QIAcuity数字PCR如何实现拷贝数变异的精准检测
拷贝数变异 (Copy Number Variation, CNV) 是由基因组发生重排而导致的,一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少[1]。拷贝数变异是人类许多疾病(如肿瘤、遗传性疾病、神经系统和自身免疫疾病等)的重要致病因素之一,作为疾病的一项生物标志,染色体水平的基因序列重复、缺失等变化已成为许多疾病研究的热点[2]。相较于基因芯片、荧光定量PCR等传统的拷贝数变异检测方法,数字PCR通过对样品的离散化处理及分子计数的检测手段,摒弃了通过标准曲线和Ct值计算的间接定量方式,直接获取目标基因的绝对拷贝数,为CNV研究提供更高的检测精度和分辨率[3]。数字PCR技术已经发展了十几个年头,无论是传统的液滴式数字PCR或是芯片式数字PCR,均可实现靶标基因的绝对定量。在日趋成熟的众多数字PCR平台基础上,QIAGEN突破样本分区技术壁垒,推出了更独特的纳米微孔板式数字PCR系统—QIAcuity Digital PCR。更稳定的样本分区、多重检测通道的配置、更简单的操作流程、更快速的结果获取,结合更高效的Assay,助力基因组拷贝数变异的精准快速检测。更稳定的样本分区CNV研究需要极高的定量精度以区别不同拷贝数之间的微小差异。相关研究表明[4-5],对于肿瘤来源的非整倍数样品和微量血浆游离核酸的拷贝数变异检测时,需要精准定量到一倍以内的微小变化,以精准判断待测样本的拷贝数变异情况,准确定量这些微小差异是确定其生物学意义的关键。根据数字PCR技术原理,分区体积越均一稳定,目标分子的分布规律越符合泊松公式,越易精准区分拷贝数间的微小差异。此外,当有效分区数接近8000时,可以精准分辨拷贝数10和拷贝数11,并且微反应单元体积越均一稳定、数量相对越多,定量的整体精度就越高。QIAcuity数字PCR采用固相分割的纳米微孔板来实现样本反应液的分区,确保每个微反应单元大小均一、稳定。使用26000分区纳米微孔板的有效分区数均在25400以上,可以更精准区分差值小于10%的非整倍数间微小拷贝数变化,进而准确分析其生物学意义。五重检测通道配置基因组拷贝数变异的精准检测,需依赖参照基因的准确标注以及内部质控,其中参照基因的选择是检测拷贝数变异的关键环节。对于非整倍数的样品检测,需要使用多个参照基因来判断检测结果的稳定性和精准性。此外,拷贝数变异的精准检测还依赖于内部质控,所以多个检测通道的配置是必要条件,以确保在同一实验中,目标基因拷贝数变异获得精准鉴别。QIAcuity数字PCR配置有5个检测通道,可在单管实验中同时实现目标基因、参照基因和内部质控的定量分析,以精准鉴别目标基因相较于参照基因的微小变化差异。此外,该系统还内置有1个参比通道,可精准识别最终被用于计算的样本分区数均为有效分区数,避免由于无效分区的引入而造成检测结果的偏差,对于微小拷贝数变化的精准鉴别尤为适用。左图为实际检测到的阳性反应孔信号 右图为参比荧光通道检测到的有效分区数更简单的操作流程在基因组拷贝数变异检测实验中,相较于传统荧光定量PCR,数字PCR无需标准曲线即可实现绝对定量,简化了构建标准曲线的繁琐步骤,同时规避了由于标准曲线精准度不足而导致的结果偏差。QIAcuity数字PCR系统采用集成式一体化设计,真正意义上实现了“从样本进到结果出”的全自动化检测流程,操作流程的简化,可最大程度降低由于人工操作而引入的实验误差;在规避外界因素影响的同时,整个实验流程可在2小时内完成,确保拷贝数变异实验结果的快速获取,加速实验进程。 QIAcuity数字PCR工作流程更高效的CNV Assay可重复展现稳定结果的数字PCR系统和优化设计的PCR引物探针缺一不可。然而在设计拷贝数变异的引物探针时,需考虑SNP和引物探针特异性等影响因素,一定程度上增加了实验设计的难度。为简化实验设计,QIAGEN基于QIAcuity数字PCR平台开发了200组经锁核酸技术修饰和湿实验验证的CNV检测Assay。通过锁核酸修饰的引物增强了对互补序列的亲和力和特异性,更易鉴别微小拷贝数变化差异。参照基因也不可或缺,除常用RPP30外,QIAGEN还开发了AP3B1、TERT、R6和R10参照基因,对于不同样本和不同的拷贝数变异类型可针对性的选择,以确保其适用性。对于高拷贝数 (≥6) 的变异检测,R6和R10参照基因可以提升检测结果的归一化程度,进而提高检测精准度。参照基因适用性检测R6和R10提升多拷贝变异检测准确性高灵敏度QIAcuity数字PCR系统搭配dPCRCopy Number Assay以TERT为参照对HER2、MYC、EGFR、MET四种基因的拷贝数变化进行了检测。数据显示:WT和SK-BR3(1:1) 混合样本中,TERT拷贝数接近等量,可作为参照基因进行量化;实验中HER2发生了3.35倍的变化;EGFR发生了1.75倍的变化;MYC发生了5.85倍的变化;MET发生了3.4倍的变化。数据表明QIAcuity数字PCR可实现10%内的微小变化的精准检测。SK-BR3细胞系中的4种癌基因拷贝数检测高精准度通过对MCF-7细胞系进行不同程度的梯度稀释,QIAcuity数字PCR系统检测到目标基因和参照基因结果都呈现出对应的线性关系,并且与预期值一致性良好。对于基因组变异的检测,QIAcuity数字PCR表现出精准的分辨率。&ensp MCF-7细胞系的不同浓度中MYC和NRAS拷贝数检测参考文献:[1] Redon, R., et al., Global variation in copy number in the human genome. Nature, 2006. 444(7118): p. 444-54.[2] International Schizophrenia, C., Rare chromosomal deletions and duplications increase risk of schizophrenia. Nature, 2008. 455(7210): p. 237-41.[3] Alexander Brik, Daniel G. Weber, Swaantje Casjens, Peter Rozynek, Swetlana Meier, Thomas Behrens, Georgios Stamatis, Kaid Darwiche, Dirk Theegarten, Thomas Brüning, Georg Johnen, Hubertus Himmerich. Digital PCR for the Analysis of MYC Copy Number Variation in Lung Cancer[J]. Disease Markers,2020,2020.[4] Nivedita Majumdar, Thomas Wessel, Jeffrey Marks. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.[J]. PLoS ONE,2017,10(3).[5] Suzanne Weaver, Simant Dube, Alain Mir, Jian Qin, Gang Sun, Ramesh Ramakrishnan, Robert C. Jones, Kenneth J. Livak. Taking qPCR to a higher level: Analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution[J]. Methods,2010,50(4).