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基因芯片技术对于疾病耐药性检测可从两个方面加以实现:1.在肿瘤中,通过检测肿瘤耐药基因的表达变化来分析对药物的抗性;2.在感染性疾病中,病原体的耐药性检测可通两种方式:表达谱芯片检测药物诱导的表达改变来分析其耐药性;寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。一、多药耐药基因的表达检测肿瘤治疗中对细胞毒素药物的抗性是引起治疗失败的重要原因,是限制化疗的重要因素。机制是复杂的,由肿瘤的综合特征决定,如存活细胞的比例、血液的供给是否充分、特殊的细胞机制及多药耐药表型,多药耐药是指当肿瘤细胞暴露在某一化学治疗药物后会产生对此药及其他结构上没有联系的药物的交叉抗性,可由不同的机制引起,如MDR1、MRP、LRP等基因的过度表达,拓扑异构酶II和谷胱甘肽代谢的改变等,另外,其他促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可能导致多药耐药。检测多药耐药基因表达的变化不但可以研究恶性肿瘤的不同耐药机制,还可以用于临床诊断,以指导制定治疗方案。目前已建立了几种多药耐药检测方法,在RNA水平上有:Northern blot、Slot blot、RT-PCR、Rnase protection assay和原位杂交,从蛋白水平上的检测方法有免疫组化、Western blot及流式细胞仪等。这些方法一次只能对一个基因进行研究,效率低,难以定量检测耐药基因表达增加的幅度。基因表达谱芯片可同时对成千上万的基因表达进行检测,可以大大加速这方面的研究,在设计芯片时,可以将已知肿瘤相关基因及标记基因都点到芯片上,同时,芯片上还包含目前所有报导过的耐药基因。这样可以同时得到肿瘤的各个方面的信息。另外基因芯片还可以帮助发现新的耐药基因。二、病原体耐药性检测细菌对三种以上不同类抗菌药物耐药者即可称为多重耐药菌(multi-drug resistant bacteria, MDR)。MDR感染在全球的状况十分严重,对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人的威胁巨大,1992年美国疾病控制中心(CDC)的资料表明,有13300例住院患者,是因为对所使用的抗菌药物耐药,细菌感染得不到控制而死亡。MDR感染已成为治疗上的难点和研究上的热点。MDR大多为条件致病菌,革兰阴性杆菌(GNR)占较大比例,如肠杆菌科中的肺炎杆菌、大肠杆菌、阴沟杆菌、粘质沙雷菌、枸橼酸菌属、志贺菌属、沙门菌属等,以及绿脓杆菌、不动杆菌属、流感杆菌等。革兰阳性菌中有甲氧西林耐药葡萄球菌(MRS),尤以MRSA和MRSE为多;万古霉素耐药肠球菌(VRE),近年来在重症监护室(ICU)中的发病率有明显增高;青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP),常引起肺炎、脑膜炎、菌血症和中耳炎,人结核分支菌等。此外尚有淋球菌、脑膜炎球菌、霍乱弧菌等。耐药性又称抗药性,一般是指病原体的药物反应性降低的一种状态。这是由于长期应用抗菌药,病原体通过产生使药物失活的酶、改变原有代谢过程,而产生的一种使药物效果降低的反应,因而作用的剂量要不断增加。细菌对抗菌药物的耐药机制可有多种,最重要者为灭活酶的产生,如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等;其次为靶位改变如青霉素结合蛋白(PBPs)的改变等;其他尚有胞膜通透性改变,影响药物的进入;细菌泵出系统增多、增强,以排出已进入细菌内的药物;以及胞膜主动转运减少、建立新代谢途径、增加拮抗药物等,两种以上的机制常可同时启动。耐药菌及MDR的发生和发展是抗菌药物广泛应用,特别是无指征滥用的后果。找到耐药菌的耐药基因,从而根据这些耐药基因设计新型抗生素,或将耐药菌分成不同的亚型,针对不同的亚型在临床上使用相应的抗生素,达到改善治疗效果的目的。国外采用基因芯片技术,检测耐药菌基因的改变,即检测耐药基因。如Michael Wilson就曾使用此方法检测到肺结核杆菌中脂肪酸合成酶II、fbpC、efpA、fadE23、fadE24和ahpC基因发生改变与耐药性有关。提供了新药物作用的靶目标,并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。在感染性疾病中,病原体的耐药性检测可通过两种方式:1.表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性;2.寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因,还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。对临床上用药和新药物的合成均具有指导作用。
在后基因体时代,基因芯片 (microarray) 的出现让研究人员得以宏观的视野来探讨分子机转。在许多努力和资源投入到寻找新的疾病基因后,许多单基因疾病已成功地找出致病基因。然而,在复杂疾病 (例如高血压、糖尿病及一些常见癌症) 的研究上,收获却不如期待中的丰富。大多数复杂疾病的研究中都可找出分布在不同染色体上的致病基因,但其与疾病仅有小至中等的连结 (linkage) 或关联性 (association),且只有极少数的致病基因能在大量人口资料中,仍对疾病的连结或关联性具有显着性。目前从复杂疾病研究找到的致病基因,大多数在跨研究的报告中皆不具重现性。 复杂疾病具异质性、多源性以肥胖为例,在2004年Dr. Perusse1的研究发现:与人类肥胖相关的113个候选基因 (candidate gene) 在50个全基因扫描研究中,仅有18个基因在五个以上的研究提出一致的正面相关报导。另外,2005年Dr. Agarwal2 的评论提到 (如图一所示),25个高血压基因在不同的连结或关联性研究中,有9个基因在连结性研究中负面相关的报导多于正面相关的报导。而25个基因中,多数在关联性研究中正面相关和负面相关的报导不相上下。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/12/A1354777030_small.jpg图1:2005年Dr. Agarwal 的评论中针对25个高血压基因在不同的连结或关联性研究中的统计报导 文献中将复杂疾病的致病基因在跨研究间缺乏重复性的现象,归纳出了几点解释。其中一个最广为接受的看法是这些多因子疾病的异质性 (heterogeneous)。另外,因在不同研究中,对各种表型 (phenotype,如血压、血糖) 定义上的不同和量测的不精确、对环境危险或保固因子 (如抽烟量,对污染物的摄取量) 的不同暴露程度以及不同人口之间基因背景的差异等因素,皆会遮蔽、加强或改变基因的作用并造成不同程度的疾病外显率 (penetrance)。 简而言之,由于复杂疾病患者病因的多源性,稀释了任何一个基因变异的效果。所以,当我们将许多病患集中在一起,试图比较他们的基因和正常人有何不同时可能会发现不同的致病基因,甚至亦会发现跟疾病无关而是与病患其他特性相关的基因。 生物路径丛 (Pathway Clster) 概念目前在复杂疾病的研究上,一般以使用类似的表型以减少样本间的异质性。然而,表型的同质化并不等于基因型的同质化。再者,一个疾病可能只是多种表型类似,但起源(基因)不同的病征组合。这个概念虽曾在文献中被提出过,但科学家所使用的简化表型方法并不尽理想。譬如在精神疾病领域,许多学者提出 ”endophenotype”,也就是「内在生物表型」这个概念。但他们所提出的操作方法,仅只是简单化(或减化)表型,譬如:以解剖学、影像学,或症兆定义上来减化,而没有着眼在减化「参与病征发展的生化路径」上。 这个问题的主要瓶颈在于科学家对于疾病发展的机制还不够了解。因此,中研院潘文涵教授3 提出以下建议:在现今大量产生的基因表现数据上,运用「数据探勘 (data mining)」的方法,进行群组分析 (cluster analysis);将这些资料分成若干个群组内相关,但群组间不相关的多个群组,每一个群组可能代表一两个少数源头基因、和一些他的下游基因的表现状态。所得群组同构型高且接近病原的潜在基因,因此可视为「生物路径丛」的指针。
基因检测行业的发展现状:国内外差距明显此前著名影星安吉丽娜?朱莉切除乳腺一事使得基因检测成为全球关注热点,而近年来随着测序技术发展逐渐成熟和成本的不断下降,利用高通量测序技术开展基因检测项目已逐渐成为一种主流方式。特别是今年国家卫计委发布《关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》和《关于开展高通量基因测序技术临床应用试点工作的通知》后,该技术在基因检测临床应用中已得到国家认可。 基因检测是通过血液、其他体液或细胞对DNA进行检测的技术。通过基因检测,人们能了解自己的基因信息,预知疾病发生的风险,从而通过有效的干预措施避免或延缓疾病的发生。 基因检测可以用于疾病的预测,也可以用于疾病的诊断。疾病诊断是用基因检测技术检测导致遗传性疾病的突变基因。 目前应用最广泛的基因检测是通过高通量测序技术开展新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和肿瘤疾病的辅助诊断。 国际基因检测行业规范现状 据统计,截至2015年12月3日,全球共有1068家临床机构和670家实验室提供的55125个基因检测项目,涉及4472种相关疾病。 国外基因检测服务开展较早,目前市场已经非常成熟,此外,国外基因检测行业已经相对规范,如美国病理学家协会(CAP)和美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)等都专门针对高通量基因测序的临床应用提出要求。 国内基因检测行业规范现状 同国外相比,国内基因检测的项目偏少,目前明确能在临床开展的基因检测项目只有不到200个,检测项目较多的主要集中在感染性疾病、肿瘤分子生物学检测以及遗传病诊断,也有些项目可应用于产前诊断、预防性诊断等。 早在2014年之前,我国还未对基因检测行业出台相应的准入标准和管理规范。2014年2月9日,国家食品药品监督管理总局与国家卫生和计划生育委员会叫停了基因检测的临床应用。2014年12月,国家卫计委先后发布了《关于开展高通量基因测序技术临床应用试点工作的通知》和《关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》,这意味着高通量基因测序技术在基因检测的临床应用获得国家的认可。 在国内,利用高通量测序技术开展较多的基因检测项目为无创产前筛查(NIPT),可开展的检测机构包含华大基因、达安基因、贝瑞和康、博奥生物、安诺优达等。