微生物病原菌定量检测

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长期以来，人们对于病原菌耐药的认识基本上停留在特定病原菌对特定抗生素的耐药机制，以及特定抗生素对病原菌的抑菌机理上。然而相关研究表明，在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化，这种关系就是抗生素与病原菌之间的量化关系。 有关抗生素与病原菌之间量化关系研究的历史不长，而对其集中、深入的研究也只是近几年才展开的。在发达国家，特别是对抗生素使用严格控制的北欧国家此类研究开展较多，而在发展中国家则基本为空白。造成这一领域研究起步晚，发展不均衡主要有两方面因素。 首先，相关研究需要通过一定范围内大样本的调查，收集、处理各种病原菌和抗生素使用的相关数据。在发达国家，有关病原菌耐药和抗生素使用的监测机构健全，可以方便地获取和处理大量的相关数据，加之有流行病学、统计学、药理学、微生物学以及临床医学等多学科的协作，可以深入、细致、及时地研究抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系。 而在发展中国家，相关的监测机构不健全。以国内为例，目前各级医疗机构有关病原菌耐药的数据和抗生素使用的数据，由不同的职能科室、部门管理，信息交流困难，导致了我们在这一领域中的研究远远落后于发达国家。 第二，不同抗生素剂量单位以及常用剂量差别很大，在大范围研究中无法比较和叠加。早期相关研究只能以抗生素的使用率和抗生素的费用消耗为指标，不能准确反映抗生素的实际使用情况。为解决这一难题，人们用成人每日常用剂量作为标准剂量，将不同抗生素的消耗量换算为统一标准单位，并命名为每日约定剂量（defined daily doses，DDD），以使用的DDD数表示抗生素的消耗量。每一种抗生素消耗量换算成DDD后可以比较和叠加。WHO于1996年推荐采用此方法来研究、监测抗生素的使用情况。正是在这一标准建立后，相关研究在短时间内取得了很大进展。这一领域的研究大致分为以下二类： 1、针对社区居民的大范围研究 此类研究的对象多为一个地区、一个国家，甚至可以是对多个国家的超大规模研究。研究结果对于指导相关国家和地区制定、修改控制抗生素使用的法规，检验相关控制措施的有效性具有重要指导意义。通过不同国家的对比研究还可以探讨自然条件、环境因素、社会因素、经济发展水平对抗生素使用与病原菌耐药水平之间量化关系的影响。 瑞典在1994年设立专门机构，率先启动了一项针对抗生素使用与病原菌耐药的全国性系统工程STRAMA，采取有针对性的措施消除抗生素不合理的使用，若干年后，瑞典抗生素的消耗量减少了22%，病原菌耐药水平也明显降低。 2、针对医疗机构的小范围研究 此类研究主要关注不同医院、不同病区、不同基础疾病条件下抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系，发现并证实了多种抗生素的消耗量与常见病原菌的感染率和耐药率之间存在密切的关系。 此类研究的重点通常是临床常见、对患者威胁最大的病原菌，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎球菌和肠球菌，以及临床重点关注的抗生素，如万古霉素、大环内酯类抗生素和第三代头孢菌素等。其研究结果对于指导临床抗感染治疗即控制病原菌耐药水平的上升具有重要实用价值。 一项研究采用多元回归的方法，分析了以色列一家医院6个内科病区抗生素使用与病原菌耐药的数据，结果表明，这些病区阿米卡星和第3代头孢菌素的消耗量与临床耐药菌感染率密切相关。 目前只有为数不多的研究通过改变临床抗生素的使用，降低病原菌的耐药水平和耐药菌的感染率，可以说是这一领域研究的前沿，也是这一领域探索者的希望所在和最终目的。 Landman等通过减少医院中头孢菌素、亚胺培南、克林霉素和万古霉素的使用，增加含β-内酰胺酶抑制剂抗生素的使用，成功地降低了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐头孢他啶肺炎克雷伯菌的感染率。 近期研究还发现，临床增加氨苄西林/舒巴坦的使用量可以明显降低奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的耐药水平；而增加头孢吡肟的使用量可以降低MRSA的感染率。 有研究者曾对其所在医院烧伤病区抗生素使用和病原菌耐药的相关数据进行了统计分析，发现含β内酰胺酶抑制剂类抗生素的使用量与金黄色葡萄球菌耐药水平呈负相关。此外，他们目前已累积了该院烧伤病区8年来临床抗生素使用和病原菌耐药的全部数据，并建成了查询方便的数据库，为进一步进深入研究奠定了基础。 总之，抗生素使用与病原菌结构和耐药水平之间量化关系的研究对于指导临床抗感染治疗、合理使用抗生素，以及制定控制抗生素使用的相关法规具有重要意义，但目前在这一领域有许多方面有待进一步探索。目前国内有关抗生素和病原菌的相关信息的交流存在诸多障碍，这需要包括医疗机构管理者、相关专家以及临床医师共同努力，加强信息交流，通过深入研究抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系，为指导临床抗感染治疗，降低病原菌的耐药水平提供具有实际应用价值的信息。

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据美国农业部官方网站消息，美国农业部食品安全与检验局（FSIS）于近日出台了一套有关减少即食食品中的病原菌的指导方案，以帮助小型肉类与禽类产品制造商生产出更高质量的产品。 鉴于2010年的多起与疾病相关的召回事件，FSIS改善了即食肉禽类产品指南，着重强调了造成召回的原因。某些召回事件发生的原因是，产品加工后有病原菌进入其中。该套方案的出台有助于减少这些情况下的污染，例如烹调或调制完后加入酱油或者香料的过程。 该套法规并非针对肉禽类产品生产厂家的强制要求，而是为了帮助小型制造商更好的遵守FSIS现行法规。FSIS将在重要指南文件中公布此套指导方案。

环境监测是了解环境现状的重要手段，它包括环境化学分析、物理测定和生物监测三个部分。生物监测是一个利用生物对环境污染所发出的各种信息来判断环境污染状况的过程。生物长期生活于自然环境中，不仅能够对多种污染作出综合反映，也能对污染的历史状况作出反映。因此，生物监测取得的结果具有重要的参考价值。微生物监测是生物监测重要组成部分具有其独特的作用。 一、水体污染的微生物监测 （一）、粪便污染指示菌 人畜粪便中携带有大量致病性微生物。如果将这类污染物排人水体，就可能引起各种肠道疾病和某些传染病的暴发流行。因此，对水体的粪便污染状况进行监测具有重要意义。直接检测各种病原菌十分烦琐和耗时耗费。此外，由于水中的致病菌少，直接检测也很困难，即使检测结果阴性，也不能保证水中不含致病微生物。因此，在水质卫生学检查中，通常采用易检出的肠道细菌作为指示菌，取代对病原菌的直接检测。若水样中检出这类指示菌，即认为水体曾受粪便污染，有可能存在致病菌。检测到的指示菌越多，污染越严重。肠道细菌中的大肠菌群是普遍采用的粪便指示菌。在水质卫生学检查的结果中，常用“大肠菌群指数”和“大肠菌群值”作指标。大肠菌群指数是指每 L 水中所含的大肠菌群细菌的个数。大肠菌群值则是指检出一个大肠菌群细菌的最少水样量（ ml 数）。两者间的关系可表示为：大肠菌群值 =1000 ／大肠菌群指数我国饮用水的质量标准规定，大肠菌群指数不得大于 3 ，大肠菌群值不得小于 333ml 。

2011年4月25日，据美国农业部官方网站消息，美国农业部食品安全与检验局（FSIS）出台一套有关减少即食食品中的病原菌的指导方案，以帮助小型肉类与禽类产品制造商生产出更高质量的产品。鉴于2010年的多起与疾病相关的召回事件，FSIS改善了即食肉禽类产品指南，着重强调了造成召回的原因。某些召回事件发生的原因是，产品加工后有病原菌进入其中。这套方案的出台有助于减少这些情况下的污染，例如烹调或调制完后加入酱油或者香料的过程。这套法规并非针对肉禽类产品生产厂家的强制要求，而是为了帮助小型制造商更好的遵守FSIS现行法规。FSIS将在重要指南文件中公布这套指导方案。更多内容请见：http://www.fsis.usda.gov/News_&_Events/NR_042511_01/index.asp。

植物病原菌毒素的种类、作用机理和应用前景

[font=宋体]随着生物技术的飞速发展，生物安全问题日益凸显。为了确保人类健康与环境安全，生物安全检测服务应运而生，成为一道重要的防线。本文将介绍生物安全检测服务的背景、意义、技术方法和应用领域，并探讨其发展趋势和前景。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、背景与意义[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生物安全检测服务旨在预防、检测和监控生物危害，保护人类健康和环境安全。随着生物技术的广泛应用，新型病原菌、转基因生物等不断涌现，给人类带来潜在风险。因此，生物安全检测服务对于防范和控制生物风险具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、技术方法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]分子生物学技术：利用分子生物学技术对病原菌进行基因水平检测，包括基因芯片、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]等。这些技术可快速、准确地检测出病原菌，为防控措施提供科学依据。[/font][/font][font=宋体]免疫学技术：通过抗体检测和抗原检测，对病原菌进行特异性识别，具有灵敏度高、操作简便等优点。[/font][font=宋体]生物传感器技术：利用生物传感器对生物危害进行实时监测，具有快速、便捷的优点，可实现连续监测和自动化分析。[/font][font=宋体]数据分析技术：通过对大量数据的收集和分析，发现病原菌的传播规律和预测未来趋势，为防控决策提供数据支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、应用领域[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]食品工业：在食品生产过程中，对病原菌进行严格检测，确保食品安全。[/font][font=宋体]医学领域：在医疗过程中，对病原菌进行监测和防控，保障医护人员和患者的健康。[/font][font=宋体]环境监测：对自然环境和养殖场等重点区域进行病原菌监测，防止病原菌扩散。[/font][font=宋体]进出口检验检疫：对进出口货物进行病原菌检测，防止外来病原菌入侵。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、发展趋势和前景[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着科技的不断进步，生物安全检测服务将朝着更加快速、准确、自动化的方向发展。未来，人工智能和大数据技术的应用将进一步优化生物安全检测服务体系，提高监测预警能力。同时，随着全球气候变化和生态系统的改变，新型病原菌的出现和传播将更加频繁，因此生物安全检测服务还需不断加强和完善，以应对未来挑战。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了经[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]认证的实验室，并且拥有生物安全二级实验室，已在北京市备案，该实验室严格按照[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GLP[/font][font=宋体]规范进行设计及管理。团队成员具备扎实的生物医学、药学等相关专业背景，对中国[/font][font=Calibri]NMPA[/font][font=宋体]、美国[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ICH[/font][font=宋体]等的当今要求和未来趋势具有深刻的理解，可根据客户产品提供最佳的病毒清除验证和细胞库检测的方案。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/biosafety-testing-services[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，[url=https://cn.sinobiological.com/services/biosafety-testing-services][b]生物安全检测服务[/b][/url]是保障人类健康与环境安全的重要防线。通过采用先进的科学技术和方法，我们能够更加有效地预防、检测和监控生物危害。随着科技的进步和社会的发展，我们相信生物安全检测服务将会在保障人类健康和环境安全方面发挥更加重要的作用。[/font]

水产养殖病原微生物的分子检测注：全文见附件。有用到的鼓掌不要都做伸手党

国家“863计划”现代农业技术领域研制了一批海水鱼重要病原菌高效疫苗，4种疫苗进行了安全性初步评价，2种基因重组疫苗已获得农业部批准进入安全性评价阶段，有望成为我国海水鱼病害的新型治疗药物。　　构建了包括迟钝爱德华氏菌基因缺失减毒活疫苗、拟态弧菌基因缺失减毒活疫苗、嗜水气单胞菌溶血素ISCOMs疫苗等6种具有良好免疫保护效果的高效疫苗；建立了3种疫苗的中试生产技术工艺；对鳗弧菌基因缺失减毒活疫苗、创伤弧菌及嗜水气单胞菌ISCOMs疫苗、海水鱼哈维氏弧菌病重组外膜蛋白疫苗等4种疫苗进行了安全性评价，初步结果显示四种疫苗具有良好的安全性、稳定性；鳗弧菌基因缺失减毒活疫苗、海水鱼哈维氏弧菌病重组外膜蛋白疫苗的转基因生物安全评价中间试验已获得农业部批准，有望成为我国海水鱼病害的新型治疗药物。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱, 作为一种新兴的蛋白质组学检测技术, 现已广泛应用于生命科学及相关领域。同时作为一项新兴的微生物鉴定技术, 受到了国内外的广泛关注。与传统的生化表型鉴定方法和分子生物学方法相比, MALDI-TOF MS具有操作简单、快速、准确和经济的特点。早在1975年, ANHALT等[1]利用质谱仪结合高温裂解技术第1次完成了细菌的鉴定, 从此拉开了质谱鉴定细菌的“ 序幕” 。随着质谱检测技术的不断完善和发展, 近年来, MALDI-TOF MS已经成功应用于微生物的鉴定, 显示了其在细菌、酵母菌等鉴定方面均具有良好的应用价值。众多的研究表明, MALDI-TOF MS技术对培养出的纯菌落进行菌种鉴定具有很高的稳定性及准确性, 对常见细菌和酵母菌的属的鉴定率能达到97%~99%, 种的鉴定率也能达到85%~97% 另外, MALDI-TOF MS大大缩短了细菌鉴定的时间, 而且其成本也较常规鉴定方法低[2, 3]。除此之外, MALDI-TOF MS已经能够成功地用于部分微生物亚种水平的鉴定和细菌耐药性的检测, 但这种方法在大多数情况下是应用于培养出的纯菌落的鉴定[3]。　　如果能够从临床样本中直接检测细菌/真菌, 突破细菌/真菌培养阳性率低、培养时间长的瓶颈, 为细菌/真菌感染性疾病的诊疗提供更快、更准确的病原学依据, 将对临床及时控制细菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。国内外学者已尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测, 并取得了显著的进展。本文就MALDI-TOF MS技术在临床样本的直接检测应用作一综述。一、MALDI-TOF MS检测原理　　MALDI-TOF MS技术用于微生物鉴定的实质就是检测具有属、种或亚型特异性的生物标志的质量信号, 主要是微生物菌体内高丰度、表达稳定和进化保守的核糖体蛋白。MALDI-TOF MS 仪器主要由基质辅助激光解吸离子源(MALDI)和飞行时间质量检测器(TOF)两部分组成。MALDI的原理是用一定强度的激光照射样本与基质形成的共结晶薄膜, 基质从激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使样本分解吸附, 基质和样本之间发生电荷转移从而使样本分子发生电离 TOF的原理是带有电荷的样本分子在电场作用下加速飞过飞行管道, 因为离子的质荷比与离子的飞行时间呈正比, 所以不同质量的离子因达到检测器的飞行时间不同而被检测, 以离子峰为纵坐标、离子质荷比为横坐标形成特征性的质量图谱。将不同种属微生物经MALDI-TOF分析所形成的质量图谱与数据库中的参考图谱进行比较, 从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[2]。二、MALDI-TOF MS直接检测临床样本的流程　　临床样本直接检测的流程主要包括3个部分:临床样本的预处理、样本上机检测和对比蛋白质指纹图谱数据库得出鉴定结果。由于目前报道最多的临床样本是阳性血培养瓶和中段尿样本, 下面将以这二者为例介绍其直接检测的流程, 其它临床样本的检测流程与之类似。(一)临床样本预处理　　MALDI-TOF MS直接用于临床样本的检测有2个基本的要求:(1)临床样本中细菌的量。为了得到准确的鉴定图谱, MALDI-TOF MS技术对置于靶板上的细菌的最低检测限约为(1× 104)~(1× 106)cfu/mL。若要直接检测拟似血流感染的血液样本以及拟似泌尿系统感染的中段尿等临床样本中的病原菌, 首先必须富集细菌 (2)临床样本的质。由于血液和血培养瓶中的大分子成分如血红蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白细胞等有机成分会干扰细菌的谱峰, 所以直接检测前需要采取预处理措施去除这些干扰因素。1.阳性血培养瓶直接检测 直接检测阳性血培养瓶的细菌浓度常常需要1× 107 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的细菌量常常很低(最低可 1~10 cfu/mL), 因此对血样本的直接检测需要一个增菌的过程, 即采用血培养瓶增菌。目前已报道的阳性血培养病原菌预处理程序各不相同, 但预处理过程主要包含了以下2个步骤:(1)将细菌从血细胞中分离出来。先应用温和去污剂(如吐温-80、十二磺基硫酸钠、皂素等)将血液中的血细胞溶解, 然后通过不同的流程(离心、洗涤)去除其它的干扰因素, 纯化要鉴定的细菌样本 (2)将菌体中的蛋白质抽提出来。最常用的是混合溶剂处理法, 使用甲酸/乙腈溶液对样本进行处理来抽提蛋白, 利用2种溶剂的混合作用将菌体表面的蛋白和存在于细胞内的低相对分子质量的高丰度蛋白提取出来, 实现对菌株的鉴定。虽然至今尚没有规范化的处理程序, 不过目前市场上已有商品化的阳性血培养瓶预处理试剂盒Sepsityper kit(Bruker)可以提高鉴定分数和鉴定准确率, 但是花费比较高, 处理程序也费时较长[5]。另外, HAMMARSTR? M等[6]建立了一种基于声学捕捉和集成选择性富集目标(integrated selective enrichment target, ISET)的新方法用于富集样本中的细菌, 快速、准确并且简化了人工操作, 有望替代传统的以离心为基础的分离方法。2.中段尿样本 要取得一个较高的鉴定成功率, 直接检测中段尿样本中病原菌至少需要的细菌数量是1× 105 cfu/mL[7, 8]。对尿样本的预处理程序较为简单, 主要有下面几个步骤:低速离心去除白细胞, 高速离心收集细菌, 沉淀, 经过洗涤、离心之后进行蛋白质的提取(常用的是甲酸、乙腈), 经高速离心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室温下干燥后即可进行检测。

(二)泌尿系统感染病原菌的快速检测　　因泌尿系统感染的中段尿样本中的细菌量相对很高, 中段尿样本也是MALDI-TOF MS直接检测的理想选择[30], 并且常常是单一菌种感染, 避免了MALDI-TOF MS在鉴定混合菌样本的不足[31]。泌尿系统感染是人类常见的感染性疾病, 临床泌尿系统感染最常见的病原菌为大肠埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它肠杆菌科细菌, 如奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS对尿液样本中这些细菌的鉴定效率和准确率要优于传统鉴定方法和其他鉴定系统[7, 32, 33]。1.鉴定效能 FERREIRA等[7]选取尿液中细菌大于1× 105 cfu/mL的样本进行直接的MALDI-TOF MS鉴定, 结果显示尿液样本经过差速离心法处理后, 可将91.8%的菌株鉴定到种、92.7%的菌株鉴定到属的水平。　　杨溪等[33]使用MALDI-TOF MS技术对临床收集到的1 040份尿液样本进行直接快速检测, 共鉴定出含细菌的样本526份, 其中尿细菌培养菌落数≥ 1× 105 cfu/mL, 培养出1种/2种菌的尿液样本MALDI-TOF MS的直接鉴定率分别为92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接检测法的鉴定结果与尿细菌培养法鉴定出的细菌菌种一致, 符合率为100%。2.与流式细胞术联用 怀疑泌尿系统感染的尿液样本一般经离心后取沉淀直接进行检测, 但考虑到临床上有60%~80%的尿液样本是阴性的, 为了减少分析的时间和人工的工作量, 有学者将MALDI-TOF MS与流式细胞术联用检测, 用流式细胞术筛除细菌数量不足的尿液样本, 而MALDI-TOF MS用来检测筛选结果为阳性的尿液样本, 取得了良好的鉴定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLó 等[34]建立了这样一种微生物鉴定程序:先用流式细胞仪进行菌落计数筛查出单一细菌阳性的尿液样本, 然后再进行MALDI-TOF MS检测, 发现细菌数在1× 107 cfu/mL时是足够的细菌浓度, 有87.5%的敏感性, 而细菌数在(1× 105)~(1× 107)cfu/mL之间的样本经过4 h的预增菌, 得到用于分析的足够的细菌数量后, 可以达到91.7%的敏感性。3.细菌含量对鉴定结果的影响 由于中段尿中病原菌数 2.0), 而随着样本中细菌数的降低, 鉴定成功的比例和鉴定分数也在下降, 当菌落数 1× 104 cfu/mL的中段尿样本, 应用MALDI-TOF MS直接检测即可取得满意的鉴定效果。4.中段尿样本直接检测的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一种透析过滤的方法, 通过脱盐、分馏、富集等步骤对100例阳性尿液样本在MALDI-TOF MS分析前进行了预处理, 实验结果表明这种预处理方法能够正确地鉴定阳性尿液样本, 并且正确分类了所有临床相关菌尿症的阴性尿液样本, 包括一组污染的尿液样本和一组临床上无关紧要的定植菌。敏感性和特异性分别是67%和100%。5.中段尿样本直接检测的不足之处 与直接检测培养阳性的血样本一样, 对于含有2种或2种以上细菌感染的中段尿样本, MALDI-TOF MS常常表现为鉴定能力不足[33, 35] 尿液蛋白质如α -防御素[8]会造成鉴定结果不能正确匹配数据库 对酵母菌的鉴定能力也有待于进一步提高 对于核糖体蛋白序列差异很小的菌种也常常不能区分。(三)其它无菌体液　　MALDI-TOF MS直接检测和鉴定其它无菌体液样本如脑脊液、胸腹水和关节液等中细菌的报道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次报道了通过直接将脑脊液样本离心取上清直接进行MALDI-TOF MS分析, 肺炎链球菌性脑膜炎可以在30 min内做出诊断, 为后续治疗方案的选择和结果的解释提供了重要的参考依据。SEGAWA等[38]也用同样的方法对一例肺炎克雷伯菌引起的脑膜炎做出了诊断, 但同时也指出在实际应用中能获得的样本量少, 细菌数少可能会限制它的应用。另外, 还可将无菌体液样本转移到血培养瓶中进行孵育, 待报阳后进行检测也是可行的。有研究应用MALDI-TOF MS检测了46份液体, 包括移植养护液、关节液、深部脓疱样本、骨小孔样本用血培养基孵育, 发现44/46(96%)能鉴定到种的水平, 余下的2份被鉴定到属的水平[18]。四、总结与展望　　MALDI-TOF MS是一种简单、快速、高通量和高效的微生物鉴定手段, 在临床样本直接检测方面较传统的鉴定方法具有更大的优势, 能显著降低样本检测的周转时间和成本, 但尚存在着一些不足之处, 主要表现在:(1)MALDI-TOF MS在检测和鉴定细菌方面的敏感性还不高, 不能直接鉴定患者血样本中的病原菌(细菌数量太少) (2)对于一些核糖体蛋白差异较小的细菌用其辨别有较大的困难 (3)目前的研究都有各自不同的操作过程, 在样本处理、质谱图采集和分析等方面没有统一的标准, 可能会影响分析结果在实验室内和实验室间的可重复性 (4)标准的鉴定参考图谱数据库尚不够完善, 需要进一步拓展 (5)对一些细胞壁难以破坏的细菌(如革兰阳性菌、酵母菌)和混合菌等的鉴定能力还不够高。但是相信随着更加有效的样本预处理方法、更加严格的检测过程控制和更高分辨率的图像处理技术的实现, MALDI-TOF MS用于直接检测临床样本中的微生物会有更广阔的前景。

英国食品标准局消息，该局近日将对一系列关于食品中的病原微生物和化学污染物，以及一项与猪尸体外观检验相关的试验展开调查，还包括食品中的农药残留，并征求与此相关的研究。此次调查的目的为研究于食品病原微生物以及化学污染物有关的情况，包括以下几个方面：英国零售产品中的丙烯酰胺；牛、羊、自由放养的有机鸡的铅含量以及英国富铅地区农场所产的鸡蛋中的铅水平；英国具有代表性复合食品样品中所含的环境化学物质；英国谷物食品中麦角生物碱以及麦角菌的品种和含量；中小食品经营场所出售的预包装即食肉片中的单核细胞增生利斯特菌（listeria monocytogenes）以及其它病原菌；贝类动物中的诺沃克（Norovirus）病毒此外，其他两种由FSA委托代理的研究项目为：研究室内养殖猪的猪尸体外观检验是否可用于室外养殖肥猪，该研究的目的为更新肉制品卫生处理方案，以确保进行风险评估同时向消费者提供合理的安全限值。研究食品中农药残留处理过程中的影响因素。对储藏时间、清洗程序、脱皮与烹调方法等展开研究，目前已针对苹果与土豆所含部分农药开展了处理方法。该方法将被考虑应用于更广泛领域食品中的农药残留。

奶粉中病源微生物的分子生物学检测

微生物操作的几个概念1、病毒培养：指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组试验等操作。利用活病毒或其感染细胞（或细胞提取物），不经灭活进行的生化分析、血清学检测、免疫学检测等操作视同病毒培养。使用病毒培养物提取核酸，裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。2、动物感染实验：指以活病原微生物感染动物的实验。3、未经培养的感染性材料的操作：指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析等操作。4、灭活材料的操作：指感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸检测、生化分析、分子生物学实验等不含致病性活病毒的操作。5无感染性材料的操作：指针对确认无感染性的材料的各种操作，包括但不限于无感染性的病毒DNA或cDNA操作。6、大量活菌操作：实验操作涉及“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。“大量”的病原菌制备，是指病原菌的体积或浓度，大大超过了常规检测所需要的量。比如在大规模发酵、抗原和疫苗生产，病原菌进一步鉴定以及科研活动中，病原菌增殖和浓缩所需要处理的剂量。7、 样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。

1 沙门氏菌基本概况及食品污染状况沙门氏菌（Salmonella）是一种无芽孢、无荚膜的革兰氏阴性杆菌。除雏鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其余都有鞭毛，能运动。多数具有菌毛，能吸附于细胞表面，发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露糖产酸产气，不发酵乳糖和蔗糖，不产生吲哚，不分解尿素，多数产硫化氢，不液化明胶，MR、VP 实验阴性（王辉等 2008）。沙门氏菌是肠杆菌科中最重要的病原菌属，目前全世界已发现约 2500 种血清型，这些血清型均可引起食源性疾病（Humphrey 2000）。与人类疾病有关的血清型主要包括伤寒沙门氏菌，甲、乙和丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌和新港沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。在国际上公认的沙门氏菌中有三个血清型以中国地名命名，分别是上海沙门氏菌（Salmonella Shanghai）、自贡沙门氏菌（Salmonella Zigong）和广州沙门氏菌（SalmonellaGuangzhou）（王辉等 2008）。进食被沙门氏菌污染的食品后，沙门氏菌可通过肠道上皮细胞经毛细血管和淋巴管进入血液，导致菌血症和全身感染。同时，沙门氏菌被巨噬细胞胞饮并内化时产生极强的内毒素，从而引起腹泻、发热及肠道炎症反应。沙门氏菌源于家畜、家禽、人类及鼠类的粪便之中，常污染的食品为鸡肉、猪肉、牛肉、鱼肉、香肠、火腿、熏肉制品和鸡蛋等（藤仁明 2007；Schroeter et al. 1994）。孙晓林等（2008）对兰州市肉与肉制品微生物污染状况研究结果表明，生猪胴体和肉样沙门氏菌检出率分别为 7.5%和 14%。洪文展（2005）发现深圳市售肉品沙门氏菌污染率为 26.2%。Capita 等（2003）对西班牙的鸡肉感染沙门氏菌情况做了调查，结果显示 49%的鸡肉含有沙门氏菌。Uyttendaele 等（1997）对比利时禽肉及其制品中沙门氏菌的流行状况研究表明，1993 年沙门氏菌的平均污染率为 19.4%，1994 年为 24.1%，1995 年为21.9%，1996 年为 36.7%。此外，Bosilevac 等（2009）对美国零售牛肉的研究结果、Berends等（1997）对猪胴体及猪肉的研究结果和 Jorgensen 等（2002）对市售生鸡肉沙门氏菌的污染状况研究均表明沙门氏菌广泛存在于食品性动物、动物胴体、零售肉及肉制品食品之中。

病原微生物实验室生物安全管理条例中华人民共和国国务院令第424号 《病原微生物实验室生物安全管理条例》已经2004年11月5日国务院第69次常务会议通过，现予公布，自公布之日起施行。 第一章　总则 第一条　为了加强病原微生物实验室（以下称实验室）生物安全管理，保护实验室工作人员和公众的健康，制定本条例。 第二条　对中华人民共和国境内的实验室及其从事实验活动的生物安全管理，适用本条例。 本条例所称病原微生物，是指能够使人或者动物致病的微生物。本条例所称实验活动，是指实验室从事与病原微生物菌（毒）种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。 第三条　国务院卫生主管部门主管与人体健康有关的实验室及其实验活动的生物安全监督工作。 [B]文章太长，可下载附件[/B]！

通过实验室的检测结果看来本地学校食堂的食品还是具有生物性危害的食源性病原微生物是通过被污染食品而引发人类疾病的一类微生物，从人类诞生至今，食品安全的一行重要任务就是与这类病原菌作斗争，就像猎人和猎物斗智斗勇一样，几百年来微生物的变异和检测技术的革新上演着一幕又一幕的故事。进入21世纪，食品卫生状况依旧不容乐观，每年因食源性病原微生物引起的食物中毒事件居高不下。无论是发达国家还是发展中国家，食源性疾病已成为最主要的公共卫生问题之一。国际权威组织及各国对食源性疾病都有明确的定义。世界卫生组织将食源性疾病定义为由于摄入食物中所含致病因子而引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。在我国GB14938-1994《食物中毒诊断标准及技术处理总则》中将其定义为因摄入含有生物性、化学性有毒有害物质的食品后出现的非传染性的急性、亚急性疾病。由此可见，食源性疾病即是以食物为载体或媒介，通过食品引发或传播的疾病。根据食品中有毒有害成分的特征分析，区分为生物性、化学性和物理性危害，病原微生物是生物性危害主要因素。食源性病原微生物包括食源性细菌、病毒、寄生虫等。笔者就将此次食品中检测食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌这4中细菌的检测情况作以总结。此次食品采样全部是县区学校的食堂，有米饭+菜，盒饭。这也是按照当地政府的安排，食药局采样送我单位进行的细菌检验，样品全部合格。试验过程所用试剂大多数是广东环凯公司的成品试剂，试验过程同时带有标准菌株作为阳性参考品。试验过程按照国家标准进行。

[size=16px]点击链接查看更多：[url]https://www.woyaoce.cn/service/info-18245.html[/url]微生物菌剂，就是目标微生物（有益菌）经过工业化扩繁之后，加工制成的活菌制剂。农用微生物菌剂，广泛应用于经济作物种植、禽畜粪便腐熟、工业废弃物处理、环境改良等场合。[color=#777777] [/color][/size][align=center][font=宋体][size=16px]功能及作用[/size][/font][/align][size=16px]一般情况下，农用微生物菌剂，应用于农业生产，具有以下主要功能和作用：[font=Times, serif]1.[/font]预防病害：改善土壤微生物菌群、抑制土壤病原菌繁殖，可有效预防作物的根腐、立枯等病害；[font=Times, serif]2.[/font]提高地力：活化土壤有机与无机养份，提高肥效率，促进作物循环、长效吸收利用，增根壮苗果实饱满；[font=Times, serif]3.[/font]改良土壤：改善土壤团粒结构，消除板结，提高保水保肥能力，抗旱、抗逆、抗寒、抗倒伏；不间断使用，可改善土壤微生态环境。消除土壤板结、中和酸碱度、降低土壤重金属和盐碱毒害；[font=Times, serif]4.[/font]增根、发苗、壮秧：有益微生物在繁殖代谢过程中，可分泌细胞分裂素、吲跺乙酸、维生素、本乙酸、赤霉素等植物生长素及氨基酸等活性物质，强力促进增根、生根，壮根、毛细根数量增加一倍以上；吸水、吸肥能力加强，茎粗、苗壮、移栽缓苗快等特点。[color=#777777] [/color][/size][table][tr][td][align=center][font=宋体][size=16px]检测项目[/size][/font][/align][/td][td][align=center][font=宋体][size=16px]具体指标[/size][/font][/align][/td][td][align=center][font=宋体][size=16px]检测标准[/size][/font][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,9][align=center][size=16px]农用微生物菌剂产品技术指标[/size][/align][/td][td=1,2][align=center][size=16px][font=Times, serif] [/font]有效活菌数[font=Times, serif] [/font][/size][/align][/td][td][align=center][size=16px][font=Times, serif] [/font]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006 [/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]霉菌杂数[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]杂菌率[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]水分[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px][font=Times, serif]Ph[/font]值[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,13][align=center][size=16px][font=Times, serif] [/font]农用微生物菌剂产品的无害化技术指标[font=Times, serif] [/font][/size][/align][/td][td=1,2][align=center][size=16px]粪大肠菌群[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]砷[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]镉[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px][font=Times, serif] [/font]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB/T 20287-2006 [/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]铅[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]铬[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB 20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,3][align=center][size=16px]汞[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]农用微生物菌剂[font=Times, serif]GB20287-2006[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center][size=16px]复合微生物肥料[font=Times, serif]NY/T 798-2004[/font][/size][/align][/td][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][tr][td=1,1,0][size=16px][/size][/td][/tr][/table]

[size=4]实验室分为室内质量控制和室间质量评价两个组成部分[color=#ec0078]一、室内质量控制[/color]（一）检验人员的培养1.定期进行新理论、新技术和新方法的业务学习。2.定期进行理论考核和操作技能考核。3.编写作业指导书。（二）仪器设备的功能监测、维修及 保养1.恒温孵箱、水浴箱和冰箱：了解其性能，每天记录温度，定期清理消毒，冰箱定期化霜。恒温孵箱、水浴箱定期检定。2.灭菌器械的效果检测：化学指示剂胶带 嗜热脂肪芽胞杆菌指示菌片 枯草杆菌芽胞3.二氧化碳培养箱：注意CO2含量的监控。4.厌氧箱或厌氧罐：进行厌氧环境监控。美兰指示条，刃天青指示剂5.微生物鉴定仪：a.及时更新系统操作软件。b.定期对仪器的探测部位进行清洁。c.对每批号的鉴定卡、条和板用标准菌株进行测定，并核对每个反应结果。[/size]

[size=18px]点击链接查看更多：[url]https://www.woyaoce.cn/service/info-18245.html[/url]微生物菌剂，就是目标微生物（有益菌）经过工业化扩繁之后，加工制成的活菌制剂。农用微生物菌剂，广泛应用于经济作物种植、禽畜粪便腐熟、工业废弃物处理、环境改良等场合。[/size][color=#777777] [/color][align=center][font=宋体][size=18px]功能及作用[/size][/font][/align][size=18px]一般情况下，农用微生物菌剂，应用于农业生产，具有以下主要功能和作用：[/size][font=Times, serif][size=18px]1.[/size][/font][size=18px]预防病害：改善土壤微生物菌群、抑制土壤病原菌繁殖，可有效预防作物的根腐、立枯等病害；[/size][font=Times, serif][size=18px]2.[/size][/font][size=18px]提高地力：活化土壤有机与无机养份，提高肥效率，促进作物循环、长效吸收利用，增根壮苗果实饱满；[/size][font=Times, serif][size=18px]3.[/size][/font][size=18px]改良土壤：改善土壤团粒结构，消除板结，提高保水保肥能力，抗旱、抗逆、抗寒、抗倒伏；不间断使用，可改善土壤微生态环境。消除土壤板结、中和酸碱度、降低土壤重金属和盐碱毒害；[/size][font=Times, serif][size=18px]4.[/size][/font][size=18px]增根、发苗、壮秧：有益微生物在繁殖代谢过程中，可分泌细胞分裂素、吲跺乙酸、维生素、本乙酸、赤霉素等植物生长素及氨基酸等活性物质，强力促进增根、生根，壮根、毛细根数量增加一倍以上；吸水、吸肥能力加强，茎粗、苗壮、移栽缓苗快等特点。[/size][color=#777777] 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检测食品中微生物的仪器主要包括以下几种：　　无菌均质器：这种仪器广泛应用于动物组织、生物样品、食品、化妆品的均质处理，特别适合于微生物检测样本的制备。它具有均质柔和、样品无污染、无损伤、不升温、不需灭菌处理、不需洗刷器皿的特点。样本装在特制的一次性无菌均质袋中，不与仪器接触，有助于预防交叉污染。　　微生物鉴定系统/药敏分析仪：细菌鉴定药敏分析仪适用于对病原微生物进行种类鉴定和体外抗生素敏感试验、分析。其检测范围广泛，菌种库包含2000种以上，可鉴定临床致病菌550种以上，测试200种以上药物的敏感性。这种仪器能够实现细菌鉴定的自动化、标准化和药物试验的定量化，对于食品安全国家标准GB4789系列所要求的食源性致病菌(如弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等)的分离鉴定非常有用。　　微生物检测仪：便携式微生物检测仪广泛应用于活菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、粪肠球菌(链球菌)、酵母(酵母菌)等微生物的快速检测。这种仪器便携一体化，防水抗压，可随时随地进行检测。　　微生物限度仪：如JC-WX600微生物限度检测系统，采用不锈钢金属材料制成，配有内置隔膜液泵，不需外接抽滤瓶，液体直接通过隔膜液泵排除，减少了抽滤瓶使用上的繁琐，避免了连接不好造成抽滤速度慢等缺点。　　以上这些仪器都是食品微生物检测中常用的设备，它们为食品的安全和质量控制提供了强有力的技术支持。

(二)MALDI-TOF MS分析　　目前主要有4种MALDI-TOF MS系统[9]:MALDI Biotyper系统 (Bruker Daltonics, 德国), VITEK MS系统 (BioMé rieux, Marcy l’ Etoile, 法国), the AXIMA@SARAMIS 数据库 (AnagnosTec, 德国)和the Andromas (Andromas, 法国), 其中前2种质谱系统已获得中国食品和药品监督管理局许可证, 可以用于临床样本的检测。　　在进行质谱分析前, 应根据不同的检测对象和使用的激光类型选择合适的基质。基质由基质复合物和基质溶剂组成。常用溶剂有:乙醇、乙腈和一种强酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基质是2, 5-二羟基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羟基肉桂酸(ɑ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(sinapinic acid, SA)等。将经过提取的微生物样本细胞内容物与等量的基质溶液(通常是1 μ L)混合或分别点加在样本靶板上, 待室温条件下干燥后(使得样本与基质共结晶)上机检测即可。(三)鉴定结果分析　　将质谱检测得到的谱峰与数据库进行模式匹配, 得到一个鉴定分数。基于软件给出的在列表中第1种微生物的鉴定分数, 根据各自质谱分析系统的判断标准得出检测结果。目前文献报道有2种判断标准:第1种是由STEVENSON等[10]提出的, 鉴定结果按照匹配程度进行打分, 分值在0~3之间。当得到的鉴定分数≥ 2.0时, 表示待测菌株有较大的把握被鉴定到种的水平 鉴定分数在1.7和2.0之间时, 表示菌株被鉴定到属的水平, 分值 1.7表示产生的鉴定结果不可信。第2种标准是LA SCOLA等[11]提出的, 当一个样本经过4次点样鉴定, 当列表中第1种微生物的鉴定结果均一致, 并且至少2次的鉴定结果鉴定分数≥ 1.900, 或者4次的鉴定分数均≥ 1.200, 表明微生物能被正确鉴定。有学者发现通过改进上述的鉴定标准可以得到更好的鉴定效果, ROSSELLó 等[12]认为在临床样本直接鉴定时, 鉴定分数要比直接纯培养的低, 可能会对分析结果造成干扰, 而厂商推荐的鉴定标准有些严格, 只有得到很高的鉴定分数结果才是被接受的。因此提出新的标准增加可接受的准确鉴定数:当一个样本4次点样中至少有2次的鉴定结果一致, 并且对列表中的第1个微生物种的鉴定分数均≥ 1.4时, 即表示能够准确鉴定, 这种标准与纯培养的鉴定结果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]将种的鉴定分数降到1.5, 可以将种的鉴定率从56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了厂商推荐的cut-off值比较保守, 使得鉴定的敏感性降低。此外, 由于目前的数据库尚不完善, 对于部分菌株可能会出现鉴定失误的情况, 实验室工作人员应在商品数据库的基础上建立和丰富自己的参考数据库, 以提升鉴定的准确率。三、MALDI-TOF MS在临床样本直接检测中的应用　　从临床样本直接检测微生物可以节省转种培养的时间。目前已取得显著进展的是从血培养阳性样本中直接检测细菌和酵母样真菌, 而从中段尿和其他无菌体液样本中的直接检测也在快速发展。(一)血流感染病原菌的快速检测　　血流感染的发病率和死亡率都相当高, 快速准确的血流感染病原菌鉴定对于临床抗菌药物的合理使用和病愈率的提高至关重要。直接检测能显著减少鉴定时间( 29 h), 使得在血培养阳性的第1个24 h内接受适当抗菌药物治疗的患者增加11%[14]。CLERC等[15]认为基于MALDI-TOF MS 对血培养阳性样本的检测可能会成为血培养阳性患者管理中除了革兰染色报告之外的第2个关键步骤。近年来, 有不少的研究应用MALDI-TOF MS直接鉴定临床微生物样本, 取得明显进展的是从血培养阳性样本中直接鉴定细菌和酵母样真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厌氧菌等的鉴定还有待更多的研究。1.鉴定效能 (1)细菌:在引起血流感染常见菌的鉴定方面, MALDI-TOF MS技术已经在肠杆菌科细菌、葡萄球菌等病原菌的直接鉴定方面取得了很好的鉴定结果。大量的研究评估了MALDI-TOF MS用于直接鉴定阳性血培养瓶的表现, 不同文献报道的种水平的鉴定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鉴定细菌种类/数量的不同, 或是运用了不同的预处理/提取方法, 或是定义了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]应用不同的操作程序直接鉴定阳性血培养瓶样本, 结果显示103株代表临床最常见的13个属24个种的样本中, MALDI-TOF MS准确鉴定其中的72%(86.6%革兰阴性菌, 60.0%革兰阳性菌) 500例样本中, 其中革兰阳性菌358例, 革兰阴性菌98例, 总体种的鉴定率达到了86.5%, 其中革兰阳性菌是89.8%, 革兰阴性菌是86.3%。国内最新的研究也显示, 陈峰等[21]运用分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS直接检测, 革兰阴性菌和革兰阳性菌中有84.0%和75.0%能被准确鉴定到种的水平 对于血流感染中最常见的病原菌的菌种鉴定符合率达到83.3%~96.9%。以上研究均显示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鉴定方面的良好表现, 并呈现出了如下特点:对革兰阴性菌的鉴定率比革兰阳性菌高 无荚膜的细菌较有荚膜的细菌(细胞壁难以破坏提取到足够的菌体蛋白)的鉴定率高 混合细菌感染时鉴定能力有限, 多数情况下只能鉴定出其中一种优势细菌 对草绿色链球菌的鉴定效果较差(鉴定不出, 或将缓症链球菌鉴定为肺炎链球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要进行另外的确证试验 (2)真菌:MALDI-TOF MS在鉴定酵母菌方面有较高的鉴定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鉴定的正确率可达91%~100%。但是也有学者得到了相反的结果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鉴定的正确率只有56%和41%, 可能是因为鉴定使用的血量过少(1.5 mL), 或是在处理样本的过程中样本的丢失导致了低鉴定率 (3)其它细菌:目前关于厌氧菌的直接鉴定的报道较少, 并且显示了鉴定成功率并不理想, 可能是因为厌氧菌对生长条件的要求较为苛刻, 导致增菌的数量达不到要求, 还需要更多的研究来优化其鉴定条件。2.不同的检测方法 上述结果均是MALDI-TOF MS直接检测报阳血培养瓶的样本所得到的。有研究表明报阳血培养瓶的样本也可以转种到固体培养基上进行短暂孵育(如2~4 h)后再进行鉴定, 则具有更大的优势。KROUMOVA等[23]在质谱法分析实施蛋白提取程序之前, 将样本富集到一个增菌培养基中孵育大约2 h后再进行质谱分析, 同时达到增菌和减少血液成分干扰的目的, 提升了鉴定分数, 使鉴定结果更可信 IDELEVICH等[24]将血培养阳性的样本转种到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(对照), 分别直接进行MALDI-TOF MS检测, 直到有可靠的到种水平的鉴定结果出现(鉴定分数≥ 2.0), 结果发现革兰阳性球菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是5.9 h, 革兰阴性杆菌平均鉴定到种所需要的孵育时间是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革兰阳性球菌的孵育时间将缩短至3.1 h, 但对革兰阴性杆菌的影响不明显。这种方法可以有效地减少额外的人工操作时间和费用。HONG等[25]的研究也表明, 这种方法能得到可靠的鉴定结果(与传统生化方法的属水平的一致率是98.9%), 并且这种方法不会受血培养系统的影响, 成本低, 易于操作。3.与药物敏感性联合检测 为了克服MALDI-TOF MS不能做体外药物敏感性试验的不足, MALDI-TOF MS已经开始与药物敏感性试验联合用来直接检测阳性血培养瓶的样本[26], 用不含活性炭的血培养基在过滤和洗涤之前用溶解细胞的缓冲液进行孵育, 然后将从过滤膜上收集的微生物直接进行MALDI-TOF MS分析, 剩下的样本用VITEK 2系统孵育并进行药物敏感性试验, 将94.0%的样本鉴定到了种的水平, 药物敏感性试验与传统方法相比有93.5%的一致率, 并且相较于传统的56.3 h, 新方法鉴定和药物敏感性试验所用的时间缩短到了11.4 h。证明了在一天内完成微生物鉴定和药物敏感性试验的可行性。为获得更好的治疗争取了时间并且减少了住院的费用[27]。4.检测结果的影响因素 有研究指出不同的血培养瓶和血培养系统可能会产生鉴定结果的差异[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培养瓶和BacT/ALERT血培养系统的鉴定率较低, 使用含有树脂的血培养瓶和BACTECTM血培养系统鉴定率较高。其中一项研究比较了含有活性炭的和不含活性炭的血培养瓶在BacT/ALERT血培养系统下的鉴定表现, 发现使用不含活性炭的血培养瓶的MALDI-TOF MS的鉴定率为30%, 而含有活性炭的血培养瓶的鉴定率只有8%[28]。而另一项研究比较了3种不同的血培养系统— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/ALERT对鉴定率的影响, 经这些鉴定系统培养的阳性血培养瓶的鉴定成功率分别是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的细菌蛋白提取程序也会影响鉴定成功率[11]。

食品微生物检验是食品安全监测的重要组成部分，在实际工作中存在许多复杂因素影响食品微生物学的检验，可能给检验结果带来偏差甚至错误。影响食品微生物检验结果的因素主要有以下几个方面：1．样品的接收和预处理。样品送达实验室时，应检查样品标记是否与样品相符，样品包装状况是否正常。送检的样品，一般需保持在0～4℃的环境中，食品微生物学实验室在收到样品后，必须及时进行检验，以防止病原菌死亡或细菌数量增加。2．仪器设备。微生物实验室的主要仪器及设备包括：无菌室、显微镜、菌落计数器、高压灭菌器、干热灭菌器、离心机、蒸馏设备、培养箱、厌氧箱、水浴箱、冰箱、超净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。要求所有的仪器和设备均应按照生产厂家提供的方法和有关规定正确使用，操作人员应了解仪器工作原理并遵守操作规则。

目的:建立抗菌中药对临床常见病原性细菌抑菌作用的检测方法。方法:选择6种常用抗菌中药（黄连、苦参、连翘、大黄、生地、知母)，分别采用水提法制备至质量浓度1mg/L。应用液体稀释法测定上述中药对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果:建立了中药抑菌作用的检测方法。黄连、大黄与连翘抑制细菌的作用较强，MIC值均≤0.05mg/L，其中黄连对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强（MIC值为0.00625mg/L）。结论:应用本方法可以进行中药抑菌作用的检测。抗菌中药对所试验菌种表现不同的抑菌作用。【关键词】中草药；微生物敏感性试验；抗菌药；细菌 Study on Antibacteral Effects of Six Chinese Herbs Against Pathogenic Bacteria XUE Jianjiang1,QIAO Haixia2,LIU Jinjun2,et al 1.Clinicial Lab,The First Affilited Hospitial,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China 2.Department of Microbiology,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China 【ABSTRACT】Objective:To establish a method to detect the antibacterialactivity of traditional chinese medicine against pathegenicbacteria.Methods:Six varieties of traditional chinese medicine(Coptisetc)were selected and extracted with pure water to make concentratedwith 1mg/L.Three different common pathogenic bacteria were used todetermine the minimal inhibitory concentration(MIC)in vitro with liquiddilution method to the selected medicine.Results:The methods wereestablished to detect the antibacterial activity of traditional chinesemedicine.Three herbs had inhibition effects on the strains oftest,among which Coptis Chinesis had the strongest effect and MIC was0.00625g/mL to Staphylococcus aureus.Conclusion:The methods can serveas a reference for the antibacterial activity of traditional chinesemedicine.The degree of inhibition effect for different traditionalchinese medicine on different bacteria were different. 【KEY WORDS】Chinese Herb,Microbial Sensitivity Tests,AntiBacterial Agents,Bacteria 中药几千年来为中国人民的健康做出了重大贡献，在现代预防和控制细菌性感染疾病中也发挥了积极作用。应用中药进行抗感染治疗具有副作用小，药物来源广泛，价格低廉等优势。在清热解毒抗菌类中药中开发抗菌药物具有良好的应用前景。长期以来，对于抗菌中药作用机理的较少认识限制了其在临床中的应用。目前，尚无统一规范的中药抗菌作用评价方法。为此，本研究拟应用抗生素最小抑菌浓度检测方法，检测6种常用抗菌中药（大黄、苦参、连翘、黄连、生地、知母）对三种常见病原性细菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌）的抑菌作用，建立一种可以规范的中药抗菌作用检测方法。