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单糖、多糖、聚合糖HPLC检测方法及实验数据理论目简述糖的分析在许多行业有着重要意义。现有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定,它们包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、和高效液相色谱(HPLC) 等。考虑用HPLC测定糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出,由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团,到目前为止还没有建立一个统一的HPLC方法来分析所有的单糖和低聚糖。对各种分离系统也不易比较,许多分离参数(洗脱形式、分析时间、复杂化台物分离情况和柱效率、柱稳定性和柱使用寿命)制约着糖的HPLC分离技术。目前有不同类型的柱子和检测器用于糖的分离和检测。一、分析糖色谱柱概述1.1 化学健合烷基柱在C18柱上用水作流动相对不衍生单、双、叁糖进行分组分离,糖的保留时间较短且分离效果不好。由于所有单糖结构相近很难分离,所以C18柱不适合于较复杂糖混台物的分析。为解决单糖类的分离采用衍生法可改变糖的局部结构, 在C18柱上基本分开。其方法有:糖先进行还原胺化再用异硫氰酸苯酯试剂进行衍生, 用l-苯-3甲基5-吡唑啉酮试剂衍生,等等衍生方法。1.2 阴,阳离子交换树脂阴离子交换柱以NaOH水溶液为流动相,糖在阴离子交换树脂上洗脱顺序为多元醇、单糖和低聚糖,但改变流动相组成或改变柱温可以改变保留顺序。阳离子交换柱阳离子交换树脂柱以4%~l0%交联磺化的聚苯乙烯一二乙烯基苯(PS/ DVB)共聚物为基质,树脂通常吸附Ca,Pb,Ag,Na ,H, 等金属离子为金属抗衡离子,以蒸馏水作流动相,在80-90℃温度下来分离糖。月旭科技目前以Xtimate®Sugar-Ca 型阳离子交换树脂柱,Xtimate® Sugar-H型阳离子交换树脂柱使用较广。钙型阳离子交换树脂柱,以纯水水溶液为流动相可分离蔗糖,果糖,葡萄糖,等或以含EDTA.Ca水溶液作流动相可分离单糖、双糖。氢型阳离子交换树脂柱应用也很多,以0.04 mol/L H3PO4水溶液或pH为2.5硫酸水溶液为流动相可分离乳糖、葡萄糖和果糖等,以H3PO4水溶液为流动相分离一些糖和有机酸。1.3 氨基健合硅胶柱氨基健合硅胶柱通常在室温下用乙腈一水作流动相,分离常见的单糖和低聚糖,糖出峰顺序为单糖、双糖和较高低聚糖,随着流动相中水含量的增加糖的保留时间减少,并且氨基柱柱子有较短的使用寿命,这是柱填料自身水解以及还原糖与氨基之间形成希夫碱,造成柱寿命降低。二、检测器概述用HPLC测糖,选择合适的检测器是很重要的,用于HPLC的检测器很多,根据样品中的糖的种类、含量和纯度来选择合适的检测器2.11 示差折光(RI)检测器RI检测器是HPLC测糖最常用的检测器,它具有稳定、易于操作,样品不被破坏和具有较好的灵敏度等优点。虽然RI检测器应用很广,但也存在一些缺点,它受温度和流动相组成的影响,不能使用梯度淋洗;对于糖含量较低的样品,RI检测器的灵敏度达不到要求。2.12 UV—VWD紫外检测器UV—VIS检测器在HPLC测糖中起着重要作用,它不需严格的温度控制,糖只在近紫外区190nm附近有吸收,UV检测器可用于未衍生糖的检测,但在此波长区, 流动相和样品中不能含有吸收的杂质,必须用超纯的流动相和较纯的样品,它的检测灵敏度与RI检测器相差不大。若采用衍生试剂与糖进行柱前或柱后衍生反应,生成具有强紫外或可见吸收的物质,可大大提高检测灵敏度。三、实验方案(化学健合相色谱柱)多糖衍生紫外检测器测定法。测定目标物质:混标:甘露糖,盐酸氨基葡萄糖,鼠李糖,葡萄糖,木糖,半乳糖, 阿拉伯糖,岩藻糖检测波长:254nm柱温:30℃流速:1ml/min进样量:20μl流动相配制:流动相A:乙腈。流动相B:50Mmol磷酸二氢钾缓冲液(精密称取磷酸二氢钾6.804g置于量瓶中加水溶解至1000ml,混匀后,用氢氧化钠溶液调节pH值为6.9)[
[color=#444444]之前用水提醇沉法提了黄芪多糖,课题要求检测其水解后单糖组成及比例,目前做到单糖组成这一步。[/color][color=#444444]水解用的是三氟乙酸,要求完全水解,对比条件中最剧烈的条件是5M三氟乙酸,100度水解10h,但是就算是这个条件,我进[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]时依然检测不到文献中说到的理论应有单糖,甚至也检测不到多糖,请各位帮忙找找原因。[/color][color=#444444]说说之前做的,水解后我有氮气吹干,保存于-80℃冰箱,几个条件都考察完后一起冻干。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]样品处理:75%乙腈和25%乙醇溶解水解后样品,离心,吸取上清。[/color][color=#444444]所用色谱柱:HILIC柱。[/color][color=#444444]后来也打了单质谱,依旧检测不出所需要的物质。[/color][color=#444444]不知道是哪一步出错了,请大家帮忙,多谢![/color]
如题,我想用液相测提取的多糖里的单糖,我看文献上都是提取纯化后,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化后再测定,我看别人用的柱子有XDB-C18,ODS-VP色谱柱,Wondasil C18,检测器都在用紫外或者二极管阵列检测器。现在我们有一个ODS-3(C18)的柱子,不知道能不能测衍生化后的糖呢?对柱子这块我不是很懂,烦请有经验的前辈交流下,不胜感激。祝大家新年快乐~