双缩脲试剂检测蛋白质原理

p style="TEXT-ALIGN: center"img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/noimg/25452d8d-5c44-49d3-96f1-7743a7eb2248.jpg"//pp　　日前，江苏科技大学蚕业研究所马琳博士的光诱导的自组装机理在传感器阵列中的应用研究取得了重要进展。该研究利用光诱导的碲化镉(CdTe)量子点的自组装现象，同时完成了10种蛋白质的可视化识别区分。相关研究成果以封面论文形式发表在英国皇家化学学会期刊《材料化学杂志B》上。/pp　　研究人员以两种不同发射波长的碲化镉量子点为传感单元，基于光引发的自组装原理，构建了多通道荧光传感器阵列，根据碲化镉量子点荧光颜色及强度的变化，实现了10种不同种类蛋白质的同步可视化区分检测。该传感器阵列构建简单，不需要昂贵的专业仪器或技术人员，在一台单一激发波长的紫外灯辅助下，即可肉眼完成蛋白质的识别检测，省时，省钱，提高工效，非常适用于经济欠发达地区。/pp　　该传感器同样可以识别变性后的10种蛋白质与人尿液中的8种蛋白质，证明其在大分子空间构象识别及医学临床检测中具有一定应用前景。此外，这项研发成果还可以实现多种生化物质的同步快速检测，可以运用到糖类、金属离子等的检测中。/pp/p

pspan style="font-family:楷体, 楷体_GB2312, SimKai"氮/蛋白质检测是化学实验室最繁琐的检测项之一。在食品、肥料、土壤、谷物、化工等诸多行业，氮元素的检测工作日益增多，人工成本也在上涨。为此，中国首款自动化程度高、效率更快的杜马斯定氮仪“应势而生”。海能D100杜马斯定氮仪将样品检测时间从2小时缩短至3分钟！/span/pp style="text-align: center "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(247, 150, 70) "更多介绍请查看视频/span/ppbr//pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=A0E875594A7FC5CF9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=2BE2CA2D6C183770&playertype=1" type="text/javascript"/scriptpspan style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(247, 150, 70) "br//span/ppbr//ppspan style="font-family: 微软雅黑, " microsoft=""海能D100定氮仪是基于杜马斯燃烧法研制开发的一款快速高效、精确、低成本、无污染的氮/蛋白质含量的测定仪器。其原理是将样品在900℃~1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生NOx、COx、Hspan style="font-size: 11px "2/spanO以及HX等气体，其中的干扰成分COx、Hspan style="font-size: 12px "2/spanO以及HX被吸收剂所吸收，剩余的氮氧化物被还原剂全部还原成分子氮，随后分子氮的含量被热导检测器检测 。/span/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(247, 150, 70) "是优势，更是用户所需!/span/strong/pp　　1、快速/pp　　无需复杂的样品前处理，单个样品测试时间仅需3-4分钟即可得出分析结果。/pp　　2、准确/pp　　高灵敏度的TCD检测器，能够直接快速的分析样品中所有形式的氮，氮元素被完全检测，测试结果更精准 。/pp　　3、自动/pp　　内置120位自动进样器，实现高通量连续自动进样，整个过程无需人为干预，大大降低了整个实验的人工成本，同时测定效率比传统方法提高数倍。/pp　　4、环保/pp　　无需添加腐蚀性化学试剂，无废液、无有害气体排放。/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(247, 150, 70) "应用是最终目的!/span/strong/pp　　杜马斯定氮仪广泛应用在食品、药品、谷物、乳制品、肥料、车用尿素、饲料、植物、烟草等相关产品和有机物中氮/蛋白质的测量领域。同时拥有方法上的诸多优势，未来使用杜马斯方法测定样品中的含氮量会得到更广泛的应用。/p

测定蛋白质浓度的方法有很多，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等 ，今天小编以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。UV法这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算 通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D，其中d为测定OD值比色杯的厚度，D为溶液的稀释倍数BCA法原理：BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）提供一个简单，快捷，兼容去污剂的方法，准确定量总蛋白。成分试剂 A100 mL试剂 B2 mL标准蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL保存条件 运输温度：室温（标准蛋白 4～8 ℃ 运输）保存温度：室温（标准蛋白 -20 ℃ 保存）有效日期：12 个月使用方法方法一：96 孔板1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充分混匀。2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。6. 制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。方法二：试管法1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。4. 将样品与标准品在 562 nm 波长下测定吸光度。考马斯亮蓝法实验原理：考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。突出优点（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最di蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。试剂与器材1、试剂 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL。2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。（2）待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。3、器材 试管 1.5×15 cm（×6），试管架，移液管管 0.5 mL（×2） 1 mL（×2） 5 mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作。摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对照，在 595 nm 处比色。绘制标准曲线：以 A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。注意事项（1）在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最we定的。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。