全自动病原菌检测

夏秋季气温高、湿度大，加之近期长江流域进入梅雨季节，气候潮湿闷热，有利于肠道致病菌和霉菌的生长繁殖，若食物加工贮存不当、生熟交叉污染，或未完全加热，致病菌都在食物上大肆生长繁殖，不仅会造成食物变质，还会引起食物中毒。常见的食物中毒可分为四类：细菌性食物中毒、霉菌毒素与霉变食品中毒、化学性食物中毒与有毒动植物中毒。其中细菌性食物中毒是我国食物中毒事件的最主要原因。数据显示，2018年全国25个省通过突发公共卫生事件信息报告管理系统报告食物中毒事件共291起，中毒人数7856人，其中细菌性食物中毒事件107起，中毒人数4958人。在细菌性食物中毒中，常见的病原菌为沙门氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、致泻大肠埃希菌等，其中我国近年来较为常见和高发的是沙门氏菌引起的食物中毒。在食品安全领域，国家颁布了多项法律法规文件，如《中华人民共和国食品安全法》、 GB 29921-2021《食品安全国家标准预包装食品致病菌限量》、GB 4789《食品安全国家标准 微生物检测方法》、卫生行业标准等，其中对病原菌具体的检测方法主要参照GB 4789食品安全国家标准。《WS/T 81-1996 副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则》《GB 4789.7-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》在对病原菌进行检测时多采用传统培养法，存在大量人工操作，费时费力。检测时间往往需要两天以上，而对食物中毒事件的处理需要快速、高效地完成，这让微生物检测领域的自动化设备成为一种更优选择。【杭州大微食物中毒快速检测】DW-ES800型 微生物实时检测系统DW-BT100型 快速微生物定量检测系统食物中毒检测流程【杭州大微食物中毒解决方案】第一步：样本采集DW-28系列 水中微生物膜过滤装置仪器是对“包含少量微生物污染”水样进行微生物检测的新一代仪器，用于食品、化妆品、环境监测等水中微生物质量控制。第二步：重量稀释DW-JURAY系列 微生物样品自动重量稀释仪仪器用于食品、药品、化妆品等含微生物样品的前处理自动稀释，仪器可自动计算并完成对任意重量样品的准确稀释，使工作简易化，提高效率。第三步：样品均质DW-4型 拍击式均质器仪器是微生物实验室进行“样品匀液”制备的最佳工具，可对样品进行均质处理，独有的静音设计可使您摆脱噪音困扰。第四步：螺旋接种DW-L2000型 全自动微生物平皿螺旋接种仪仪器是依据阿基米德螺旋，以递减比率自动接种样本，可实现标准化生成大量单颗菌落，方便后续菌落计数、分离纯化等需求，广泛用于食品、化妆品、药学实验等微生物实验室。第五步：培养DW-100A-K系列 智能厌氧微生物培养系统仪器服务于食品安全国家标准所需的厌氧菌和微需氧菌培养，可根据需要选择特定氧气浓度（1%-15%可选）和CO2浓度（5%-15%可选），能够快速生成环境，微需氧最快约2min，厌氧最快约4min，仪器稳定可靠，确保重现性100%。第六步：生化鉴定/药敏分析DW-M80型 自动微生物生化鉴定系统仪器通过生化反应原理捕获细菌生化表型特征，对微生物进行鉴定，可用于食源性致病菌的分离鉴定和耐药分析，可鉴定550种以上常见微生物，广泛运用于食品安全、市场监督管理部门、疾控等微生物实验室。【如何预防细菌性食物中毒？】养成良好的卫生习惯，用餐前应洗手，改变生食等不良饮食习惯。选用新鲜食材，对食物进行彻底清洁、加热熟透后才能食用。食物加工环节保持清洁，定期做好食具、加工工具以及容器的消毒。加工后的食物应尽快食用，或低温储存，并尽可能缩短储存时间，再次食用前应彻底加热。生熟食物应分开保存，防止交叉污染。

吉林检验检疫局建立的金标法检测单核细胞增生性李斯特氏菌技术作为当今检测病原体和诊断疾病方面最为敏感的免疫学技术之一，不仅操作简便、快速、特异，更为重要的是适用于广大基层食品监管部门的现场检测和诊断，这些特点都是其他免疫学方法所无法比拟的。　　该技术不仅具有巨大的发展潜力，而且还具有广阔的市场和应用前景，如可适用于医疗卫生行业，出入境食品口岸抽查和鉴定、流通领域卫生监督和工商行政部门和质监部门的食品企业监管等，甚至可以走进餐馆、家庭进行简易的食品自控和检测等。　　由吉林出入境检验检疫局承担的国家质检总局科研课题《应用化学发光探针及免疫金标法检测食品中多种致病菌的研究》在2011年获得了国家质检总局“科技兴检”三等奖。该课题建立的化学发光探针检测技术能够快速检测食品中常见的四种病原菌：空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌。其中对单核细胞增生性李斯特氏菌还建立了应用免疫胶体金试纸条的快速检测方法。　　急需速测技术　　我国的食品生产加工企业数量多，规模小，较分散，而且为数较多企业过分追求利润法律意识淡薄，社会责任心不强导致其产品质量良莠不齐。　　据报道，我国45万个食品生产企业中，员工人数10人以下的食品生产加工小作坊就有35万家，约占80%，因而导致食品安全事故时有发生，给社会和消费者的健康造成了巨大危害。　　而目前的食品卫生监管的检测手段主要依据国家标准或行业标准规定方法进行，虽然这些方法准确可靠，但这些方法一般都需要建设专门的微生物检测实验室，配备专业的检测技术人员，需要较长的检测周期，由此造成的检测成本过高，缺乏时效性等问题，使一些突发的食品安全事件不能迅速得以解决。因此发展和建立一种快速、简便、灵敏准确的检测技术，作为标准检测方法的初筛技术，是解决上述问题的有效手段之一。　　食品检验新兵　　化学发光探针技术的原理是互补的核酸单链会特异性识别并结合成稳定的双链复合物。这一检测系统利用一个标记有化学发光物的单链DNA探针，可以特异性的识别和结合目标微生物的核糖体RNA。微生物中的核糖体RNA释放出来后，化学发光标记的DNA探针就与之结合形成稳定的DNA-RNA杂合体。标记的DNA-RNA杂合体会与非杂交探针分离，并在化学发光检测仪中进行测量。样本的检测结果通过计算与阴性对照进行比较得出结果。利用化学发光剂标记和检测核酸使得许多非放射性标记检测的灵敏度达到甚至超过了同位素标记测定。　　在众多的化学发光体系中，应用最多的化学发光体主要有三类：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性磷酸酶催化的1，2-二氧环己烷发光体系。吉林检验检疫局建立的化学发光技术使用吖啶酯标记核酸探针。　　利用化学发光杂交保护分析的原理检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌4种致病菌特异性RNA序列，这种方法无需物理分离，利用吖啶酯标记DNA探针，通过核酸杂交保护分析法，即应用人工合成的靶DNA保守区的寡核苷酸，在合成时引入一个烷氨基的手臂，经活化后接上吖啶酯，制成化学发光探针。　　杂交后无需分离步骤，而是利用差分水解来鉴别，即加入碱性溶液，游离的发光探针遇碱水解失去发光特性，而与特异性目的片段结合的探针形成DNA-RNA杂交体，由于吖啶酯是平面结构很容易进入双螺旋的内部而获得杂交保护，水解速度缓慢(半衰期达10分钟以上)，仍有发光性能，可以在发光仪上显示化学发光信号，从而实现对病原菌的检测。　　应用前景广阔　　该项目利用胶体金技术研制了胶体金检测试纸条，用于单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测，该检测试纸条的灵敏度高，具有很强的特异性，不同批次生产的免疫胶体金具有良好的检测重现性，稳定性好，操作简单，检测时间只需10至20min即可报告结果，胶体金法无污染，不会危害操作者以及环境。胶体金抗体复合物在冻干状态下室温储存相当稳定，有效期长 此外胶体金技术还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产品永不褪色等优点，适合于食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的初筛检验。　　吉林检验检疫局建立的基因探针化学发光检测方法可在30分钟内快速确定病原体，并可直接于固体或液体培养基上鉴定目标微生物。该方法可直接应用于国外生产的LEADER 50i检测仪上，仪器自动注入检测试剂，立刻测量标记物所产生化学反应的化学发光强度，并自动计算结果及打印报告，该检测方法敏感性高，特异性强，检测成本低，操作简便、快速，对我国食品安全快速检测和监控工作具有重要意义，具有广泛的推广前景。胶体金快速检测试纸

导读尽管各国卫生系统发展迅速，但由病原菌引起的传染病仍然是人类健康的主要威胁之一。据报道，全世界每年有220多万人死于水传播大肠杆菌病原体。尽管大多数大肠菌群是无害的，但某些大肠杆菌的存在可能会导致甚至威胁到人类健康，例如，大肠杆菌O157:H7和其他产志贺毒素的大肠杆菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常见因素，可能对健康造成严重后果，尤其是对幼儿。因此，检测大肠杆菌对于生物医学应用以及食品、水和空气质量监测非常重要。大连理工大学环境科学与技术学院，工业生态学与环境工程教育部重点实验室的科学家，开发出基于naica全自动微滴芯片数字PCR系统的单细菌检测方法，该方法可以在1.5小时内以单细胞灵敏度选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌 。该方法发表在《Analytical Methods》，题为“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。应用亮点：▶ dDRCA系统，能够快速、选择性地检测具有单细胞敏感性的大肠杆菌 ，dDRCA系统的检测灵敏度比之前报道的PAD高1000倍。▶ 证明了dDRCA系统在尿路感染诊断中的潜在临床适用性，dDRCA能够在不到1.5小时内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。文中采用naica️全自动微滴芯片数字PCR系统液滴微流控技术，快速精准的检测到复杂样本和高背景样本中的致病大肠杆菌。通常扩增需要约4小时进行定量大肠杆菌检测。在这项研究中，我们描述了DNA酶偶联滚圈扩增（RCA），这是一种高效的等温酶DNA复制过程，可在naica️全自动微滴芯片数字PCR系统上进行，以建立液滴DNA酶偶联RCA（表示为dDRCA）系统。我们进一步证明，该系统能够在1.5小时内以单细胞敏感性选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌。▲图2（a）通过琼脂糖凝胶电泳分析RCA产物（RP）。（b） 反应混合物在指示反应条件下的荧光响应：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line) RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line) RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line) + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3阅读器图像（左）、CLSM图像（中）和荧光显微镜图像（右）为微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反应条件下dDRCA系统的荧光图像和荧光滴数：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli （e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (f) -RFD-EC1/+ RDS/ E. coli (g) + RFD-EC1/+ RDS/ E. coli.使用Naica Prism3阅读器对生成的荧光液滴进行成像和分析。dDRCA系统能够在75分钟内选择性计数具有单细胞敏感性的大肠杆菌，包括20分钟的细胞裂解时间、12分钟的液滴生成时间和43分钟的液滴反应时间。通过比较其他三种常见细菌，包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）存在时的信号反应，也检查了dDRCA检测大肠杆菌的选择性。当用缓冲液或尿液中的这些意外靶点测试每个dDRCA系统时，未观察到明显的荧光液滴（图4c和S4†）。▲图4（a）不同大肠杆菌浓度（每毫升细胞数）下dDRCA反应的荧光图像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同浓度下计数的液滴数与大肠杆菌之间的关系。提供了计数的液滴数量，插图显示了1–104大肠杆菌范围内的线性反应。误差条代表三个独立实验的标准偏差。（c） dDRCA的特异性。最终证明了dDRCA系统在尿路感染（UTI）诊断中的潜在临床适用性。分析了20份患者和健康献血者的临床尿样。整个操作程序包括：（1）细胞收集和裂解（25分钟）；（2） 液滴生成（12分钟）；（3） 液滴反应（43分钟）。如图5c所示，五个尿样，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿样产生大量荧光液滴（3000）。使用传统的大肠杆菌培养方法进一步确认了这些有无大肠杆菌感染的样本（图5d）。因此，对UTI的诊断有很大的希望。▲图5（a）检测尿液样本中的大肠杆菌。（b） 显示尿液样本中计数数与大肠杆菌细胞在1-104范围内的线性相关性的曲线图。（c） 20份临床尿液样本中阳性液滴的数量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖电解质缺乏）琼脂细菌尿液培养板。黄色菌落代表大肠杆菌在37℃的CLED琼脂中培养22小时后的生长。该系统能够在不到1.5小时的分析时间内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。原文：https://doi.org/10.1039/D2AY00656Anaica六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。