分光光度计说明书

李昌厚(中国科学院上海营养与健康研究所 上海 200233)李菁菁（上海中医药大学公共健康学院 上海 201203）摘要：本文根据仪器学理论[3]并结合作者的实践，对紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽的选择方法进行了研究，并对有关问题进行了讨论。本文可供从事紫外可见分光光度计研发、制造、使用和维修的科技工作者参考。0、前言紫外可见分光光度计是目前国际上使用最多的常规分析仪器之一，但如何选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（最佳浓度范围）和光谱带宽，很多从事分析工作的科技工作者没有引起重视。对使用者来说，选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽，是用好紫外可见分光光度计最关键的问题之一，也是一门很深的学问。作者根据仪器学理论和自己的长期实践，对如何选择最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和选择最佳光谱带宽及有关问题进行了研究，提出了选择的方法，并对有关问题进行了讨论。1、吸光度范围（或试样浓度范围）的选择1．1、认真选择最佳吸光度（Absorbance－Abs）范围的重要性[1] 、[2]根据比耳定律[3]，吸光度（Abs）与试样的浓度（C）成正比。所以，不同的浓度范围内测量(即不同的吸光度范围内测量)，会引起不同的误差。这一点，所有使用紫外可见分光光度计的分析工作者，都必须高度重视。有时，很多科技工作者，在工作中往往忽视这个问题，例如：作者曾看到有一位分析人员，用一台光度噪声为0.005Abs的紫外可见分光光度计分析小于吸光度为0.005Abs的样品。她的工作做了很长时间，一是测试结果不稳定，二是结果比标准值小很多，总是得不到可靠的结果。于是，她开始怀疑所用的紫外可见分光光度计仪器有问题，后来，请制造厂的工程师来维修仪器，维修工程师一到现场，稍加检查，就立即指出仪器没有问题。但这位使用者仍坚持仪器有问题，制造厂的工程师经过反复检查，断定仪器肯定没有问题，并指出是样品太稀。后来，对样品稍加浓缩，很快就得到了令人满意的测试结果，所测得的数据，与标准值完全一致。还有一位科研工作者，他使用一台中档偏下的紫外可见分光光度计分析食品中的添加剂，他发现所测得的样品含量总是偏低。后来，也怀疑仪器有问题。结果，经维修工程师检修，认为仪器没有问题。最后，发现被分析的样品浓度太高，被测量样品的吸光度值达到2.5Abs。在把样品稀释到0.8Abs后，再反复多次测量，结果非常准确，与文献值完全一致。这两个例子，充分说明在使用紫外可见分光光度计时，对被分析样品的吸光度范围的选择非常重要。1、2、最佳吸光度范围（或最佳试样浓度）选择的原则1．2、1 吸光度范围不能太小（或试样浓度范围不能太稀）为什么吸光度范围不能太小？因为噪声是主要分析误差的来源之一[2] 、[3] ，它限制被分析试样吸光度值的下限。吸光度太小（或试样太稀）时，有用的信号会被仪器的噪声淹没；当光度噪声大到一定程度或样品吸光度小到一定程度时，吸光度就根本不与样品的浓度成正比。甚至会产生试样浓度变稀时，吸光度值反而增大（噪声所致）的现象，以致无法得到稳定的测量数据，产生很大的分析误差。例如：作者曾用某紫外可见分光光度计测试黄曲霉素，因为仪器的噪声太大，测试数据从0.4Abs就开始超过1％的相对误差。作者的实践表明，一般常规分析时，对大多数试样浓度取10µg/ml～100µg/ml（相当0.3～0,7Abs）左右为最佳。1．2．2、最佳吸光度值范围（或最佳试样浓度范围）不能太大为什么吸光度不能太大？因为杂散光是分析误差的主要来源之一[2]、[3]，它限制被分析试样吸光度值的上限，如果试样的吸光度太大，因为杂散光的原因，可能会使分析误差增大。因为杂散光会使分析测试结果严重偏离比耳定律（分析测试结果的数据可能偏小，也可能偏大；若杂散光被试样吸收则测量数据偏小，若杂散光不被试样吸收则测量数据偏大）。如果仪器的杂散光很大、被分析的试样吸光度值太大，吸光度就根本不与试样的浓度成正比，甚至会产生试样浓度增大时，吸光度值反而减小等反常现象。1．3、 试样浓度的选择原则1．3．1、试样不能太稀（理由如1．2、1所述）1．3．2、试样不能太浓（理由如1．2、2所述）1．3．3、在试样量允许时，试样的浓度应选择靠近最佳吸光度值（0.434Abs）。因为，从理论上讲，比耳定律在吸光度值为最佳值0.434Abs时，分析误差最小 。所以，如果被测试样太浓时，应向靠近0.434Ab的方向稀释。假设被测试试样太浓，达到2Abs左右，这时，应稀释到1Abs以下，但要注意不能太稀。在不同的吸光度上测试，相对误差和绝对误差都不同；作者研究的结果如下：（设仪器给出的△T=0.3%T；目前，国际上的高档紫外可见分光光度计一般都给出△T=0.3%T）。2、最佳光谱带宽的选择[4]、[5]、 [6]2．1、认真选择光谱带宽（Spectrum Band width）的重要性光谱带宽是紫外可见分光光度计主要分析误差的来源。我国广大的分析测试工作者，对紫外可见分光光度计光谱带宽的重要性并没有引起重视。甚至，有的分析工作者，根本就没有认识到光谱带宽会影响分析误差，这是影响我国紫外可见分光光度计仪器和应用水平提高的重要原因之一。作者在长期的实践中深深体会到，光谱带宽是非常重要的技术指标，并对它进行了认真研究[2]、[4]。作者为了研究光谱带宽对分析误差的影响，曾对青霉素钠、青霉素钾进行过测试研究。我国药典规定对青霉素钠、青霉素钾的分析测试用1nm光谱带宽，但作者对同一种浓度的青霉素钠测试用2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.805Abs；用1nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.825Abs；用0.3nm光谱带宽测试时， 吸光度值为0.865Abs；用0.2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.823Abs。实践证明，0.3nm光谱带宽测试时吸光度值最大，2nm光谱带宽测试的结果比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.060 Abs，1nm光谱带宽测试时，吸光度值比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.04Abs，说明0.3nm光谱带宽是最佳光谱带宽。2nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.06Abs，相对误差为△A/A＝0.06/0.865=0.69(6.9%)；1nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.040Abs，相对误差为△A/A＝0.046(4.6%)。由此可见，光谱带宽的重要性是不言而喻的。但是，在实际工作中，有许多科技工作者很不重视光谱带宽问题。例如：我国某地的某某制药厂，采用国外某公司的紫外可见分光光度计作为质检仪器，该仪器的光谱带宽为5nm，根本不符合我国和世界各国药典规定用于药品检验的紫外可见分光光度计，其光谱带宽应为2nm的要求。作者从理论上计算，5nm光谱带宽的紫外可见分光光度计，若要用于药品检验，其测试误差为3%，而很多药品检验时，药典规定要求其分析误差在1％以内。所以，使用者一定要高度重视紫外可见分光光度计的光谱带宽的选择。2．2、光谱带宽选择的原则[2]2．2．1、根据分析工作的误差要求选择光谱带宽因为不同的光谱带宽对同一种药品进行分析测试有不同的误差，所以，不同行业应对光谱带宽有不同的要求。使用者应根据分析工作的误差要求来选取不同的光谱带宽。特别是制药行业、科研工作或要求较高的使用者，更应如此。2．2．2、光谱带宽不能过大或过小的原因我们应根据被分析样品对误差的要求，选用不同的光谱带宽来进行分析测试。一般来讲，不同的试样要求用不同的光谱带宽来分析，并且，我们应该选择最佳光谱带宽或选择靠近最佳光谱带宽的光谱带宽来分析，才能得到最佳分析结果。有些科研工作者以为光谱带宽越小越好（分辨率高），也有科研工作者以为光谱带宽越大越好（能量大，灵敏度高）。其实不然，如前所述，作者对同一浓度的青霉素钠、青霉素钾的测试就很好的说明了问题。2．3、光谱带宽与分析误差的关系在理想状态下[7]、 [8]，光谱带宽与分析误差的关系如表2：表2 在理想条件下，A obs与SBW在吸收极大时的关系[4]RBWA obs/ARBWA obs/ARBWA obs/A0.01000.99950.06000.99830.20000.98190.02000.99950.07000.99770.30000.96040.03000.99950.08000.99700.40000.93210.04000.0.99920.09000.99620.50000.89870.05000.99880.10000.9954表2中：RBW 为相对带宽；RBW＝SBW/NBW；NBW为被测样品的吸收带半宽度，指样品的吸收值达到最高峰值之半的两点间的波长间隔；A obs为吸光度实际测量值；A为吸光度理论值。表2 可供分析工作者用来修正实验值，但只适用于吸光度实际测量值小于1.0时的情况。因为一般的常规分析中，被测样品的实际测量吸光度值基本上都小于1.0，所以，表2具有实际参考价值。有学者对光谱带宽与分析测试误差的关系进行过研究，如Owen[5] 研究后指出：当仪器的光谱带宽（SBW）与被测样品的自然带宽（NBW，即吸收带半宽度，一般为20nm）之比小于或等于1时（即SBW/NBW≦0.1时），该光谱仪器可满足99％的样品的分析测试工作，且分析测试的准确度在99.5%以上。这也是我国和世界各国药典规定用于药检的紫外可见分光光度计的光谱带宽要求≦2nm的原因。曾有文献[6] 报道过光谱带宽对分析测试误差的影响，此不赘述。作者研究过光谱带宽对青霉素钠、青霉素钾定量分析的影响，发现青霉素钠定量分析的最佳光谱带宽与药典规定不一致（药典规定:取本品加水制成1ml含1.80mg的溶液，… … ，用1nm光谱带宽、在264nm处测试，吸光度应为0.80-0.88）。笔者在药典规定的条件下，将光谱带宽从1nm开始减小，一直减到0.3nm,其峰高一直在增高！但低于0.3nm时，峰高就开始下降。这说明青霉素钠的最佳光谱带宽是0.3nm，而不是1nm。为此，作者向当时国家药典委员会的专家张淑良先生（上海药检所）反映，他们接收了此意见。所以，今天的药典委员会已经去掉了每一种药品，一定要采用多大的光谱带宽检测了。笔者根据表2计算：当SBW为2nm以下时，由于SBW引起的分析测试的相对误差小于0.5%；但是，当SBW为5nm时，分析测试的相对误差将达到2.7%。可惜，我国有很多分析工作者不注重这个问题，有些药厂用SBW为5nm的UVS来作质量控制，其仪器本身的误差就远远超过我国药典规定的1％的要求，这必须要引起我国广大药检工作者重视。3、讨论3．1目前，国内外很多科技工作者经常将光谱带宽和狭缝宽度混为一谈,很多仪器制造商经常在自己的说明书中说：“狭缝宽度为XXXnm”，这是不对的。因为在光谱仪器中，狭缝宽度以mm计，而光谱带宽以nm计,二者相差一百万倍（106）。所以只能说“光谱带宽为XXXnm”，而不能说“狭缝宽度为XXXnm”。同时还必须注意，光谱仪器的狭缝宽度制造商一般是不会告诉使用者的，因为它涉及到仪器设计时所选用的准直镜焦距、光栅和物镜的焦距等指标。所以，我们对仪器的技术指标描述应该注意科学性、国际接轨和规范性。3．2 有许多紫外可见分光光度计使用者，很不注重对吸光度范围的选择,他们不了解不同浓度（或吸光度）分析时，有不同的分析误差。因此，往往在样品前处理上有时比较马虎,。他们此外，也不大注意或不懂得将样品稀释到最佳浓度范围,这是很多使用紫外可见分光光度计的分析工作者应该特别引起重视的问题。3．3目前，国外有些紫外可见分光光度计制造商,在自己的说明书中写某某最高级的紫外可见分光光度计，仪器的最大光谱带宽为8nm（特别是在招标时，作为仪器的“特点”提出)，这完全在误导使用者。因为，从文献[2]可以非常简单计算出，光谱带宽为8nm时，分析测试结果的相对误差达到了6.79%。而紫外吸收光谱分析是一种精密分析，有些样品（如药品）分析时，要求相对误差小于1%。例如：世界上许多国家的药典规定，用于药品检验的紫外仪器，要求的光谱带宽为2nm，此时的相对误差只有0.5%。所以，在高档（或最高级）的紫外可见光分光光度计中，写出光谱带宽为8nm是不合适的。4、主要参考文献[1]陈国珍主编，紫外可见光分光光度法，原子能出版社（北京），1983.[2]李昌厚著，紫外可见分光光度计，北京：化学工业出版社，2005[3]李昌厚著，仪器学理论与实践，北京：科学出版社，2008[4]李昌厚，光谱带宽对分析误差影响的研究，分析测试技术与仪器，，10(2)，65～67，2004[5]T. Owen, Fundamentals of UV-Visible Spectroscopy,© Copyright Hewlett-Packard Company, Printed in Germany 09/96，Hewlett-Packard publication number 12-5965-5123E[6]E.disbury, J. R. Practical Hints on Absorption Spectrometry,UV/Visible,NewYork, Plenum Press,1967作者简介李昌厚，中国科学院上海营养与健康研究所研究员、教授、博士生导师、国务院政府津贴终身享受者；原仪器分析室主任、生命科学仪器及其应用研究室主任；曾任华东理工大学等兼职教授、上海化工研究院院士专家工作站专家委员会成员、中国仪器仪表学会理事、中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届和第六届副理事长、全国光谱仪器专业委员会副主任、全国高速分析专业委员会副主任、原国家认监委实验室计量认证/审查认可国家级常任评审员、《生命科学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、国家科技部多项重大仪器及其应用专项的专家组组长等职。主要从事各类光谱和色谱仪器及其应用研究；在仪器学理论、分析仪器性能指标的测试方法、光电技术等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成了15项科研成果，其中5项获得省部级以上科技奖励（含国家发明奖1项）；发表论文280篇（退休后97篇）、出版了：仪器学理论与实践、光谱仪器及其应用、色谱仪器及其应用等的专著5本。曾先后任北京普析、美国ISCO等国内外十多家高科技公司的专家组、顾问组组长、《仪器信息网》、等多个高科技学术团体的技术专家顾问或专家委员会成员等学术团体的领导职务。

p　　在8月份刚刚出版的2017年日本《支撑科学与产业发展的分析仪器· 科学设备遗产》中，日立高新公司研发的“日立分光光度计139形(型)”是77件遗产中的一个。/pp　　据悉，这套光度计于1961年研制成功。当时日本社会正处于战后复兴期，化工、食品、药品行业对各种分析仪器的需求非常的大，日立高新的研发解决了社会对这方面的需求，推出的这款光度计，能够用来测定光谱，通过与已知光谱的对比，得知测定物质的特点。日立高新在139形之后，推出了101形(售出2万套)及100系列，为日本在光谱测定上发挥了巨大的作用，时至2017年日立高新生产的U-5100形依旧传承着139形光度计技术。/pp　　在今年JASIS的展示会上，日立高新拿出了“日立荧光指纹测定专用系统”。日立高新技术人员介绍说，每种物质都像人有各自的指纹一样，通过三元荧光光谱的测量，能识别出各种物质独特的“指纹”。比如同样的大米，由于产地及生产时间的不同，各自的荧光指纹是不一样的。在日本喂养的食用牛“和牛”价格不菲，如果有人拿进口牛冒充和牛的话，通过荧光指纹测定，对荧光指纹进行对比，马上就能找出测试样品的产地。/pp　　日立高新公司董事、科学· 医用系统事业营业本部本部长高木幹夫对记者说：“有些保健药在说明书上写得天花乱坠，但人吃了不一定有用，也不会马上显现出对身体的危害。通过荧光指纹测定系统，对所谓的保健药测试一下，马上就知道这个药是否真的管用，是不是混合了有害物质。”/pp　　记者查阅媒体对相关测试系统的报道，看到某日本保健药厂家生产的“保健药”不仅对身体无益，而且会有很大的副作用的消息。日本媒体在报道中说，揭露假保健药时使用的测试机器就是日立高新公司的产品。/pp　　从光度计遗产到荧光指纹测定系统，日立高新的技术一直在不断向更深更广发展。对于今后日立高新在仪器方面的研发及业务发展，高木对记者说：“过去我们按领域进行分类，现在我们根据商业模式特点，将公司业务划分为仪器和材料两大类。”其中仪器又分产业系统、科学· 医用系统及电子设备三部分。通过这样的组织形式，该公司在不断研发新的分析及科学仪器。/pp　　如果下一次再次出版《遗产》方面的书籍，与IT相关的产品将更多，系统及电子设备将变得更为重要。从日立高新的发展方向看，日本的分析及科学仪器今后会把更多的侧重点也放在了这里。/pp　　日本企业在奋力研发新的分析仪器及科学设备的时候，没有忘记回过头去总结一下自己走过哪些路、哪些产品对相关产业的发展发挥了重要作用。/ppspan style="font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai "　　日本企业在奋力研发新的分析仪器及科学设备的时候，没有忘记回过头去总结一下自己走过哪些路、哪些产品对相关产业的发展发挥了重要作用。/spanspan style="font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai "东京大学名誉教授二瓶好正说，在认定相关遗产的时候，首先是官产学三方加上博物馆的专家设计制度，然后参与各种遗产的认定工作。一般比较新的产品就不放入遗产中，只有那些对计测、分析的基础研究、对社会技术革新发挥关键作用的产品才可能被认定为分析及科学仪器遗产。/span/p

紫外可见分光光度计的应用发展很快，本文简单综述全球紫外可见分光光度计的应用及其最新进展。　　1、紫外可见分光光度计的应用现状　　紫外可见分光光度计的主要应用方面，简单综述如下：　　① 粮食系统：对维生素A、C、E、K、山梨酸、苯甲 酸、棉酸、甲脂、乙酸脂、胡萝卜素、烟酸、总氨基酸等的检测 对微量元素，例如： 钾、铁、硒、碘、铜、磷、锰等也可用紫外可见分光光度计检测 特别是对人体有毒有害的微量元素的检测工作中使用更加广泛。　　② 标准片测试：计量部门对在用的各类紫外可见分光光度计仪器的杂散光( SL)、光度准确度(PA) 等关键性能技术指标的检测，必须用比被检测仪器的档次高的紫外可见分光光度计，测试一块石英 片的SL和PA。然后用这块石英片作为二级标准检测被测的紫外可见分光光度计。　　③ 药检系统：我国和世界很多国家的药典，都明确规定许多药品，一定要用紫外可见分光光度计检测 它是药厂和药检系统必备的检测仪器(工具)。　　④ 石油工业：石油里一般都含有芳烃杂质，全世界基本上都用紫外可见分光光度计检测。　　⑤ 水质监测：水里的氨氮、亚硝酸盐致癌物质，一般都用紫外可见分光光度计检测。　　⑥ 环保系统：环境中的有害物质检测、环保材料的检测。　　⑦ 生命科学领域：蛋白质的测试波长为280nm、核酸的测试波长为260nm、氨基酸的测试波长为230nm、糖类的测试波长218nm、多糖的测试波长206nm等等，生命科学领域的这些物质的测试波长都在紫外区。　　⑧ 农药及其残留物：例如:粮食(大米、小麦中的氧化稀土)、食品添加剂(5,-鸟苷酸二钠)、蔬菜(亚硝酸盐、甲胺磷、西维因、氨氮、敌敌畏)、 瓜果、茶叶等的农残检测，大多用紫外可见分光光度计进行。据美国癌症研究中心报道，人类癌症的90%来自有机物(天然有机和金属有机) 其中农残为主。所以紫外可见分光光度计在农残的检测中非常有用。　　⑨ 渔业(水产品)质量控制：海水、淡水鱼类、贝类、虾类、海蜇类等中的苯、总三卤甲烷、甲苯基三唑、多氯联苯、氟、汞等，一般也是采用紫外可见分光光度计检测。　　紫外可见分光光度计的应用远不止这些 ，因为篇幅所限，本文不能做详细综述。对此感兴趣的读者，请参考本文的参考文献[1]、[2]。　　下面主要简单介绍近几年来，国内外紫外可见分光光度计应用的最主要的、最新的进展情况。　　2、多组分不经过分离，直接用紫外可见分光光度计进行分析测试　　&ldquo 褶合谱&rdquo (Convelution Spectrum)，是我国第二军医大学的吴玉田教授和他的同事们发明并成功的得到了应用的一种新技术 它的理论基础是化学计量学。&ldquo 褶合光谱&rdquo 本身是一种新型的软件包，将这个软件包与国产的TU-1901紫外可见分光光度计联用，使得一般常规紫外可见分光光度计只能得到一张紫外吸收谱图的分析检测工作，能得到600～1000张紫外吸收谱图，大大提高或增加了使用者所需要的信息量。　　&ldquo 褶合光谱&rdquo 法不需要对试样经过分离，可以直接用紫外可见分光光度计分析含有六个不同组分的试样。这一发明，对药物分析工作来讲，是一个重大的突破，引起了国内外广大药物分析家们的极大注意。吴玉田教授和我国某医院合作，用&ldquo 褶合光谱&rdquo 法，分析检测复方降压片中的六个组分，得到了非常令人满意的结果：维生素B6的回收率为99.83，精密度为0.16% 维生素B1的回收率为100.45，精密度为0.19% 利眠宁的回收率为99.49，精密度为10.43% 盐酸异丙嗪的回收率为100.44，精密度为0.18% 硫酸双肼肽嗪的回收率为99.31，精密度为0.09% 氢氯噻嗪的回收率为99.23，精密度为0.41%。这一工作(技术)在中国药分上发表后，引起了国内外广大药物分析的科技工作者极大的关注。　　但是，&ldquo 褶合光谱&rdquo 法作为一个软件包，它对紫外可见分光光度计主机的要求很高 最重要的是要求仪器的杂散光很小、光度噪声很小。&ldquo 褶合光谱&rdquo 软件包不能在质量不高的紫外可见分光光度计使用。　　3、新的&ldquo 高阶张量数据解析方法&rdquo 问世　　化学计量学是当前分析测试领域非常热门的学科，&ldquo 高阶张量数据解析方法&rdquo 就是化学计量学方法中的一种 &ldquo 高阶张量数据解析方法&rdquo 是国际上紫外可见分光光度计在应用方面的最新进展之一。&ldquo 高阶张量数据解析方法&rdquo 是由我国湖南大学的俞汝勤教授发明的一项国际领先的科研成果，已获国家自然科学奖。它主要用于复杂体系成分分析。　　复杂体系成分分析一直是分析化学研究的的前沿课题 俞汝勤教授采用紫外可见光谱分析法和电化学方法相结合，创造了&ldquo 高阶张量数据解析方法&rdquo ，并且用它对复杂体系进行研究，独创了多种新的化学计量学方法。在新药开发、疾病诊断、食品科学、产品质控、环境毒性分析等领域有广阔的应用前景。已在中药分析、癌症早期诊断中得到应用。　　4、&ldquo 数学仿真法&rdquo 问世　　近几年，中国的吴玉田教授又提出了&ldquo 数学仿真法&rdquo ，这一个具有独创性的分析方法 &ldquo 数学仿真法&rdquo 又称&ldquo 化学信息的数学修饰&rdquo 法，这是一个非常引人注目的、具有原创性的分析技术 从理念上有所创新 在技术上提出了&ldquo 数学仿真法&rdquo 即通过数学仿真，模拟向待测体系内添加新的化合物，改变和调动可能的干扰 使干扰在指定区域内符合被消除的条件。他们利用这种方法对血竭中龙血素的含量测定，得到了满意的结果。　　5、联用技术的大发展是紫外可见分光光度计应用的又一最新进展　　联用技术是目前分析测试领域值得非常注重的问题，往往一种技术解决不了的工作，几种技术联用，就可能在仪器和应用方面出现一大片新天地。紫外可见分光光度计与其它分析测试技术的联用，是目前世界上紫外可见分光光度计应用的最新进展之一。如，紫外可见分光光度计与HPLC联用；只要把HPLC的紫外检测器去掉，将紫外可见分光光度计接上一只微量流动池，连接到HPLC的色谱柱后，就组成了一个新的、完整的HPLC-紫外可见分光光度计分析系统。用它来作分析工作，能解决单台HPLC或单台紫外可见分光光度计不能解决的许多分析问题。因为，它可以弥补单台HPLC或单台紫外可见分光光度计的缺点。单台HPLC，其检测器的功能、光度准确度、一般都不如紫外可见分光光度计好。但是，紫外可见分光光度计与HPLC联用后，就可解决单台HPLC无法做到的分析工作。也能解决单台紫外可见分光光度计不能解决的分析工作。因为，单台紫外可见分光光度计，它本身没有分离功能，联用后，利用HPLC的高效分离功能，就更能发挥作用，会起到意想不到的分析效果。联用后，新系统的检测器的功能、光度准确度都将大大提高。　　同样，如果将紫外可见分光光度计与FIA(Flow injection analisis)联用，也能得到意想不到的分析测试结果。只要把FIA的检测器去掉，将紫外可见分光光度计接上一只微量流动池，连接到FIA的自动采样阀后，就组成了一个新的、完整的FIA-紫外可见分光光度计分析系统。用它来作分析工作，能解决单台FIA或单台紫外可见分光光度计不能解决的许多分析问题。因为，它可以弥补单台FIA或单台紫外可见分光光度计的缺点。单台FIA的检测器功能、光度准确度，一般都不如紫外可见分光光度计好。而单台紫外可见分光光度计没有富集功能。但是，紫外可见分光光度计与FIA联用后，就可弥补单台紫外可见分光光度计和单台FIA各自的缺点。既能解决单台FIA无法做到的分析工作，又能解决单台紫外可见分光光度计不能解决的分析工作，会收到意想不到的效果。　　还有目前比较受到青睐的LC-MS，它是将质谱计(MS)作为HPLC的检测器，充分利用HPLC的分离能力和MS能够定性定量的优点，组成一种优质的联用仪器，具有广阔的应用前景。　　6、积分光度法进入&ldquo 复兴&rdquo 时期　　所谓积分光度法，就是在常规的紫外可见分光光度计上加一个光学积分球，使得积分球附件，使得常规紫外可见分光光度计不能作或很难作的工作(不透明的固体样品、粉末样品、漫反射样品测试等)能够进行分析测试的一种光度方法。　　所谓光学积分球，就是把一根铝棒(一般是60～150mm内径)切成两半，然后将其挖成空心球，在球的内壁上涂上硫酸钡或燻上二氧化镁(厚度根据需要和制造工艺而定)；这时，在球心放上被测试的物质，则在球内壁的任何地方的漫反射强度都相等。这就是光学积分球的工作原理。　　为了测定粉末样品和不透明样品的镜反射、漫反射或颜色特性曲线等，往往需要在紫外可见分光光度计上安装漫反射检测附件&mdash &mdash 积分球。它可用来检测微弱透光或完全不透光的各类样品的紫外光谱，测量时把积分球置入样品室内。被测样品放进积分球中即可。　　下图是国外两种不同的光学积分球的外形：　　这种光学积分球的分析对象可以是：(1)具有平面的固体例如纸张、布、印刷品、陶瓷器以及玻璃等的色泽；(2)粉末样品，例如化学药品、化妆品、粘土以及颜料等的色泽；(3)柔软物质，例如奶油、果酱、化妆品以及染料等的色泽。　　典型的反射检测附件原理为：来自单色器的光束进入积分球，被反射镜导向不透明的样品上，部分光被样品吸收，其余光被反射，积分球把反射光导向光电检测器上进行检测，检测结果同样由记录器显示出来。　　基于多次漫反射(由朗伯涂层引起)的原理，积分球用于通过外部或内部的照射源而在空间上求辐射通量的积分。积分球的效率由若干因素决定，包括端口的大小和数量，挡板或屏的大小和位置，球体内含物的数量，最重要的是球体涂层的反射和散射特性必须是完美的漫反射。　　积分球的最初用法是测量电灯的几何全光通量。作为不同灯之间光通量输出的简单和快速的比较方法，这个技术起源于20世纪之交，由德国人Richard Ulbricht发明，所以也叫Ulbricht 球。它现在仍然被广泛应用于灯生产的质量控制。　　光学积分球利用Kulbelka-Munk方法，把漫反射率(Reflectance)转化为吸光度(Absorbance)，得到紫外-可见漫反射光谱。其具体计算公式为：　　Kulbelka-Munk方程：　　式中：F(R)为吸光度 R为漫反射率。　　从六十年代开始，因为航天事业的发展，人们非常重视积分光度法。当时主要是用积分光度法测试航天事业中的不透明材料。具体的说，就是用积分光度法研究太阳能谱的分布、测试太阳能谱的能量分布曲线、研究对太阳能谱产生吸收的物质。后来，人们上天了，但从天上取回来的是一些土壤。对人类有多大的关系，一时还不清楚。后来，人们开始把重点转向生命科学，积分光度法开始受到冷落。最近几年，航天技术又开始升温，人们对宇宙、对空间的研究又开始热起来了 同时，生命科学、材料科学又出现大发展，许多不透明的固体、粉末样品都无法用常规的紫外可见分光光度法来分析测试，因此，积分光度法又普遍受到人们的重视，积分光度法又成了热门技术，目前被人们称为&ldquo 复兴时期&rdquo 。　　目前国内外很多科学家非常重视光学积分球的应用，因此可以带积分球附件的仪器也不断推出 　　例如：美国PerkinElmer公司，推出了50mm的积分球；中国北京普析通用公司推出了带光学积分球的TU-1901紫外可见分光光度计；日本岛津推出了UV-3150 带积分球的紫外可见分光光度计；日本JASCO公司推出了带积分球的V550紫外可见分光光度计。美国PerkinElmer公司，50mm光学积分球的紫外可见分光光度计中国普析通用公司带光学积分球的TU-1901紫外可见分光光度计 岛津公司的UV-3150带积分球的紫外可见分光光度计、JASCO公司带积分球的V550紫外可见分光光度计　　目前，积分光度法正在材料科学、生命科学、航天技术等领域发挥着及其重要的作用。国际上许多科学家认为，积分光度法可以大大扩展紫外可见分光光度计的应用范围。科学家们正在进一步重视积分光度法。它是紫外可见分光光度计应用最新进展的重要内容之一。　　结束语　　1)紫外可见分光光度计虽说是一种成熟的、传统的、及普型的、基础型的、常规分析仪器，但是其发展空间仍然很大。目前我国对各类紫外可见分光光度计的需求量每年约9500台以上。作者预计，随着科学技术的发展，紫外可见分光光度计仪器和应用的发展速度只会加快，不会减慢；需求量会进一步增大。我们应该高度重视紫外可见分光光度计仪器及其应用的研发。　　2)紫外可见分光光度计目前的主要发展方向是：微型、微量、快速、专用；微型是便携式、现场检测的需要；微量是生命科学、医学、海洋科学等领域科研工作的需要(样品量很少、很贵)；快速是食品疾控、安全、应急现场检测的需要 专用是功能专一、但可靠性要求很高的在线自动检测的需要。　　3)目前，国际上的高端紫外可见分光光度计已经非常成熟，例如：PerkinElmer公司的Lambda950、Varian（现在的Agilent）公司的Cary6000i等就是。我国的紫外可见分光光度计近几年来已经有很大的突破，高端仪器也已经推出 例如：杂散光为4× 10-7的普析通用公司的T10等仪器就是。我国的紫外可见分光光度计仪器目前基本上能满足使用要求。但是，在工艺方面、附件方面、软件等方面与先进的发达国家相比，仍然存在差距。我们要看到差距，要努力赶超。特别在高端紫外可见分光光度计方面，我们目前还应该在立足国内的基础上，适当引进、消化、吸收国外的先进技术 我们既千万不能盲目乐观，又千万不能盲目排外。在紫外可见分光光度计仪器的研发方面，目前我国仍然应注意处理好普及和提高的关系：普及与提高还是应以普及为主，只能适当研发一些高端紫外可见分光光度计。因为最高端的紫外可见分光光度计，对绝大多数的常规分析测试的使用者没有意义，主要只能以此展示制造商的水平。　　4)可靠性是紫外可见分光光度计仪器发展的关键、核心和灵魂 评价紫外可见分光光度计仪器好坏的依据，主要是看可靠性、看分析测试数据准确与否。所以，我们在发展紫外可见分光光度计仪器时，要特别重视直接影响紫外可见分光光度计的可靠性、直接影响其分析测试误差的关键性能技术指标等关键问题。　　主要参考文献　　[1]李昌厚著，紫外可见分光光度计，北京：化学工业出版社，2005　　[2]李昌厚著，紫外可见分光光度计及其应用，北京：化学工业出版社，2010　　[3]李昌厚著，仪器学理论与实践，北京：科学出版社，2008　　[4]李昌厚著，高效液相色谱仪器及其应用，北京：科学出版社，2014　　[5] 文中涉及的有关仪器样本及其说明书　　(撰稿人：中国科学院上海生物工程研究中心 李昌厚教授)　　注:文中观点不代表本网立场,仅供读者参考　　盘点(1)：紫外可见分光光度计仪器技术新进展