水产品孔雀石绿检测

各位 老 师 我 们 单 位 要 开展水产品中孔雀石绿检测的科委项目，缺资料和思路，请教老师们，谢谢！

水产品孔雀石绿、结晶紫现场快速检测试剂盒用途:用于检测鱼类、虾类等孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫成分。适用范围：适用于市场监督部门、水产监督部门、水产养殖部门对水产品的现场及化验室检测监控。方法简介：水产品中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫经过前处理后，样液经过孔雀石绿专用SPE小柱富集形成有色环带，可初步判断样品中是否含有孔雀石绿、结晶紫。用洗脱剂将柱上待检物洗脱下来，经柱衍生化后，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，加萃取剂，若萃取剂有明显的绿色或紫色说明样品中含有待检物质。将萃取剂取出滴于白色点滴板上，可在板上形成绿色或紫色环斑，从而可准确定性样品中是否含有孔雀石绿或结晶紫。试剂盒组成：提取剂1 (10瓶) 提取剂2 (10瓶)层析柱（10根） 50ml注射筒（1支）吸耳球 （1个） 洗涤剂 (2瓶) 洗脱液（3瓶） 衍生化试剂 （10管）萃取剂(1瓶) 点滴板（1块）一次性吸管（10支） 离心管1 （10个）离心管2 （10个） 1ml注射器（10支）另必需材料1、绞肉机（现场可用剪刀,研钵替代）2、离心机 4000转/分以上（现场可用滤纸过滤的方法替代）3、量筒 100mL 4、蒸馏水5、固相萃取机（现场可用吸耳球替代）6、聚丙烯离心管 100mL(若使用离心机)操作过程：1、样品处理：（在实验室可按“a”操作，现场按“b”操作）a、取水产品可食部分用绞肉机绞碎后, 准确称取10.0g于 100mL离心管中，加入提取剂1、提取剂2各一瓶，振摇5分钟后,4000转/分离心5分钟，取上清液10mL于100mL量筒中，用蒸馏水定容至30mL；b、用剪刀剪取约10g样品于研钵中, 加入一瓶提取剂2研碎后, 再加入一瓶提取剂1继续研磨约3至5分钟，用滤纸过滤后挤干残渣, 收集滤液10mL于100mL量筒中，用蒸馏水定容至30mL。2过层析柱：将50mL注射器与层析柱连接，将1中收集到的样液倒入注射筒里，用注射塞加压，加快流速，建议30mL样本通过柱子的时间为5~8min。待样液完全流干后加2mL洗涤剂及2mL蒸馏水先后洗涤层析柱。3观察结果：观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有结晶紫；加0.8mL洗脱液将其洗脱下来用离心管1收集, 看液体颜色来判断。4衍生化：用2mL洗脱液及2mL蒸馏水先后洗涤层析柱后，将一瓶衍生化试剂倒入层析柱中，加入2mL蒸馏水用吸耳球从上口加压挤干 将3中的洗脱样液加入柱中, 用离心管2收集流出液, 用吸耳球从上口加压挤干 再用0.8mL洗脱液洗脱, 用此离心管2收集混匀。5萃取：取4中的离心管2，加入0.5mL蒸馏水后,再加入 0.5ml萃取剂，扣上管塞混匀静置, 离心管2下层若有明显的绿色或紫色则可判断样品中含有孔雀石绿或结晶紫，若无明显的绿色或紫色需进一步的判断。6检测：用1ml注射器取5中离心管2中的下层的萃取液(注意不要吸到上层的液体), 加到白色点滴板的一个孔上，样液渐渐挥干，若在孔上形成绿色斑环说明样品中含有孔雀石绿，形成紫色斑环样品中含有结晶紫。检测下限：1.0ug/kg (1.0ppb)特点1、可现场操作, 用于快速筛选法；2、检测速度快，检测一个样品30分钟左右；3、不需用任何设备，可完成整个检测过程；4、不需用其它试剂, 检测成本低；5、不需要做对照实验，特异性高, 可准确定性；6、操作简便，不需专业技术人员；7、可进行多残留分析。贮存条件与有效期：试剂在4-30℃阴凉干燥处保存，有效期为2年。

[align=center][b]水产品中孔雀石绿荧光检测法优化[/b][/align] 摘要：水产品中孔雀石绿应用广泛、危害性大。GB/T20361-2006荧光检测法检测成本低，但是前处理复杂、繁琐、耗时，且回收率不稳定。本文通过优化提取方式、浓缩条件、检测条件等，建立高效液相色谱荧光法检测水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的方法。优化后的方法样品前处理时间、样品出峰时间比GB/T20361-2006大大缩短，且分析结果回收率高、重复性好。关键词：水产品 孔雀石绿 检测[b] 一、孔雀石绿的危害性[/b] 孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，已被列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。我国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》和我国《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)通知》明确规定所有食品禁止使用孔雀石绿。但是由于孔雀石绿价格低廉，效果显著，在水产养殖中广泛应用。养殖户用它来预防鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等；不法商贩用它提高运输过程中鱼的存活率。并且使用孔雀石绿后的鱼死亡后，鱼鳞闪闪发光，颜色较为鲜亮，仿佛刚死一般，这又大大增加了死鱼出售的概率。[b] 二、检测材料与方法[/b] （一）主要仪器设备与试剂 1、主要仪器设备 电子分析天平（感量0.0001）、电子分析天平（感量0.01）、高速冷冻离心机、PH计、氮吹仪、超声波清洗机、涡旋混合器、固相萃取装置、安捷伦1260高效液相色谱仪配荧光检测器。 2、试剂 乙腈（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、无水乙酸铵（分析纯）、冰乙酸（优级纯）、氨水（分析纯）、硼氢化钾（分析纯）、盐酸羟铵（分析纯）、对-甲苯磺酸（分析纯）、酸性氧化铝（分析纯）。 3、标准品 孔雀石绿标准溶液（100Uug/mL）[color=#FF6600]。[/color] 4、其他耗材 酸性氧化铝固相萃取柱（500mg、3 mL）、Varian PRS柱（500mg、3mL）、0.45um有机滤膜、一次性注射器。 （二）液相色谱条件 色谱柱：安捷伦C18柱4.6mm×100mm,粒度3.5um；流动相：乙腈＋乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L,PH4.5）；流速1.3mL/min；柱温：35℃；激发波长：265nm,发射波长：360nm；进样量：5uL。 （三）样品前处理 参照GB/T20361-2006中的样品前处理进行取样、提取、净化，但将样品前处理的匀浆提取改为样品涡动和离心；用离心的方法代替分液漏斗分液；旋转蒸发温度调整为35℃。 具体优化方法如下： 1、样品提取优化：本方法将GB/T20361-2006方法中的10000r/ min匀浆提取30s改为加标后样品手摇振荡2 min，加入酸性氧化铝后手摇振荡2 min ，再4000r/ min离心10min，再静置10 min。手摇振荡既减少了匀浆过程中加标损失，影响回收率；又增加孔雀石绿的溶出效果。静置确保了分离效果，使它提取完全，提高实验回收效果。 2、样品浓缩温度优化：GB/T20361-2006方法中要求45℃旋转蒸发至近干，改为35℃旋转蒸发近干。实验过程中发现45℃旋转蒸发时孔雀石绿会被带出、25℃旋转蒸发速度太慢，都会影响回收率。对比显示35℃旋转蒸发回收率最为满意。 （四）校准曲线与加标回收情况 1、校准曲线以孔雀石绿中间溶液配成标准的工作曲线浓度分别为1.00 ng/mL、2.00ng/mL、5.00 ng/mL、7.00 ng/mL、10.00 ng/mL。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标做校准曲线，做一校准曲线，相关系数为0.9999。孔雀石绿在1-10ng/mL范围内线性良好。 2、加标回收 取10份样品加入浓度为20ng/mL的孔雀石绿标准溶液200uL，做九个重复，做一个空白。按上述方法进行前处理和检测，测得回收率范围在85%-105%。[b] 三、注意事项[/b] 1、称样、加标、振荡后要静置5分钟，确保溶出效果。 2、离心后的上清液转移至125mL分液漏斗中时要注意，不可吸入油脂、酸性氧化铝。 3、弃去酸性氧化铝柱后以及定容前要用剪平头的吸耳球吹PRS柱近干，保证平行和回收率。 4、旋转蒸发时，转速要由慢到快，保持转速200左右，水滴成滴滴下，不可成线，过快时要关掉真空泵。旋转蒸发近干要严格控制好，蒸发太快、蒸发温度太高都会导致回收率降低。 5、尽量减少溶液转移次数，转移次数影响回收率。 6、样品过柱和洗脱时，流速不能太快，否则样品或洗脱液不能与柱子充分接触，导致回收率降低。[b] 四、结论[/b] 综上所述本文探索改进的水产品中孔雀石绿检测方法，样品前处理时间、样品出峰时间比GB/T20361-2006缩短，节省了人力物力，且孔雀石绿在1-500ng/mL范围内线性良好，相关系数为0.9999，回收率范围85%-105%。

近期在进行一些水产品中孔雀石绿残留量的检测，采用的是GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫的测定。采用鲜活水产品那个前处理方法，称取5g样品，加入内标，用11mL乙腈匀浆提取，残渣再用11mL乙腈提取，合并后定容至25mL。取5mL过中性氧化铝柱，再用4mL乙腈洗柱，吹干，定容。同时进行空白实验。1、为什么此方法孔雀石绿-D5同位素内标的损失非常大，进行数十次实验，损失都在95%以上。而隐色孔雀石绿-D6损失略低，约70%。而空白实验却是正常的。2、同一样品前后两次连续进样，响应相差很大，什么原因？3、孔雀石绿在仪器中的残留是不是比较明显？4、许多样品中检出孔雀石绿，这个正常吗？

做水产品中孔雀石绿残留量的试验时，加入二氯甲烷的时候，震荡后出现了乳化现象，没有分层，怎么回事啊？

请问检测水产品孔雀石绿时，要想轻松的计算出添加标准物质的体积是多少，应该如何计算呢？谢谢！

用GB/T20361-2006做水产品中孔雀石绿，用SB-C18的柱子，响应值很低，但是线性很好。加标0.02微克每毫升，回收率不到50%，你有什么方法吗？能不能告知一下？

请教：水产品中孔雀石绿、结晶紫残留检测前处理，可以用氮吹取代旋转蒸发吧？我们用氮吹吹了好久，溶剂不能蒸发至近干是怎么回事啊？瓶底有乳状的液体，约5ml。

中国检验检疫科学院推出的新型水产品消毒剂日前通过专家的一期论证，这种产品的出现将有望解决水产养殖中的孔雀石绿问题。 这种新型水产品消毒剂是运用氧化电位原理研制而成，在适当的水温条件下，能有效防控不同水生动物的水霉病等病原和寄生虫。 论证专家组专家、中国国家兽药典委员会委员陈昌福说，新型水产品消毒剂最大的优点是使用后没有像氯制剂那样造成一些残留的污染。 孔雀石绿作为一种化工染料，曾被广泛用于水产养殖业，它可以防止霉菌感染，使鱼看起来更光鲜。但由于研究表明孔雀石绿在水产品上的残留对人体有害，国家禁止在水产养殖业中使用。 今年以来，中国淡水养殖非法使用禁用药物孔雀石绿的问题出现很多。 陈昌福说，这种名为“检科一号”的消毒剂，目前已在北京、山东等地投入试用。

在测水产品中孔雀石绿的残留的实验中，加入二氯甲烷分层效果很差，不知道大家在做的时候有没有遇到这样的问题，怎么解决的？

孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等特点，当其进入生物体内，就会产生具有更强危害的隐性孔雀石绿（LMG）和隐性结晶紫（LCV）。鉴于孔雀石绿和结晶紫的危害性，包括我国在内的许多国家都将它们列为水产养殖中的禁用药物。是进出口水产品必检项目之一。 《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》和《SN/T 1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法》中均采用有机溶剂提取后经固相萃取柱净化，然后采用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱法测定。 迪马科技在参考上述两个标准的基础上开发出中性氧化铝和阳离子交换固相萃取柱串联净化后，反相高效液相色谱柱检测。该方法准确可靠，重复性好，回收率高，可作为水产品中孔雀石绿和结晶紫及代谢物的检测方法。水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测 (参考《SN/T 1479-2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法》和 《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》)1 适用范围 本方法适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。2 样品准备 / 提取 1、称取已粉碎（已均质）的样品1 g于15 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol/L苯磺酸溶液、1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液、0.4 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和8 mL乙腈，涡旋混合2 min，4000 rpm离心1 min；2、将上清液转移至50 mL离心管中，残渣按照步骤1重复提取一次；3、合并两次提取液，并加入6 mL三氯甲烷和7 mL水，涡旋混合1 min，4000 rpm离心1 min；4、取下层清液于旋蒸瓶中，向上层清液加入6 mL三氯甲烷，重复提取一次；5、合并两次下层三氯甲烷溶液，40℃减压蒸至近干，加入5 mL乙腈待净化。3 SPE 柱净化—— ProElut Al-N （ 1 g /6 mL ）（ Cat.# ： 65306 ）上层ProElut SCX （ 500 mg/3 mL ）（ Cat.# ： 63604 ）下层(1)活 化：加入10 mL乙腈，流出液弃去；(2)上 样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)淋 洗：加入5 mL乙腈淋洗小柱，流出液弃去，并去掉上层Al-N小柱；(4)洗 脱：加入5 mL5%氨水乙腈，收集洗脱液；(5)重新溶解：将洗脱液在40 ℃下减压蒸干，1 mL定容液*溶解残渣，过微孔滤膜供HPLC分析。*定容液：乙酸铵缓冲液：盐酸羟铵溶液=2：1乙酸铵缓冲液：乙腈：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)=75:25；盐酸羟铵溶液：取1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液用水定容至100mL。4 分析条件 色谱柱：Platisil ODS ， 250 x 4.6 mm ， 5 μm （ Cat.# 99503 ） 流 速：1.0 mL/min 检测器：UV 591 nm和UV 266 nm柱 温：30 ℃进样量：20 μL 流动相：A：乙腈 B：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)梯度：时间/ min05.511.011.0120B％28882828

为什么要测定水产品中孔雀石绿的含量？

我们最近一段时间水产品里的孔雀石绿及结晶紫的检测时发现了很多问题,采用的是19857液质方法采用鲜活水产品前处理方法，称取5g样品，加入内标，用11mL乙腈匀浆提取，残渣再用11mL乙腈提取，合并后定容至25mL。取5mL过中性氧化铝柱，再用4mL乙腈洗柱，吹干，定容。同时进行空白实验。结果发现每次D5-孔雀石绿的内标损失很大,损失都在80%以上,而隐性的内标要稍微好一些,这个 有改进的 办法吗,大家做的时候有这个问题吗?同时,我们发现每个样品结晶紫的地方都有峰而且很高,后来 加了空白后,空白中也有结晶紫的峰,比如空白的峰结晶紫是3000,但是空白第一个内标很高有3*10e5，这样算下来基本就没有，在样品中结晶紫的峰和内标的高度就差不多了，都是3000左右，这样算出来浓度就很高，就是检出了。现在完全不明白这个结晶紫到底是哪里污染的，还是说这个方法本身就有影响吗？作了很多次，除了第二次没有出现结晶紫的峰，第一次和剩下的都有结晶紫的峰，我们用的是50ml的那种离心管，会有影响吗？作的时候也很小心了，不知道是哪里的问题？最后有个问题是孔雀石绿和结晶紫残留有限量标准吗？还是检出就不行？

我们最近一段时间水产品里的孔雀石绿及结晶紫的检测时发现了很多问题,采用的是19857液质方法 采用鲜活水产品前处理方法，称取5g样品，加入内标，用11mL乙腈匀浆提取，残渣再用11mL乙腈提取，合并后定容至25mL。取5mL过中性氧化铝柱，再用4mL乙腈洗柱，吹干，定容。同时进行空白实验。 结果发现每次D5-孔雀石绿的内标损失很大,损失都在80%以上,而隐性的内标要稍微好一些,这个 有改进的 办法吗,大家做的时候有这个问题吗? 同时,我们发现每个样品结晶紫的地方都有峰而且很高,后来 加了空白后,空白中也有结晶紫的峰,比如空白的峰结晶紫是3000,但是空白第一个内标很高有3*10e5，这样算下来基本就没有，在样品中结晶紫的峰和内标的高度就差不多了，都是3000左右，这样算出来浓度就很高，就是检出了。现在完全不明白这个结晶紫到底是哪里污染的，还是说这个方法本身就有影响吗？作了很多次，除了第二次没有出现结晶紫的峰，第一次和剩下的都有结晶紫的峰，我们用的是50ml的那种离心管，会有影响吗？作的时候也很小心了，不知道是哪里的问题？ 最后有个问题是孔雀石绿和结晶紫残留有限量标准吗？还是检出就不行？

液相色谱法测水产品中孔雀石绿，在净化时需要将两个小柱串联，直接串联后放在固相萃取装置上不能使用，做过的老师有什么好方法吗？

方法： SPE基质： 畜肉及水产品应用编号： 101828化合物： 孔雀石绿，结晶紫固定相： ProElut Al-N色谱柱/前处理小柱： ProElut AL-N 1000mg/6ml 30/pkg商品编号： 65306样品前处理： 1 样品准备/提取1）、称取已粉碎（已均质）的样品1 g于15 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol/L苯磺酸溶液、1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液、0.4 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和8 mL乙腈，涡旋混合2 min，4000 rpm离心1 min；2）、将上清液转移至50 mL离心管中，残渣按照步骤1重复提取一次；3）、合并两次提取液，并加入6 mL三氯甲烷和7 mL水，涡旋混合1 min，4000 rpm离心1 min；4）、取下层清液于旋蒸瓶中，向上层清液加入6 mL三氯甲烷，重复提取一次；5）、合并两次下层三氯甲烷溶液，40℃减压蒸至近干，加入5 mL乙腈待净化。2 SPE柱净化——ProElut Al-N（1 g/6 mL）（Cat.#：65306）上层ProElut SCX（500 mg/3 mL）（Cat.#：63604）下层(1)活 化：加入10 mL乙腈，流出液弃去； (2)上 样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)淋 洗：加入5 mL乙腈淋洗小柱，流出液弃去，并去掉上层Al-N小柱；(4)洗 脱：加入5 mL5%氨水乙腈，收集洗脱液；(5)重新溶解：将洗脱液在40 ℃下减压蒸干，1 mL定容液*溶解残渣，过微孔滤膜供HPLC分析。*定容液：乙酸铵缓冲液：盐酸羟铵溶液=2：1乙酸铵缓冲液：乙腈：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)=75:25；盐酸羟铵溶液：取1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液用水定容至100mL色谱条件： 分析条件色谱柱：Platisil ODS，250 x 4.6 mm，5μm（Cat.# 99503） 流 速：1.0 mL/min 检测器：UV 591 nm和UV 266 nm 柱 温：30 ℃ 进样量：20 μL 流动相：A：乙腈 B：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)作者： 天津迪马实验室关键字： 水产品，孔雀石绿，结晶紫，Platisil ODS，99503，ProElut SCX，63604，ProElut Al-N，65306摘要： 本方法适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。http://www.dikma.com.cn/Public/Uploads/images/kongqueshilvjiejingzi1(5).PNGhttp://www.dikma.com.cn/Public/Uploads/images/kongqueshilvjiejingzi2(4).PNGhttp://www.dikma.com.cn/Public/Uploads/images/kongqueshilvjiejingzi3(3).PNG图例：孔雀石绿，结晶紫

水产品孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫快速筛选法一、方法原理：水产品中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物经过提取净化后，样液经过孔雀石绿专用SPE小柱富集衍生化后，浓缩于白色点滴板上，可在板上形成绿色或紫色环斑，由此准确定性样品中是否含有孔孔雀石绿或结晶紫。二、所需设备及试剂1、孔雀石绿、结晶紫快速检测试剂盒（中国检验检疫科学研究研制北京陆桥商检新技术公司生产）2、蒸馏水或纯净水3、绞肉机（现场可用研钵替代）4、固相萃取机（现场可用吸耳球替代）5、离心机 4000转/分以上（现场可用过滤的方法）6、聚丙烯离心管 100mL7、量筒 100mL。8、白色点滴板三、操作过程：1、样品处理：a、取水产品可食部分用绞肉机绞碎后准确称取10.0g于100mL离心管中，加入提取剂1、提取剂2振摇5分钟后于离心机离心5分钟，取上清液于100mL量筒中；b、用剪刀剪取约10g样品于研钵中加入提取剂2研碎后再加入提取剂1继续研磨，过滤挤干残渣收集滤液于100mL量筒中。2、过层析柱：在1中样液加入5mL稀释液，用蒸馏水定容至60mL，分次全部加入层析柱中，每次加满柱子的样本量约为3mL。用吸耳球从上口加压或用固相萃取机负压吸干，加快流速，建议3mL样本通过柱子的时间为0.5min。待样液完全流干后加2mL洗涤剂及2mL蒸馏水先后洗涤层析柱。3、观察结果：观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有有色孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有有色结晶紫；加0.8mL试剂3将其洗脱下来用离心管1收集，看液体颜色。4、衍生化：用2mL试剂3及2mL蒸馏水先后洗涤层析柱后将衍生化试剂倒入层析柱中，再加入2mL蒸馏水挤干，将3中的离心管理1中样液加入柱中剂干，用离心管2收集流出液，再用0.8mL洗脱液洗脱,用离心管2收集混匀。5、萃取：取4中的离心管2，加入0.5mL蒸馏水后加0.5mL萃取剂，扣上管塞混匀静置，下层若有明显的绿色或紫色则可判断样品中含有孔雀石绿或结晶紫，无若明显的绿色或紫色需进一步的判断。6、检测：取离心管2中的下层萃取液于白色点滴板上，样液渐渐挥干，若在点滴板上形成绿色斑环说明样品中含有孔雀石绿，形成紫色斑环样品中含有结晶紫。四、检测下限: 孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫检测下限为2ug/kg 。北京陆桥商检新技术公司(专业分析实验室供应商)区域经理 贾志增联系电话：010-52029052传 真：010-52029051E – mail ：jiazhizeng163.com邮寄地址：北京市朝阳区高碑店北路甲3号邮 编: 100025

最近朋友在做GB/T 20361-2006 水产品中孔雀石绿的提取，提取时要加入乙腈和二氯甲烷，标准上有机相应该是在下层，而朋友做的时候有机相在上层，每一步都是按标准来的，请问这是什么原因呢？

由于孔雀石绿和无色隐性孔雀石绿均为脂溶性化合物,在鱼体内和环境中残留时间长,并有致突变、致畸和致癌的危险性,因此其是否可作为水产养殖业中使用的兽药在国际上引起了争论。加拿大于1992 年就禁止其作为鱼场杀菌剂使用,且加拿大和美国均规定在食用鱼等水产品中禁止检出孔雀石绿和无色隐性孔雀石绿。欧盟于2002 年6 月颁布法令禁止其在作为食品鱼的鱼场中使用, 我国也于2002 年5 月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但是,事实上,包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家,从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看,仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象。 基于这些在水产养殖业中非法使用孔雀石绿的现象,各国政府和消费者密切关注，由此引发各国加大力度进行孔雀石绿的监督检查,同时形成一些标准的检测体系。(一)我国的检测标准【 标准编号 】GB/T 19857—2005 【 标准名称 】水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定【 英文名称 】 Determination of malachite green and crystal violet residues in aquatic product【 起草单位 】上海出入境检验检疫局；厦门出入境检验检疫局；广东出入境检验检疫局；福建出入境检验检疫局；江苏出入境检验检疫局；北京出入境检验检疫局；宁波出入境检验检疫局。【 发布日期 】 2005-09-05【 实施日期 】 2005-09-05 【 标准编号 】 SC/T 3021-2004【 标准名称 】 水产品中孔雀石绿残留量的测定.液相色谱法【 英文名称 】 Determination of malachite green residues in fishery products High-performance of liquid chromatography【 起草单位 】 中国海洋大学 国家水产品质量监督检验中心【 发布日期 】 2004-01-17【 实施日期 】 2004-03-01 【 标准编号 】SN/T 1479-2004【 标准名称 】进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法【 发布日期 】2004-11-17【 实施日期 】2005-04-01【 发布单位 】国家质量监督检验检疫总局（二）美国的检测标准1.美国FDA规定的孔雀石绿及其代谢产物实验室检测标准 【 标准编号 】 LIB4363【 标准名称 】鱼和虾中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的LC-VIS法和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]n法【 英文名称 】 Quantitative and Confirmatory Analyses of Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fish and Shrimp【 起草单位 】U.S. Food and Drug Administration, Animal Drugs Research Center, Denver, CO【 发布日期 】 2005-11 【 标准编号 】LIB4333【 标准名称 】测定和确认鲑鱼中隐性孔雀石绿的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]方法【 英文名称 】Determination and Confirmation of Leucomalachite Green in Salmon: Laboratory Information Bulletin 4333【 起草单位 】Animal Drugs Research Center, Food and Drug Administration, Denver, CO【 发布日期 】2004-11 【 标准编号 】LIB4334【 标准名称 】快速液相色谱法测定鲑鱼中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的方法【 英文名称 】Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detection【 起草单位 】Food and Drug Administration, Animal Drugs Research Center Denver Federal Center, P.O. Box 25087 Denver, CO 80225-0087【 发布日期 】2004-11 【 标准名称 】美国FDA关于孔雀石绿检测方法4333和4334的补充【 英文名称 】Amendment: Application of Laboratory Information Bulletins 4333 and 4334 for the Determination of Leucomalachite Green and Malachite Green Residues in Catfish, Basa, Tilapia, Trout, and Shrimp 【 发布日期 】 2005-10 2. 美国AOAC协会期刊规定的液相色谱检测方法（J.AOAC Int.1995,78(6):1388-1393 ） 该方法常被等同采用。（三）日本修订孔雀石绿限量标准2006年5月30日，日本厚生劳动省发布食安发第0530002号通知，根据食品卫生法（1947年第233号法律）第11条第1项的规定，规定动物用医药品孔雀石绿是一种食品中不得含有的成分，并制定了孔雀石绿的试验方法，且试验方法的分析对象为孔雀石绿及隐性孔雀石绿。 该修订公布六个月后生效，即2006年11月30日起生效。 此次修订重新制定了孔雀石绿的试验方法，同时向《修订后食品卫生法第11条第3项的相关法令的调整》（2005年11月29日食安发第1129001号当职通知）的附表3中追加如下内容，自2006年11月30日起生效。 农药名称 检出界限（ppm） 孔雀石绿* 0.002 *孔雀石绿的分析对象包括：孔雀石绿及无色孔雀石绿（孔雀石绿的代谢物） 此次修订生效前，暂且施行厚生劳动省制订的一项标准，限量0.01ppm（2005年厚省劳动省告知第497号）。

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液相色谱法测水产品中孔雀石绿前处理时用涡旋代替匀浆，可以吗？涡旋多长时间合适？

液相色谱法测水产品中孔雀石绿前处理时将50ML离心管中下层液体时如何转移，用什么工具更准确？

（现行有效）GB/T19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定（现行有效）GB/T20361-2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法（现行有效）NY/T1756-2012 饲料中孔雀石绿的测定（现行有效）SN/T1768-2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法（现行有效）SN/T3540-2013 出口食品中多种禁用着色剂的测定 液相色谱-质谱/质谱法（现行有效）SC/T3021-2004 水产品中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱法（现行有效）DB13/T1358-2011 养殖用水中孔雀石绿快速测定方法 激光拉曼光谱法（现行有效）DB21/T2288-2014 养殖水体中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱串联质谱法（现行有效）DB22/T1617-2012 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定液相色谱-质谱/质谱法（暂无文本）（现行有效）DB34/T1421-2011 水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定 酶联免疫法（现行有效）DB37/T1780-2011 水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定 液相色谱法（暂无文本）（已作废）NY/T1756-2009 饲料中孔雀石绿的测定（已废止）SN/T1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法（已废止）DB33/T598-2006 水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的测定——液相色谱-串联质谱法（已废止）DB44/T526-2008 水产种苗中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱荧光法（2016-10-31废止）（暂无文本）（已废止）DB44/T539-2008 水产品中孔雀石绿残留量的快速测定 液相色谱法（2016-10-31废止）（暂无文本）（已废止）DB44/T570-2008 水体中孔雀石绿残留量的测定—液相色谱荧光法（2016-10-31废止）（暂无文本）（已废止）DB44/T573-2008 底泥中孔雀石绿残留量的测定—液相色谱荧光法（2016-10-31废止）（暂无文本）

SN/T 1768-2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法 [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=65371]孔雀石绿行标[/url]

液相色谱法测水产品中孔雀石绿前处理在净化时5ML乙腈活化，再用两个2.5ML乙腈洗茄形瓶，再加入3ML乙腈+乙酸铵溶液，最后定容 至3ML，为什么我过完小柱都超过3ML了呢，有什么方法？