，仅属于最简单的分子生物学检测技术。病毒分离-红细胞吸附测定（HAD）：病毒分析是一种验证方法，其相应的分析（红细胞吸附分析）耗时，只能用于验证具有红细胞吸附特性的菌株。此外，它必须在生物安全三级实验室中进行，限制其应用。等温扩增技术适用于快速现场检测。然而，它的灵敏度略低于荧光PCR。由于使用多种方法和实验来检测多个基因既耗时又费力，因此使用目前可用的qPCR方法只检测到少数基因。多重PCR+核酸质谱技术进行非洲猪瘟快速分型鉴定的优势时间短：无需培养分离。极高的特异性：达95–100%。更高的灵敏度：不受病原体活性的限制，允许DNA检测受损或死亡的病原体。早期筛查：感染早期甚至症状出现之前即可识别阳性病。高通量：每天可检测上千个样本。用于ASFV检测及基因分型鉴定：如B646L基因编码的ASFV的主要衣壳蛋白p72被用作诊断流行性ASFV及其分型的首选蛋白； ASFV毒力强弱分株：如基于CD2（EP402R）的SNP和MGF505部分缺失与否，可以区分I型强毒株和弱毒株；区分野生株和疫苗株：如在制造疫苗建立基因缺失菌株的人工构建过程中，通常靶向EP402R（CD2v）、MGF和A137R等基因。东西分析再升级多重PCR+核酸质谱技术东西分析经过多年的开发，运用多重PCR+核酸质谱技术，成功开发出“非洲猪瘟病毒基因分型、毒力强弱分株和基因缺失检测试剂”。此试剂集荧光PCR和PCR测序技术为一体，采用核酸质谱独特的高重数PCR质谱SNP精细测序优势，结合自身研发的《DNA二维码扫描》专利技术，在一个PCR反应中将以下三个功能合为一体：24个基因分型：根据国标检测P72（B646L）基因区的型特异SNP位点，通过单点或多点组合，区分24种基因型；毒力强弱分株：根据农业部相关指南的靶标基因分析，发现基于CD2（EP402R）的SNP和MGF505部分缺失与否，可用三靶标区分I型强毒株和弱毒株；基因缺失：根据疫苗基因（EP402R、MGF505-3R和A137R）缺失组合鉴定疫苗基因缺失株。此试剂适用于非洲猪瘟病毒分型、毒力强弱分株和区分野生株与疫苗株基因缺失的市场需求。有助于农业、海关等部门从分子水平追溯引发非洲猪瘟疫情的病毒来源、监测ASFV在我国的分布以及流行趋势、掌握和阻断病毒潜在的传播途径及可能的传播方式，对于ASFV的有效防控具有重要意义。仪器展示Ebio Reader 3700 Plus飞行时间质谱仪操作简单无需复杂的样品前处理。性能稳定长寿命固体激光器；飞行管随环境温度、湿度的变化小，保证检测的稳定 ；高效网筛离子源，提高仪器的灵敏度 ；PIE高压脉冲电源控制，实现离子的延迟推斥，提高整体仪器的分辨能力。 软件智能基于神经网络聚合分类法的人工智能软件；拥有强大数据库，实现对菌种的实时鉴定；具备聚类分析功能，可进行T-test等数据分析；具有自建库功能，可根据用户实际情况建立自有菌种库 ；可根据用户具体需求，进行相应升级，用于疾病蛋白标志物和核酸基因分型的检测。应用范围广广泛用于临床、疾控、食品安全、农业、工业、出入境检疫等领域。往期推荐Historical articles核酸质谱之漫话一：什么是核酸质谱核酸质谱之漫话二：核酸质谱法鉴定结核病及其耐药性核酸质谱之漫话三：核酸质谱法在人乳头瘤病毒(HPV)分型检测中的应用核酸质谱之漫话四：核酸质谱法鉴定军团菌？关于我们北京东西分析仪器有限公司，拥有三十多年的分析仪器研发、制造、服务的历史，系国家高新技术企业、北京市高新技术企业、北京市“专精特新”小巨人企业、北京市“专精特新”中小企业和分析仪器制造行业国际化企业。拥有计量器具资质、医疗器械资质和安标资质等多项资质证书。多次获得BCEIA金奖和行业最具影响力奖。在行业内率先通过ISO9001国际质量体系认证，ISO14001环境管理体系认证。多个产品取得欧盟CE认证，系中华预防医学会卫检专用委员会产品信得过单位。“完美分析，辉映东西”。公司以科研技术实力为后盾，以质量管理为保证，以完善的售后服务为支撑，为用户提供高品质的分析仪器产品。

p　　王成彬教授近日通过中华医学会检验学分会公众号发文，称近期有媒体及专家反映新型冠状病毒核酸检测阳性率低、有的病例重复检测多次阴性后出现阳性结果、咽拭子标本多次检测阴性但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果、CT影像筛查出现新型冠状病毒肺炎特征但核酸检测阴性等问题。经过与临床分子诊断学专家、临床检验医学专家、临床呼吸病医学专家、临床影像医学专家交流，现提出自己的一点看法。仪器信息网摘录如下，供广大读者参考：/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/7dba3cad-31c9-43c5-a8e2-d24ce88767fa.jpg" title="8367256c-69ea-4910-bda6-20f8be03c701.jpg" alt="8367256c-69ea-4910-bda6-20f8be03c701.jpg"//pp style="text-align: center "解放军总医院医学检验中心主任 王成彬教授/ppstrong　　一、关于核酸检测在新型冠状病毒肺炎患者诊断中的应用/strong/pp　　新型冠状病毒肺炎(Novel Coronavirus Pneumonia, NCP)是由2019新型冠状病毒(2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV)感染引起的一种急性传染性疾病，而确定诊断的金标准就是能在患者体内找到2019-nCoV的存在。核酸检测就是检测2019-nCoV基因中某些特定核酸序列的存在，因此从方法学层面考虑其作为实验室诊断金标准没有任何疑问，而CT(电子计算机断层扫描)作为临床影像学筛查指标具有重要价值，但无论从早期诊断、鉴别诊断、排除诊断还是最终确诊等方面都还具有一定的局限性，更无法替代病原学诊断。其实任何疾病本身都具有分层诊断的概念，在感染性疾病的诊断中，临床表现、流行病学史、影像学、病原学等指标都发挥重要作用，但病原学诊断肯定是最精准的诊断。当然我们在重视核酸检测在病毒感染诊断中的重要价值的同时，也要客观考虑由于其方法学特点、疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、人员操作等因素都可能造成最后检测结果的假阴性或假阳性。/pp　　strong二、关于2019-nCoV核酸检测方法/strong/pp　　目前，无论是临床实验室还是疾病控制中心(CDC)实验室，普遍应用的是实时荧光RT-PCR方法，此检测方法成熟可靠，并已在常规检验和科研实验中被广泛应用。该方法是将标本中的特定核酸序列进行扩增，理论上每一次扩增后的核酸数量都是成倍增加，经过30次以上扩增后，其核酸数量达到足够通过荧光等常规方法进行检测。如果有人说目前实验室所用2019-nCoV核酸检测方法不可靠，可能是因为其对该方法原理和临床应用不了解。实时荧光RT-PCR方法从采集标本送到实验室，经过对标本的接收、处理(有时从安全考虑需要灭活处理，这点对于生物安全至关重要，但也有专家提出可能影响检测效率)、病毒核酸提取、核酸扩增、数据处理及报告，一般需要约4个小时或更长时间，如何改进核酸提取和扩增流程，缩短整个检测时间是迫切需要解决的问题。目前也有个别厂家的检测试剂检测的不是2019-nCoV核酸而是病毒进入机体后机体产生的抗体，病毒进入机体到机体产生特异性的抗体需要一段时间(窗口期)，因此检测到病毒抗体肯定滞后于检测到病毒核酸。病毒抗体检测一般用于筛查手段及流行病学调查，其敏感性、特异性、临床应用效率还需要进一步的验证和评估。/pp　　strong三、2019-nCoV核酸检测阳性率低等问题/strong/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "(一)患者的病程与病情/span/strong：NCP患者的发病都会经历一个从感染后无症状，到轻度症状出现，再到严重症状出现的过程。不同病程、不同病情患者机体中的病毒存在量可能不同(已有病毒感染，但由于在相关部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于现有方法检测不到，也称窗口期)。因此，对临床高度疑似NCP患者，应该连续采集标本进行核酸检测(这可能是临床患者多次检测阴性，阳性结果出现晚的主要原因之一)。其实任何病原学检测，都不能只根据一次阴性结果而做出排除性诊断，更不能根据核酸检测阴性而漏诊临床高度疑似的NCP患者，尤其在高发地区，在大面积流行期间。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "(二)标本采集、运输及保存/span/strong/pp　　strong1、标本采集部位/strong：很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本(这也是这两天被广泛评论的某患者咽拭子标本三次核酸检测阴性，收住院后在抢救过程中采集肺泡灌洗液标本核酸检测阳性的原因)，但下呼吸道的痰、肺泡灌洗液标本采集难度大、易引起患者喷射导致采集操作者感染风险大，一般情况不建议使用(气管切开、上呼吸机抢救病人可用)。近期发布的第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》已将标本采集“咽拭子”更新为“鼻咽拭子”。为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测。比如，用口咽拭子、鼻咽拭子同时采集标本，然后放到同一采集管中送检。对于有消化道症状的疑似患者，同时采集粪便或肛拭子进行检测。/pp　　strong2、标本采集方法/strong：近期用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。/pp　　strong3、标本运输及保存条件/strong：2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。严格来讲标本采集后应及时送到实验室(疾控中心、医院检验科、第三方实验室)，尽快完成检测。标本在常温条件下放置时间过长(几个小时、十几个小时、二十多个小时或更长时间)，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因。近期有人提出使用防病毒核酸降解标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。建议标本采集后及时送检，及时检测(4小时)。如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将其置于4℃保存(24小时)。24小时内不能检测的标本，建议于-70℃以下保存并避免反复冻融。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong(三)核酸检测试剂/strong/span/pp　　strong1、核酸提取：/strong上面已叙述过2019-nCoV核酸检测需要对所采集标本中核酸进行提取。目前临床实验室所用方法有手工提取和机器自动或半自动提取，通常情况下机器自动提取方法的效率要优于手工提取。而不同提取试剂和手工提取流程的掌控对最后提取到的核酸数量和质量可能存在差别，而从标本中所提取出的核酸数量和质量对于检测方法中下一个步骤核酸扩增至关重要，从而也就直接影响最后的检测结果。/pp　　strong2、核酸扩增试剂：/strong由于不同厂家试剂研发是根据2019-nCoV核酸Orf1ab、N、E、S等基因的特异性序列设计的扩增探针(不同厂家的扩增试剂可分为1个、2个或3个靶标基因位点检测试剂)，试剂中酶、金属离子等成分与质量的差异，都可能影响扩增效率和最后检测结果的灵敏度。/pp　　strong3、试剂应用的特殊性：/strong由于导致本次疫情的是2019-nCoV，加上其突发性，试剂生产商只能根据有限公开的病毒核酸研究数据开展试剂研发，国家相关部门最早推荐了一些厂家的检测产品，后来又审批了一些厂家检测试剂的注册申请。目前开展2019-nCoV检测试剂研发生产的厂家已超过百家，正常情况下一个临床检测试剂产品从研发到应用需要通过一系列的临床验证与评估，但由于本次疫情的特殊性，时间的紧迫性，所研发试剂来不及完成正常流程，特别是无法得到一定数量临床患者标本的验证。对于临床某些高度疑似病例，或检测结果难以确定病例，建议用2种以上试剂进行检测、验证。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "(四)核酸扩增仪器/span/strong：目前不同实验室用于2019-nCoV核酸检测的仪器(PCR仪或核酸扩增仪)种类有所不同，价格上从几万、十几万、数十上百万不等，不同的设备对检测过程中不同温度的控制精度、对荧光信号检测敏感度等不同，从而可能导致检测结果的差异。/pp　　以上是对近期媒体及专家反映2019-nCoV核酸检测阳性率低等问题其可能原因的一些分析，由此可以理解，目前2019-nCoV核酸检测中各种原因引起的这样或那样的问题是现实存在的，也是难以避免的。我们不能因为这些问题的存在而普遍怀疑、甚至否定目前实验室2019-nCoV核酸检测结果。目前2019-nCoV核酸检测大多在三级医院或CDC二级以上实验室开展，这些实验室的管理水平、技术人员素质、检验设备的先进程度、检验过程的质量控制措施等方面可以说大都是处于国际先进水平，而各实验室也在通过工作开展中的回顾总结或通过实验室之间的经验交流，不断改进、完善2019-nCoV核酸检测方法。/pp　　近期中华医学会检验医学分会也组织了相关方面专家对2019-nCoV核酸检测进行了探讨，并出台了2019-nCoV核酸检测相关专家共识，同时一些新的基因检测平台也在不断研发。随着基因测序、数字PCR、RT-PCR毛细管电泳等技术的应用(国家卫健委发布的“新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案--试行第五版 修正版”中已将病毒基因测序与实时荧光RT-PCR核酸检测列为实验室确诊方法)，2019-nCoV核酸检测中的问题肯定会得到持续改进。/ppspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "　　strong附：/strong/span/ppspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "　　王成彬，解放军总医院医学检验中心主任，主任医师，教授，博士研究生导师，北京理工大学、中南大学、温州医科大学、南开大学兼职教授(博士研究生导师) 现担任中华医学分会副主任委员，北京医学会检验医学分会主任委员等。/span/ppspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "　　近年来还从事进口血细胞分析仪配套试剂和POCT方法学研究。作为课题负责人先后承担军队医药卫生基金、国家863、国家自然科学基金等课题研究。获北京市科技进步二等奖2项，军队科技进步二等奖1项，三等奖3项，中华医学科技三等奖一项。在国内、外期刊发表学术论文70余篇，其中SCI收录论文9篇，主编专著2部，主译专著1部。/span/ppspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "strong style="white-space: normal "span style="color: rgb(255, 0, 0) "　　/span/stronga href="https://www.instrument.com.cn/zt/xxgzbd" target="_blank" title="点击进入仪器信息网特别专题：“抗击新冠疫情 仪器人在行动”" style="white-space: normal color: rgb(255, 0, 0) "strong点击进入仪器信息网特别专题：“抗击新冠疫情 仪器人在行动”/strong/aspan/span/span/p

一、标准编号及标准名称GB/T 40982—2021《新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求》 GB/T 40966—2021《新型冠状病毒抗原检测试剂盒质量评价要求》 GB/T 40983—2021《新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒质量评价要求》 GB/T 40984—2021《新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒质量评价要求》 GB/T 40999—2021《新型冠状病毒抗体检测试剂盒质量评价要求》 二、标准制定背景新型冠状病毒疫情的突然暴发，给国家防控形势带来严峻挑战。对新冠病毒的快速、准确检测是疫情防控最为关键的一环。疫情初期，很多体外诊断产品制造商都迅速开展了各类型新冠检测试剂研制和注册；我国药监部门也紧急启动了新冠产品应急审批工作，这些都为我国乃至全球的疫情防控做出了突出贡献。鉴于国内外尚没有针对这些产品质量要求的标准化文件，市场监管总局（标准委）应急立项了5项新冠病毒相关检测试剂盒质量标准项目，以规范新冠病毒检测试剂盒的生产和质量评价要求。这5项标准化文件覆盖了核酸检测、抗体检测、抗原检测等新冠病毒检测的主要类型，针对不同方法学，提出了相应的质量要求。这5项标准是我国新冠疫情防控应急标准体系中重要的组成部分，这些标准的制定旨在确保相关检测试剂盒质量的稳定可靠，为我国疫情防控提供坚实的技术基础。 三、标准主要内容上述5项标准都是推荐性国家标准，分别规定了关于新型冠状病毒的核酸检测试剂盒、抗原检测试剂盒、IgG抗体检测试剂盒、IgM抗体检测试剂盒和抗体检测试剂盒质量评价要求。在标准制定过程中，标准起草组对相关试剂盒产品及其检测原理、样本类型和质量要求等进行了充分调研，研制了相关质量评价和质量控制用参考样品，并对各项性能进行充分验证和广泛地意见征集，最终形成相应的产品质量标准，规范了新冠检测试剂盒的质量要求，为快速、准确的实验室诊断提供了质量保证。 GB/T 40982—2021《新型冠状病毒核酸检测试剂盒质量评价要求》规定了新型冠状病毒核酸检测试剂盒的质量评价、试验方法、标签和说明书、包装、运输和贮存的要求。适用于定性检测呼吸道分泌物等样本中的新型冠状病毒核酸的核酸扩增检测试剂盒的质量评价。 GB/T 40966—2021《新型冠状病毒抗原检测试剂盒质量评价要求》给出了新型冠状病毒抗原检测试剂盒的质量评价、试验方法、标签和说明书、包装、运输和贮存的要求。适用于以上呼吸道样本、血液样本和下呼吸道样本为样本类型的新型冠状病毒抗原检测试剂盒的质量评价。 GB/T 40983—2021《新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒质量评价要求》规定了新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒的质量评价要求、试验方法、标签和说明书、包装、运输和贮存。适用于以标记免疫法原理对人血清、血浆和全血中新型冠状病毒特异性IgG抗体进行体外定性检测的试剂盒。 GB/T 40984—2021《新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒质量评价要求》规定了新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒的质量评价要求、试验方法、标签和说明书、包装、运输和贮存。适用于以标记免疫法原理对人血清、血浆和全血中新型冠状病毒特异性IgM抗体进行体外定性检测的试剂盒。 GB/T 40999—2021《新型冠状病毒抗体检测试剂盒质量评价要求》规定了新型冠状病毒（总）抗体检测试剂盒的质量评价涉及的质量要求、试验方法、标签和说明书、包装、运输和贮存。适用于以标记免疫法原理对人血清、血浆和全血中新型冠状病毒特异性抗体(含IgM、IgG等抗体种类)进行体外定性检测的试剂盒。四、标准实施意义5项标准对新冠病毒检测试剂盒的产品性能提出了明确的要求，对于我国体外诊断制造商进行相关研发和产品升级、对于国内外相关产品在中国注册上市有重要的指导作用。这些标准的制定，也为我国新冠检测类体外诊断医疗器械的质量检验和监管、以及使用方都提供了可参考的技术依据。这将在继续保持我国有效抗疫的伟大成就、并继续推动我国为全球提供高质量新冠检测产品方面发挥重要作用。

由新型冠状病毒引起的新冠肺炎疫情仍在继续，严重威胁着全球公众健康，截至2021年12月，全球新冠肺炎确诊患者已累计超过2.8亿人次。目前广泛使用的基于聚合链式反应（PCR）和免疫分析的检测方法存在假阴性和诊断延迟的问题。因此，迫切需要高准确度、快速高通量的新冠肺炎检测方法用于大规模人群筛查。河北师范大学、军事医学科学院、融智生物的研究团队合作发展了一种基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的检测方法。该方法使用融智生物QuanNUA核酸质谱系统，可同时完成7种冠状病毒联检，且具备灵敏度高（只需1μL样品）、通量高（可在30min内快速处理384个样品）、成本低、样本消耗量少的特点，同时不需要苛刻、洁净的检测环境，操作也相对简便。因此，该方法在大规模人群筛查、常规检测和诊断应用方面具有巨大潜力。相关论文已经发表在COVID期刊上。文章摘要翻译：人类冠状病毒（HCoV）与一系列呼吸道症状有关。严重急性呼吸综合征（SARS）-CoV、中东呼吸综合征和SARS-CoV-2的出现对人类健康构成重大威胁。本研究开发了一种将多重PCR与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合的方法（HCoV-MS），以同时检测和区分7种人类冠状病毒（HCoV）。HCoV-MS方法具有较高的特异性和灵敏度，检测限为1-5拷贝/反应。为了验证该方法，在研究中对163份临床样本进行了检测，结果与实时PCR结果一致。研究结果表明：HCoV-MS和实时PCR的检测灵敏度相当；HCoV-MS法是一种灵敏的分析方法，只需1μL样品；HCoV-MS是一种高通量方法，可以在30分钟内快速处理384个样品。在本研究的最后，作者建议使用这种方法来补充大规模筛选研究中的实时PCR。