测序仪信号原理

一. 测序仪对比测序技术代表仪器读长通量准确度成本Sanger法ABI 3730xl DNA Analyzer500-800bp0.096Gbp/天99.99%0.24美分/bpIlluminaHiSeq X Ten System150bp1800Gbp/运行99.9%0.01美分/bp华大智造MGISEQ-2000200bp（单端）或2×150bp（双端） 60Gbp/运行 99.9% 0.015美元/bpRoche 454GS FLX+ System700bp0.7Gbp/运行99.9%0.02美元/bpABI SOLiDSOLiD System 5500xl75bp120Gbp/运行99.94%0.13美分/bpPacBioSequel II System10kb60Gbp/运行99%0.15美元/bpNanoporeMinION Device100kb30Gbp/运行90%0.02美元/bpHelicosHeliScope Single Molecule Sequencer25-50bp28Gbp/运行80%未知　　1. ABI 3730xl DNA Analyzer图源自thermofisher官网　　1.1. 相关原理　　 DNA测序：基于Sanger法的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。　　 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。　　1.2. 主要组成　　ABI 3730xl DNA Analyzer仪器是一种高通量的DNA测序和片段分析的平台，它可以同时使用48或96根毛细管进行电泳分离和荧光检测。　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software、SeqScape Software、GeneMapper Software等。　　 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管阵列，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。　　 DNA测序试剂和耗材：包括BigDye Terminator循环测序试剂盒、GeneScan分子量标准品、片段分析标准品、POP-7聚合物分离胶等。　　1.3. 主机模块　　 电泳系统：负责将DNA片段在毛细管中进行电泳分离，根据不同长度的DNA片段在电场中的迁移速度不同，将它们按照从小到大的顺序排列。电泳系统由高压电源、电泳缓冲液、毛细管阵列等组成。　　o 高压电源：提供高达30kV的电压，使DNA片段在电场中迁移。　　o 电泳缓冲液：提供电导性和pH稳定性，使DNA片段在毛细管中顺利运行。　　o 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。　　 自动进样系统：负责将样品从96孔或384孔板中自动吸取，并注入到毛细管阵列中。自动进样系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。　　o 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到毛细管中。　　o 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。　　o 进样阀：用于控制进样针与毛细管之间的连接和断开，以及进样时间的长短。　　 激光系统：负责将激光光束照射到毛细管阵列的出口处，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。　　o 激光器：提供单波长、505nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。　　o 光纤：用于将激光光束从激光器传输到毛细管阵列上。　　o 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。　　 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。　　o 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。　　o 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。　　o CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。　　 温控系统：负责控制仪器的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。　　o 温度传感器：用于监测仪器内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。　　o 风扇：用于散热和通风，维持仪器的适宜温度。　　o 加热器：用于加热和保温，防止仪器的过冷。　　 聚合物输送系统：负责将聚合物分离胶从储存瓶输送到毛细管阵列中，作为电泳介质。聚合物输送系统由压力罐、气压调节器、流量计等组成。　　o 压力罐：用于储存聚合物分离胶，并提供一定的压力，使聚合物分离胶能够流动。　　o 气压调节器：用于控制压力罐的气压，以及聚合物分离胶的流速。　　o 流量计：用于测量聚合物分离胶的流量，以及毛细管中的胶量。　　2. HiSeq X Ten System图源自Illumina官网　　HiSeq X Ten System是Illumina公司的产品。Illumina是一家生物技术公司，它的测序仪是基于桥式PCR和荧光检测的技术，也是目前最流行的二代测序平台之一。它的测序仪有多个系列，如NovaSeq、HiSeq、MiSeq、MiniSeq等，它们的核心技术原理是相同的，但在通量、读长、准确度、成本等方面有所不同。　　2.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与流通池表面探针互补的序列(P5/P7)、用于区分不同文库的索引(Index)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 聚集体生成：将文库DNA片段注入到流通池中，并与表面探针杂交结合。然后进行桥式PCR扩增，使每个DNA片段形成一个聚集体。聚集体生成后需要进行温度变化和化学处理，使其单链化并去除P5端的DNA链，只留下P7端的DNA单链。　　 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到流通池中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后根据索引将不同文库的数据分离，并进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　2.2. 主要组成　　 流通池(Flow cell)：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数亿个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过杂交结合。流通池内部有多个通道，每个通道可以进行不同的测序反应。　　 聚集体(Cluster)：是指通过桥式PCR在流通池表面扩增形成的由相同DNA片段组成的簇，每个聚集体可以发出荧光信号，从而被检测为一个读长(Read)。聚集体的密度和质量会影响测序的效率和准确度。　　 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 计算机系统(Computer system)：是指用于控制测序仪运行和处理数据的设备，它预装了用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如BaseSpace Sequence Hub、Sequencing Analysis Software等。　　3. MGISEQ-2000图源自华大智造官网　　MGISEQ-2000测序仪是一种基于荧光检测的第二代测序技术，可以实现高通量、高精度、低成本的基因组测序。　　3.1. 相关原理　　o DNA测序：基于双端测序的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。　　o 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。　　3.2. 主要组成　　o 测序仪主机：包含流体控制系统、温控系统、激光系统、光学系统、信号采集系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　§ 流体控制系统：负责控制样品和试剂的输送，以及测序反应的进行。流体控制系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。　　§ 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到芯片上。　　§ 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。　　§ 进样阀：用于控制进样针与芯片之间的连接和断开，以及进样时间的长短。　　§ 温控系统：负责控制仪器和芯片的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。　　§ 温度传感器：用于监测仪器和芯片内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。　　§ 风扇：用于散热和通风，维持仪器和芯片的适宜温度。　　§ 加热器：用于加热和保温，防止仪器和芯片的过冷。　　§ 激光系统：负责将激光光束照射到芯片上，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。　　§ 激光器：提供单波长、532nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。　　§ 光纤：用于将激光光束从激光器传输到芯片上。　　§ 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。　　§ 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。　　§ 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。　　§ 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。　　§ CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。　　§ 信号采集系统：负责对数字化的电信号进行滤波、校准、分段、碱基识别等处理，最终生成测序结果。信号采集系统由数据采集卡、数据处理软件等组成。　　§ 数据采集卡：用于将CCD相机传输的电信号接收并转换为数字信号，以及进行一定的滤波和校准处理。　　§ 数据处理软件：用于对数字信号进行进一步的分段、碱基识别、质量评估等处理，以及生成测序结果文件。　　o 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件。　　o 芯片：芯片是MGISEQ-2000测序仪的核心部件，它是一种微流控芯片，上面有数百万个微孔，每个微孔都可以进行单分子簇测序，实现高通量的数据产出。芯片有不同的规格和类型，如单端测序芯片、双端测序芯片、片段分析芯片等，可以根据不同的需求选择合适的芯片。　　4. GS FLX+ System图源自罗氏官网　　GS FLX+ System测序仪是一种基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。　　4.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(A/B)、以及用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。　　 PTP装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。　　 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(SFF文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTA/FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　4.2. 主要组成　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。　　 PicoTiterPlate(PTP)：是一个微型的塑料板，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。　　 DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。　　 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　4.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。　　 激光系统：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 温控系统：是指用于控制PTP板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。　　 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到PTP板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。　　5. SOLiD System 5500xl图源自thermofisher官网　　SOLiD System 5500xl测序仪是一种基于连接法测序(Sequencing by Ligation)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和中等读长的DNA测序服务。　　5.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(P1/P2)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。　　 FlowChip装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。　　 边连接边测序：将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子，使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　5.2. 主要组成　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。　　 FlowChip：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。　　 DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。　　 荧光探针(Fluorescent probe)：是指用于标记不同碱基对的四种荧光分子，它们分别对应A/T、T/A、C/G、G/C四种碱基对，并发出不同颜色的光。荧光探针还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基对。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　5.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。　　 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。　　 激光系统：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 温控系统：是指用于控制FlowChip板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。　　 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到FlowChip板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。　　6. Sequel II System图源自PACB官网　　Sequel II System测序仪是一种基于单分子实时测序(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)技术的三代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。　　6.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 SMRT Cell装载：将文库DNA片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶。然后进行温度变化和化学处理，使文库DNA片段与测序引物结合，并形成环状结构。　　 边合成边测序：将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除环状DNA链上的碱基，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BAM文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　6.2. 主要组成　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。　　 SMRT Cell 8M：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA聚合酶(DNA Polymerase)，并进行单分子测序反应。　　 荧光核苷酸(Fluorescent nucleotide)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光核苷酸在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　6.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　 自动进样系统：是指用于将文库DNA片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶的系统。然后进行温度变化和化学处理，使文库DNA片段与测序引物结合，并形成环状结构。　　 激光系统：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 温控系统：是指用于控制SMRT Cell板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。　　 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到SMRT Cell板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。　　7. MinION Device图源自Oxford官网　　MinION Device测序仪是一种基于单分子实时测序(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)技术的三代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA和RNA测序服务。　　7.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA或RNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 SMRT Cell装载：将文库片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶。然后进行温度变化和化学处理，使文库片段与测序引物结合，并形成环状结构。　　 边合成边测序：将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除环状DNA链上的碱基，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(FAST5文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　7.2. 主要组成　　 测序仪主机：是一个小巧的USB设备，它可以连接到任何电脑或笔记本，并通过软件进行控制和数据传输。　　 SMRT Cell：是一个微型的塑料芯片，它的表面覆盖了数千个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA聚合酶(DNA Polymerase)，并进行单分子测序反应。　　 荧光核苷酸(Fluorescent nucleotide)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光核苷酸在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。　　7.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　 自动进样系统：是指用于将文库片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶的系统。然后进行温度变化和化学处理，使文库片段与测序引物结合，并形成环状结构。　　 激光系统：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。　　8. HeliScope Single Molecule Sequencer　　HeliScope Single Molecule Sequencer测序仪是一种基于荧光测序原理的单分子测序平台，它可以直接对DNA进行测序，无需进行PCR扩增或文库构建。　　8.1. 相关原理　　 文库准备：将待测DNA打断成小片段，并在每个小片段(约200bp)的末端加上poly-A尾。　　 芯片装载：将文库DNA片段与固定在芯片上的poly-T引物进行杂交，并精确定位，使每个微孔中只有一个DNA模板。　　 边合成边测序：将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到芯片中，并利用DNA聚合酶将它们连接到DNA链上。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子，使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。图源自portorford.info|　　8.2. 主要组成　　 测序仪主机：是一个大型的设备，它可以连接到电脑或服务器，并通过软件进行控制和数据传输。　　 测序芯片：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数亿个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA模板，并进行单分子测序反应。　　 荧光探针：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光探针在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。　　 激光器：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。　　二. 测序原理和发展　　 测序技术的概念和原理：介绍什么是测序技术，它是如何工作的，以及它的主要分类和特点 。　　 测序技术的发展历史：回顾测序技术的发展过程，从第一代测序技术(如Sanger法)到第二代测序技术(如Illumina法)再到第三代测序技术(如Nanopore法) 。　　 测序技术的应用领域：介绍测序技术在生命科学中的各种应用，如基因组学、转录组学、表观遗传学、微生物组学、个体化医疗等 。　　 测序技术的挑战和未来：分析测序技术面临的主要挑战，如数据量、数据质量、数据分析、数据存储、数据共享等 ，以及展望测序技术的未来发展方向和趋势 。　　1. 基本概念　　 读长(read length)：读长是指测序得到的DNA片段的长度，一般来说，读长越长，越有利于拼接基因组和发现结构变异。在这方面，三代测序技术(如Nanopore和PacBio)具有明显的优势，它们可以测定长达数十kb甚至Mb级别的读长，而二代测序技术(如Illumina和Roche 454)的读长一般在数百bp到数千bp之间，Helicos的读长则最短，只有25-50bp。　　 准确度(accuracy)：准确度是指测序结果与真实DNA序列的一致性，一般用错误率来衡量。　　 通量(throughput)：通量是指测序平台每次运行可以产生的数据量，一般用Gbp或Tbp来表示。　　 成本(cost)：成本是指进行测序所需的费用，包括仪器、试剂、人工、时间等因素。　　2. 技术的选择　　“如何选择合适的测序技术”这是一个很重要的问题，因为不同的测序技术有不同的特点和适用范围。一般来说，选择测序技术需要考虑以下几个因素：　　 测序目的：你想要测定什么样的DNA或RNA?是基因组、转录组、表观遗传组、微生物组还是其他?你想要了解什么样的信息?是序列变异、基因表达、基因调控、基因功能还是其他?　　 测序需求：你需要多少数据量来达到你的测序目的?你需要多高的准确度和重复性来保证你的测序质量?你需要多长的读长来覆盖你的目标区域?　　 测序资源：你有多少样品可以进行测序?你的样品质量和数量如何?你有多少时间和预算可以用于测序?　　根据这些因素，你可以对比不同的测序技术的优缺点，选择最适合你的测序方案。　　 如果你想要测定全基因组或全转录组，并且对数据量和成本有较高的要求，那么你可以选择Illumina或Roche 454等二代测序技术，它们可以提供高通量和低成本的测序服务。　　 如果你想要测定特定的基因或区域，并且对准确度和重复性有较高的要求，那么你可以选择Sanger法等一代测序技术，它们可以提供高准确度和高重复性的测序服务。　　 如果你想要测定长片段或结构变异，并且对读长和拼接有较高的要求，那么你可以选择Nanopore或PacBio等三代测序技术，它们可以提供超长读长和单分子测序的服务。　　3. 概念和原理　　测序技术是指获得目的核酸分子(DNA或RNA)碱基排列顺序的技术，它是生命科学研究的基础和核心。测序技术的原理是利用不同的方法对目的核酸分子进行合成、标记、检测和识别，从而确定其碱基序列。　　测序技术可以根据其使用的方法和原理分为不同的代数和类型，主要有以下几种：　　 第一代测序技术：是指最早出现的基于荧光测序原理的测序技术，如Sanger法和Maxam-Gilbert法，它们通过使用特殊的链终止核苷酸或化学降解剂来中断DNA合成反应，并通过凝胶电泳和放射自显影来检测荧光信号，从而确定碱基序列。Sanger法是基于DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入终止链延伸的双脱氧核苷酸(ddNTPs)的原理。这些ddNTPs可以用放射性或荧光标记来检测，从而得到DNA的碱基序列。Sanger法由英国生物化学家弗雷德里克桑格于1977年发明，是第一代DNA测序技术，曾被广泛用于人类基因组计划等大规模的基因组分析。　　 第二代测序技术：是指基于高通量测序原理的测序技术，如Illumina法、Roche 454法、ABI SOLiD法等，它们通过使用特殊的接头、引物、荧光探针等来对目的核酸分子进行扩增、标记和检测，并通过芯片或微珠等平台来实现大规模并行测序，从而大大提高了测序速度和通量。　　o Roche 454技术：这是一种基于焦磷酸测序法的技术，它利用喷雾法将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段结合在微珠上，并在乳液PCR中进行扩增。最后将这些微珠放入一个含有许多小孔的反应板中，每个小孔只容纳一个微珠。在测序过程中，每次加入一种dNTP，并检测每个小孔中是否发生了焦磷酸释放反应，从而确定碱基序列。　　o Illumina/Solexa技术：这是一种基于桥式PCR和荧光检测的技术，它也是目前最流行的测序技术之一。它将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段吸附在流动槽(flowcell)的表面，并进行桥式PCR扩增，形成聚集体(cluster)。在测序过程中，每次加入四种带有不同荧光标记的dNTP，并利用激光和相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　o ABI SOLiD技术：这是一种基于连接酶和荧光检测的技术，它与Illumina技术类似，也是将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段结合在微珠上，并在乳液PCR中进行扩增。最后将这些微珠固定在玻璃滑片上，形成聚集体。在测序过程中，每次加入四种带有不同荧光标记的二聚体(如AA,AC,AG,AT等)，并利用连接酶将它们连接到模板链上。然后利用激光和相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　 第三代测序技术：是指基于单分子实时测序原理的测序技术，可以直接测定单分子的DNA或RNA的测序方法，不需要进行PCR扩增，从而减少错误和偏差，并且可以获得更长的读长(read length)。如Nanopore法、PacBio法、Helicos法等，它们通过使用特殊的微孔、DNA聚合酶、荧光探针等来对单个核酸分子进行直接测序，无需进行扩增或文库构建，并通过电信号或光信号来检测碱基加入的过程，从而获得超长读长和高准确度的碱基序列。　　o PacBio公司的单分子实时测序技术(SMRT)，它是基于DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记的dNTPs的原理。这些dNTPs可以用激光和相机检测，从而得到DNA的碱基序列。PacBio的优点是可以测定长达数十kb的读长，以及检测一些碱基修饰情况，如甲基化等。PacBio的缺点是测序错误率较高(约10-15%)，主要为随机的插入和缺失错误，但可以通过多次测序和自身校正来提高准确度。　　o Oxford Nanopore公司的单分子纳米孔测序技术(Nanopore)，它是基于电信号检测原理，当DNA分子穿过纳米孔时会产生电流信号，一般以5个碱基为一组检测电流信号，对电流信号进行解码。Nanopore的优点是可以测定超长的读长，最长可达Mb级别，以及便携性和实时性。Nanopore的缺点是测序错误率也较高(约10-15%)，主要为同聚物和串联重复区域的错误，以及反向重复序列对测序质量的影响。　　o Helicos公司的真正单分子测序技术(tSMS)，它是基于荧光检测原理，将DNA打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物。然后逐一加入带有荧光标记和终止子的dNTPs，并利用显微镜记录每个小片段发出的荧光信号，从而确定碱基序列。Helicos的优点是可以避免PCR扩增带来的偏差，以及对样品量和纯度要求低。Helicos的缺点是测序错误率最高(约20-30%)，主要为缺失错误，以及同聚物对测序质量的影响。　　4. 发展历史　　测序技术的发展历史可以追溯到1975年，当时Frederick Sanger提出了链终止法，并用它成功地测定了噬菌体φX174的基因组序列(5375个碱基)，这是人类历史上第一个完整的基因组图谱。　　1977年，Walter Gilbert提出了链降解法，并用它成功地测定了噬菌体MS2的基因组序列(3569个碱基)。　　1980年，Sanger和Gilbert因为在测序技术方面的贡献而共同获得了诺贝尔化学奖。　　1986年，Leroy Hood等人发明了第一台自动化荧光测序仪，并用它成功地完成了人类线粒体DNA(16569个碱基)的全长测序。　　1990年，人类基因组计划正式启动，目标是在15年内完成人类全基因组(约30亿个碱基)的测定。　　1995年，Craig Venter等人利用全基因组随机打断法(Whole Genome Shotgun Method)首次完成了一种自由生活细菌——溶血性链球菌的全基因组测序(180万个碱基)。　　1996年，Roche公司收购了454 Life Sciences公司，并开始开发基于焦磷酸测序法(Pyrosequencing)的高通量测序技术。　　1998年，ABI公司推出了第一台基于荧光原位合成法(Fluorescence In Situ Sequencing，FISSEQ)的高通量测序仪——ABI 3700 Genetic Analyzer。　　2001年，人类基因组计划和Celera Genomics公司分别公布了人类基因组的初步草图，标志着人类基因组计划的完成。　　2005年，Solexa公司推出了第一台基于桥式扩增法(Bridge Amplification)和可逆终止法(Reversible Terminator)的高通量测序仪——Solexa 1G Genome Analyzer。　　2006年，Illumina公司收购了Solexa公司，并开始开发基于桥式扩增法和可逆终止法的高通量测序技术。　　2007年，Roche 454公司推出了第一台基于乳胶珠扩增法(Emulsion PCR)和焦磷酸测序法的高通量测序仪——Roche 454 GS FLX。　　2008年，ABI公司推出了第一台基于乳胶珠扩增法和荧光连接法(Ligation Sequencing)的高通量测序仪——ABI SOLiD System。　　2009年，Helicos Biosciences公司推出了第一台基于单分子荧光测序法(Single Molecule Fluorescent Sequencing)的单分子测序仪——HeliScope Single Molecule Sequencer。　　2010年，Pacific Biosciences公司推出了第一台基于单分子实时测序法(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)的单分子测序仪——PacBio RS。　　2011年，Ion Torrent公司推出了第一台基于半导体测序法(Semiconductor Sequencing)的高通量测序仪——Ion Torrent PGM。　　2012年，Oxford Nanopore Technologies公司推出了第一台基于纳米孔测序法(Nanopore Sequencing)的单分子测序仪——MinION Device。　　2015年，BGI公司推出了第一台基于芯片化荧光测序法(Chip-based Fluorescent Sequencing)的高通量测序仪——BGISeq-500。　　2017年，10x Genomics公司推出了第一台基于连线染色体构象捕获技术(Linked-Reads Technology)的高通量测序仪——Chromium Genome System。　　至此，从第一代到第三代的各种测序技术已经形成了一个多样化、竞争性和互补性的生态系统，为生命科学研究提供了丰富而强大的工具。　　2018年到2023年最近5年测序技术的发展：　　 测序技术的创新和优化：在这段时间内，各种测序技术都在不断地进行创新和优化，以提高测序的速度、准确度、通量、成本效益等方面的性能。例如，Illumina公司推出了NovaSeq系列测序仪，可以实现每天测序6000个人类基因组 PacBio公司推出了Sequel II和Sequel IIe测序仪，可以实现每次测序8Tb的数据和平均读长20kb Oxford Nanopore公司推出了PromethION和GridION测序仪，可以实现每次测序100Tb的数据和平均读长30kb Ion Torrent公司推出了Genexus集成化测序系统，可以实现24小时内完成从样本到报告的全流程 10x Genomics公司推出了Chromium X系列测序仪，可以实现每次测序1.2Tb的数据和平均读长150kb BGI公司推出了DNBSEQ-T7和DNBSEQ-G400测序仪，可以实现每次测序6Tb和400Gb的数据和平均读长100bp。　　 测序技术的多样化和互补性：在这段时间内，各种测序技术都在不断地扩展其应用范围和领域，以满足不同的研究需求和目标。例如，Illumina公司推出了TruSeq Nano DNA Library Prep Kit，可以实现从低至100ng的DNA样本进行全基因组测序 PacBio公司推出了HiFi Reads技术，可以实现单分子测序的高准确度(99%) Oxford Nanopore公司推出了LamPORE技术，可以实现从RNA直接进行SARS-CoV-2病毒检测 Ion Torrent公司推出了Oncomine Precision Assay，可以实现从肿瘤组织或血液样本进行癌症基因检测 10x Genomics公司推出了Visium Spatial Gene Expression Solution，可以实现从组织切片进行空间转录组测序 华大智造推出DNBelab C系列高通量文库制备试剂盒，自动化文库制备系统，节省人力物力，提高通量，减少操作失误。　　 测序技术的应用和赋能：在这段时间内，各种测序技术都在不断地应用于各个领域和行业，以促进科学发现和社会进步。例如，在基因组学领域，完成了人类基因组计划第二阶段(HGP-write)的启动、人类细胞图谱计划(Human Cell Atlas)的进展、人类变异图谱计划(Human Variome Project)的更新等重大项目 在转录组学领域，完成了人类脑转录组计划(BRAIN Initiative)的初步结果、人类免疫细胞转录组计划(Human Immunome Project)的部分结果、人类肠道菌群转录组计划(Human Gut Microbiome Project)的部分结果等重要研究 在表观遗传学领域，完成了人类表观组计划(Human Epigenome Project)的部分结果、人类表观组图谱计划(Human Epigenome Atlas)的部分结果、人类表观组变异计划(Human Epigenome Variation Project)的部分结果等关键研究 在微生物组学领域，完成了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project)的部分结果、人类口腔微生物组计划(Human Oral Microbiome Project)的部分结果、人类皮肤微生物组计划(Human Skin Microbiome Project)的部分结果等重要研究 在个体化医疗领域，完成了百万人基因组计划(Million Genomes Project)的部分结果、百万人精准医疗计划(Million Precision Medicine Project)的部分结果、百万人癌症基因组计划(Million Cancer Genomes Project)的部分结果等重大项目。　　5. 应用领域　　o 基因组学：是指研究生物体所有遗传信息及其功能、结构、表达、变异、进化等方面的学科，它依赖于测序技术来获取基因组序列和注释，以及进行基因组比较、基因组变异、基因组编辑等研究。　　o 转录组学：是指研究生物体在特定条件下所有转录本的类型、数量、结构、功能和相互作用的学科，它依赖于测序技术来获取转录本序列和表达量，以及进行转录本组装、差异表达分析、可变剪接分析、非编码RNA分析等研究。　　o 表观遗传学：是指研究生物体在不改变DNA序列的情况下，通过化学修饰或染色质重塑等方式调控基因表达的学科，它依赖于测序技术来获取DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性等信息，以及进行表观遗传标记分布、表观遗传变异、表观遗传调控等研究。　　o 微生物组学：是指研究特定环境或宿主中所有微生物的种类、数量、功能和相互作用的学科，它依赖于测序技术来获取微生物的16S rRNA或全基因组序列，以及进行微生物分类鉴定、微生物群落结构、微生物功能分析等研究。　　o 个体化医疗：是指根据个人的基因组、转录组、蛋白质组等信息，为其提供最适合的预防、诊断和治疗方案的医疗模式，它依赖于测序技术来获取个人的遗传变异和表达谱，以及进行个人风险评估、个人药物反应预测、个人靶向治疗选择等应用。　　6. 挑战和未来　　测序技术虽然已经取得了巨大的进步和成就，但仍然面临着一些挑战和问题，主要包括：　　 数据量：随着测序技术的发展，测序数据的产生速度远远超过了数据存储和处理的能力，导致数据管理和分析成为一个瓶颈。　　 数据质量：不同的测序技术有着不同的数据质量特征，如读长、准确度、偏好性等，这些特征会影响数据分析的结果和可靠性。　　 数据分析：测序数据的分析涉及到多种复杂的算法和工具，如比对、组装、注释、变异检测等，这些算法和工具需要不断地优化和更新，以适应不同的数据类型和需求。　　 数据存储：测序数据的存储需要占用大量的硬件资源和空间，同时也需要考虑数据的安全性和可访问性。　　 数据共享：测序数据的共享需要解决数据的标准化、元数据、伦理、法律等方面的问题，同时也需要建立有效的数据交换和利用的机制和平台。　　测序技术的未来发展方向和趋势主要包括：　　 数据集成：通过将不同来源、不同层次、不同类型的测序数据进行整合和融合，以提高数据的信息量和价值。　　 数据挖掘：通过运用机器学习、人工智能等先进的技术和方法，对测序数据进行深入的分析和挖掘，以发现数据中隐藏的规律和知识。　　 数据应用：通过将测序数据与其他领域的数据进行关联和对比，以拓展测序数据的应用范围和意义。　　 数据创新：通过开发新的测序技术和平台，以提高测序数据的质量和效率，以及实现新的测序功能和目标。

盘点一下市场常见国产测序仪研发公司，这个赛道的公司主要集中在深圳和成都，北京和上海分别有一家企业。企业地区产品今是科技成都Gseq500万众一芯成都ATGC-MICRO NGS基因测序仪齐碳科技成都QNome-9604、QNome-3841、QNome-3841hex瀚辰光翼成都高通量基因分型系统华大智造深圳DNBSEQ-T20×2、DNBSEQ-T10×4、DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000、MGISEQ-200、DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25真迈深圳SURFSeq 5000系列、FASTASeq 300系列、GenoLab M系列、GenoCare 1600系列赛陆医疗深圳Salus Pro芯像生物上海Starseq 100赛纳生物北京S100铭毅智造深圳UniSeq2000测序仪安序源生物深圳AXP100-RS纳米孔基因测序仪　　测序仪是生物科技领域的重要工具，它可以读取生命的密码——DNA，为疾病诊断、药物研发、基因编辑等提供数据支持。目前，测序仪的技术发展主要经历了三代，分别是基于化学合成的第一代(Sanger法)、基于荧光信号的第二代(高通量测序)和基于电信号的第三代(单分子测序)。随着测序需求的增加和成本的降低，第四代测序技术——纳米孔测序正在崭露头角，它可以实现快速、廉价、准确和长读长的测序。　　在这一领域，成都作为中国西部的科技中心，拥有多家创新型企业，正努力扛起测序仪的大旗。其中，齐碳科技、今是科技、万众一芯和瀚辰光翼是四家代表性的企业，它们分别从不同的角度和方向，开发出具有自主知识产权和国际竞争力的测序仪产品。图源自齐碳科技官网　　齐碳科技是中国第一家成功研发出纳米孔基因测序仪原理样机、工程样机、产品样机并推出产品的企业。它的产品——齐碳纳米孔基因测序仪QNome-9604，填补了我国新一代基因测序技术领域的空白。该产品已经在多个领域得到应用，如微生物、人类、动植物研究，肿瘤早期筛查、罕见病诊断等临床研究。图源自今是科技官网　　今是科技是一家专注于纳米孔测序技术的企业，其愿景是“让基因测序成为精准医疗的常规手段，提升人类健康水平”。它开发并商用了第四代(纳米孔)基因测序仪和试剂——Gseq500是一款中通量基因测序仪。该测序仪配合专用芯片MK，可实现DNA和RNA测序。可在10小时内输出高达15Gb的优质长读长测序数据，可实时识别碱基，灵活测序，无需累积样本，它能满足靶向重测序、小型基因组测序、甲基化测序等重点运用。其技术核心是基于蛋白纳米孔和核酸碱基相互作用所产生的特征电流信号，通过高度集成的芯片系统在单分子水平实现对核酸的高通量测序。以诺奖工作参与者、世界顶级的纳米孔测序专家为核心，今是科技组建了包括生化、集成电路、材料、MEMS、有机合成、算法等方向中美两地资深专家在内的研发团队，已基本覆盖了第四代基因测序仪研发所需要的专业领域。图源自万众一芯官网　　万众一芯是一家专注于半导体生化检测领域的企业，其目标是成为半导体生化检测领域的独角兽。它开发了一种基于半导体芯片的新型基因测序仪——ATGC-MICRO NGS基因测序仪。该产品搭载自主研发的高灵敏度 ISFET 测序芯片(包括26万门或400万门2种传感器)，采用无磁珠测序法，仪器自动完成测序模板富集和测序，利用电信号代替传统光学信号，实现高速电子测序，获得高质量的Fsatq 格式数据，官网称是业内最快、最小的基因测序仪。图源自瀚辰光翼官网　　瀚辰光翼是一家专注于高通量基因分型系统的企业，其愿景是成为全球生命科技客户最信赖的伙伴。它开发了一种基于荧光信号的高通量基因分型系统——瀚辰光翼高通量基因分型系统GeneMatrix。该产品单次实验最大通量可达7680个数据点，实现大规模的基因分型和遗传分析。该产品具有高效率、高准确度、高稳定性、高可重复性等特点，应用于子辅助育种、前景标记筛查、种质资源基因型鉴定、品系鉴定、健康风险、营养代谢、遗传特征等领域。　　综上，成都作为中国西部的科技中心，现已孵化出这四家企业，正努力扛起测序仪的大旗。这些企业从不同的角度和方向，开发出具有自主知识产权和国际竞争力的测序仪产品，为生物科技领域的发展和人类健康的提升做出了贡献。我们期待这些企业能够继续创新和突破，为测序技术的进步和普及做出更大的贡献。但也面临着一些挑战和问题。要想成为未来基因测序新高地还需要从以下几个方面进行努力：　　一是加大对基因测序仪器设备的量产投入和支持，提升产业链上游的核心竞争力。　　二是拓展基因测序技术的终端应用领域，推动基因测序技术与其他产业的融合发展，创造更多的社会价值和经济效益。　　三是加强对基因测序行业的市场开拓和品牌建设，提升成都基因测序企业在国内外的知名度和影响力，争取更多的合作机会和市场份额。　　四是加强对基因测序行业的人才培养和引进，打造一支高素质、高水平、高效率的创新团队，为基因测序行业的发展提供人才保障。　　五是加强对基因测序行业的监管和服务，建立健全相关的法律法规和标准规范，保障基因测序技术的安全、合规、质量和效果。　　总之，成都在基因测序行业方面有着不可忽视的优势和潜力，也面临着一些挑战和机遇。抓住时代发展的契机，充分发挥自身优势，积极解决存在的问题，期待成都成为未来基因测序新高地。　　本文作者：Lambyang

p　　北京大学生物动态光学成像中心/北京未来基因诊断高精尖创新中心/生命科学联合中心/工学院黄岩谊教授课题组日前在DNA测序方法的研究上取得重要突破。该团队在此前谢晓亮教授首创的荧光发生测序技术基础上发展了一种全新概念的测序方法——纠错编码(简称ECC)测序法。ECC测序法采取一种独特的边合成边测序(SBS)策略，利用多轮测序过程中产生的简并序列间的信息冗余，大幅度增加了测序精度。该进展于2017年11月6日以“Highly accurate fluorogenic DNA sequencing with information theory-based error correction”为题在线发表于《自然 生物技术》(Nature Biotechnology)期刊上。/pp　　ECC测序法的化学反应采用了荧光发生测序技术，该技术由谢晓亮课题组于2011年首次报道(Nature Methods (2011) 8, 575.)，原理巧妙之处在于在DNA互补链合成时可以释放同所延伸核苷酸数目相等的荧光分子，利用这一反应可以实现低错误率的SBS。黄岩谊课题组在此基础上，过去几年对该方法进行了拓展(ChemBioChem (2015) 16, 1153.)，为本次技术突破奠定了基础。该团队首先从化学原理上对荧光发生测序技术中的荧光标记分子进行了结构优化，设计合成了具有不同波长、更优性能的测序底物分子，并对聚合酶参与的各阶段反应动力学进行了细致的测量和建模 在深入理解荧光发生测序化学反应速度、完成度、副反应等关键技术细节的基础上，完善了ECC测序原理样机的搭建，不断迭代优化测序反应条件和信号采集流程 从数据入手，构建了精确的测序信号失相模型并提出了次级延伸理论，并据此开发出算法软件对测序反应失相过程做出了合理简化使其具备了实用性。/pp　　在ECC测序法中，序列信息的冗余来自黄岩谊课题组新发展的“对偶碱基荧光发生”SBS测序流程，该流程通过对测序试剂按对偶碱基分为两两匹配的三组，并对待测DNA序列进行三轮独立测序，继而产生三条互相正交的简并序列编码。这三条编码可互为校验，后续不但能够通过解码推导出真实碱基序列信息，而且具备对单轮测序错误位点的校正能力。ECC编码和解码策略已被广泛应用在信息通讯和存储等其它领域中，并被证实可以有效检测和纠正数据传输或存储时发生的错误。此次黄岩谊团队在测序技术中首次引入冗余编码概念，通过和低错误率的荧光发生测序技术巧妙结合，在实验室搭建的原理样机上获得了单端测序超过200碱基读长无错误的实验结果。/pp　　该论文作者包括北京大学博士后陈子天，博士研究生周文雄、乔朔、康力，段海峰副研究员，谢晓亮教授和黄岩谊教授 黄岩谊是这篇文章的通讯作者。该工作先后得到了北京市科委、国家科技部863计划、国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心以及北京未来基因诊断高精尖创新中心的资助。/p

ATP微生物检测仪作为一种可靠的检测工具，以生物化学反应将微生物的存在转化为可测量的光信号为检测原理，不仅实现了对微生物数量的快速检测，也为各种应用领域提供了关键的卫生状况评估。了解更多ATP微生物检测仪产品详情→https://www.instrument.com.cn/show/C541815.htmlATP的基本概念三磷酸腺苷（ATP）是一种在所有活细胞中广泛存在的能量转移分子。它在细胞的能量代谢过程中起着核心作用，每个活细胞都包含恒定量的ATP。因此，ATP的存在可以作为生物活性的指标，反映样品中微生物的数量和活动状况。ATP的检测对于评估细菌、真菌以及其他微生物的存在和数量具有重要意义。检测过程的第一步：ATP的释放ATP微生物检测仪的工作始于样品中的ATP释放。检测过程中，首先使用ATP拭子从样品中提取ATP。ATP拭子含有特殊试剂，这些试剂能够裂解细胞膜，从而释放细胞内的ATP。这一过程是确保所有可测量的ATP都从细胞中释放出来的重要步骤，为后续的荧光检测提供了充足的ATP源。荧光反应的核心：荧光素酶—荧光素体系释放出的ATP与拭子中含有的荧光素酶和荧光素发生反应，形成荧光反应。荧光素酶是一种催化剂，它能够将ATP转化为荧光素，通过与荧光素的反应产生光信号。这一反应基于萤火虫发光的原理，其中荧光素酶催化荧光素与ATP结合，生成光信号。这一过程的核心是荧光素酶的催化作用，它使得ATP的存在能够通过发光现象被检测到。光信号的测量与结果分析产生的光信号通过荧光照度计进行测量。荧光照度计能够准确地捕捉到反应产生的光信号强度，并将其转化为数字信号。光信号的强度与样品中ATP的浓度成正比，因此，可以通过测量光信号强度来推断样品中微生物的数量。较强的光信号通常意味着较高的ATP含量，从而反映出样品中微生物的较多存在。应用与优势ATP微生物检测仪因其快速、准确的检测能力，被广泛应用于食品安全、医疗卫生、制药和环境监测等领域。其能够实时、可靠地评估样品中的卫生状况，确保环境和产品的质量。相较于传统微生物检测方法，ATP检测法提供了更为便捷和即时的结果，帮助我们迅速做出响应和决策。结论ATP微生物检测仪通过将细胞中的ATP转化为光信号，提供了一种可靠的微生物检测方法。其工作原理涵盖了从ATP的释放、荧光反应的核心到光信号测量，为微生物检测提供了科学、准确的解决方案。这一技术的应用更大地提升了卫生监测的效率，确保了各种行业的安全与质量。

p　　测序技术的每一次变革，都是对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发等领域的巨大推动作用。从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。/pp　　根据原理的不同，人们将测序技术发展分为三个阶段，第一代，sanger测序。第二代，高通量测序(NGS)。第三代，单分子/纳米孔测序。由于三代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是三代测序技术并存的局面。/pp style="text-align: center "strong第一代：sanger测序/strong/pp　　第一代测序技术，主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高准确性高达99.999%，目前仍是测序的金标准 缺点是通量低、成本高，影响了其真正大规模的应用。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/c42dc54f-dd66-44ff-b704-d7ae009f055b.jpg" title="1.jpeg"//pp　　因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。/pp style="text-align: center "strong第二代：高通量测序(NGS)/strong/pp　　高通量测序技术(又称为下一代测序，Next Generation Sequencing，NGS)自2005年454公司推出第一台基于焦磷酸测序二代测序仪开始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，高通量测序技术经历了十几年的技术发展过程，NGS测序平台也经历了一系列的收购和合并，最终形成主要三家测序平台，包括：Illumina的Solexa平台、Life Technologies的 Ion Torrent平台和华大基因的Complete Genomics平台。/pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　1.Illumina平台/strong/span/pp　　由于其技术成熟，平台之间高度互补性与交叉性，使得其在短读长测序上大占优势，是目前应用最广泛的NGS平台。目前其占据了测序仪市场约70%的市场份额。/pp　　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong2.Life Technologie平台/strong/span/pp　　Life公司Ion Torrent测序平台采用的为半导体测序原理，其在非碱基多聚体(non-homopolymer)的测序上正确率与其它NGS平台相差无几，而对于连续碱基的检测还不够完善，在检测同一碱基连续出现时的数量可能会有所误差。相对于其他平台，测序通量较小，平台数量也较少。/pp　　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong3.Complete Genomics平台/strong/span/pp　　Complete Genomics平台采用了高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后用复合探针-锚定分子连接(cPAL)技术来读取碱基序列。虽然这些技术非常准确，但该技术在应用上最大的限制可能就是其过短的读长。/pp　　高通量测序技术经历了十几年的飞速发展，人类基因组测序成本已经从人类基因组计划的约30亿美元降到了1000美元左右。目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高，同时测序成本也随之大幅度下降，成为商用测序的主流。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/179d5f56-cfcc-48c2-a654-d53e05adb76b.jpg" title="2.jpeg"//pp style="text-align: center "strong第三代：单分子/纳米孔测序/strong/pp　　测序技术在近两年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。/pp　　由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，第三代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/cc5887e2-9c01-4a0b-8a42-128f991dee7d.jpg" title="3.jpeg"//pp　　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong第三代测序优势：/strong/span/pp　　1)第三代基因测序读长较长，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均读长达到 10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。/pp　　2)直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了 PCR 扩增带来的出错。/pp　　3)拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。/pp　　4)三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测 在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。/pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　第三代测序缺陷：/strong/span/pp　　1)总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因 第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率(低于1%)。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。/pp　　2)三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。/pp　　3)成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。/pp　　4)生信分析软件也不够丰富。/pp　　三代测序和二代测序相比较，第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，三代读长超长，准确低，费用高，但因读长长，利于组装和发现unique reads潜在优势明显，但是劣势也限制了三代测序的商业应用。/pp　　strong未来前景/strong/pp　　目前，第二代的基因测序技术高通量测序(NGS)是市场商用主流。第三代的单分子/纳米孔测序将是未来的大势所趋，但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存，但二代测序仍将是测序市场商业应用主流。/p

在“二代测序”(NGS)尚未迎来投资热潮的情况下，技术突破捷报连连的“三代测序”(3GS)又进入到了投资人的视野中。1986年，第一台商用基因测序设备正式出现，到第二代测序设备出现，期间间隔了19年时间。而第二代设备问世，到第三代设备的诞生，仅仅用了5年，基因测序设备的更新换代速度正在不断加快。这就好比“2G”手机跳过“3G”，直接跨越到了“4G”时代。　　报告通过四个方面对第三代基因测试技术进行分析：　　1、第三代基因测试技术的发展现状 　　2、第三代基因测试方法原理 　　3、第三代极影测试技术优势和劣势 　　4、国内外布局第三代基因测试技术的公司情况。　　1、第三代基因测试技术的发展现状　　以Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表的三代测序技术在经过了多年发展后，已经逐步趋于成熟。　　尽管当下该技术还有成本偏高、错误率较高、生物信息学分析软件不够丰富的问题，但其在读长、测序速度等方面都具有明显优势。　　三代测序设备已实现稳定性、小型化，未来随着准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术将成为未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　2、第三代基因测序方法原理　　Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。　　与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。　　PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。　　测序基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。　　另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约数个dNTP。　　但是，同时其测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病)，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错(代价是重复测序，也就是成本会增加)。SMRT技术原理图　　Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。　　该技术的关键之一是，设计了一种特殊的纳米孔(只能容纳单分子通过)，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。Nanopore技术原理图　　3、第三代基因测序技术的优势和劣势　　相比于二代测序，三代测序具有如下优势：　　1、第三代基因测序读长较长。如Pacific Biosciences公司的PACBIO RS II 的平均读长达到10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。　　2、直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了PCR扩增带来的出错。　　3、拓展了测序技术的应用领域。二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。　　4、三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测 在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。　　同时，第三代基因测序也存在一定的缺陷：　　1、总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因 第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率(低于1%)。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。　　2、三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。　　3、成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。　　4、生信分析软件也不够丰富(如图所示)：一、二、三代基因测序技术对比图　　4、国内外布局三代测序的公司情况　　国外布局三代测序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015年10月27日，国内公司瀚海基因(Direct Genomics)公布了基于Helicos技术研发的专门用于临床的第三代单分子测序仪GenoCare 原理样机。　　中科院北京基因组研究所与浪潮基因组科学也在共同研制国产第三代基因测序仪。在测序仪价格方面，PACBIO 2011年的第一台三代测序仪PacBioRS在美国价格80万美金，2015年生产的sequel测序仪价格35万美金，大幅下降。在测序成本方面，预计未来5年内三代测序能达到100美元全基因组测序的价格。国内外布局三代测序的公司　　第三代测序技术是大势所趋　　从兴证医药健康这份报告中可以看到：目前，第三代测序在技术上相对于二代在读长和测序速度等方面有明显优势，但在成本和准确率等方面还有待提升。目前国内只有瀚海基因在三代测序上有临床成果，而国外已经初步实现技术商业化。总体而言，第三代测序技术是未来发展趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　本篇报告内容由动脉网整理自兴证医药健康投资报告

DNA 测序是一种确定 DNA 分子中碱基(A、T、C 和 G)顺序的技术，在生物学、医学、法医学和其他领域有着广泛的应用，例如基因组学、遗传学、分子生物学、疾病诊断和个性化医疗。 DNA 测序技术自 1970 年代以来经历了多次革命性的发展，从第一代测序到第二代测序，再到第三代测序。这些测序技术在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。本文将对基于这三代测序技术的相关仪器工艺创新进行概述，并比较其特点和应用。　　一、第一代测序仪　　基于桑格测序方法，该方法使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的DNA片段，通过电泳分离并通过荧光检测。 代表性仪器是 Applied Biosystems 及其 3730xl DNA 分析仪。 工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发 。　　a. 自动毛细管电泳：通过向填充有凝胶或聚合物基质的细毛细管施加电场来分离不同长度的 DNA 片段的过程。 DNA 片段根据其大小和电荷在毛细管中迁移，较小的片段比较大的片段移动得更快。 毛细管电泳系统可以自动并行加载、进样、分离和检测多个样品，从而提高 DNA 测序的通量和效率 。　　b. 荧光标记：将荧光染料附着到链终止核苷酸 (ddNTP) 上的过程，用于在测序反应中生成 DNA 片段。 荧光染料根据 ddNTP 的碱基类型(A、T、C 或 G)发出不同颜色或波长的光。 荧光信号由毛细管电泳末端的激光和相机或扫描仪检测 。　　c. 碱基识别算法：分析毛细管电泳产生的荧光信号并确定 DNA 片段中碱基序列的过程。 碱基检出算法使用各种方法来校正信号中的噪声、伪影和错误，例如峰检测、峰对齐、峰归一化、峰反卷积和质量评分。 碱基检出算法以各种格式输出序列数据，例如色谱图、跟踪文件或 FASTA 文件 。　　二、第二代测序仪　　基于大规模并行边合成边测序 (SBS)，它使用修饰的核苷酸或探针，在每个循环后终止 DNA 合成(或允许可逆终止终止子、可切割探针)。 DNA 分子通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 在固体表面或乳液液滴中进行扩增，并通过光学或化学检测进行测序。 代表性仪器主要有Illumina的基因组分析仪、HiSeq和MiSeq平台 罗氏及其 454 平台 以及 Ion Torrent 及其个人基因组机器和 Proton 平台。 工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。　　a. 测序反应小型化：减少第二代测序仪中 DNA 样本和测序反应的大小和体积的过程，涉及使用微流体装置或显微孔阵列来限制 DNA 分子，并通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 对其进行扩增，减少了所需的 DNA 量并增加了测序反应的密度。　　b. 光学/化学检测方法：测量第二代测序仪中 DNA 合成过程中碱基掺入所产生的光或化学信号的过程，涉及使用荧光标记的核苷酸或探针，根据碱基类型发出不同的颜色或强度。 光学/化学检测方法根据测序平台和化学成分而有所不同，通常遵循以下步骤：　　i. 在测序反应中，DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。　　ii. 测序反应提供标记的核苷酸或探针，它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子、可切割探针)。　　iii. 根据碱基配对规则将标记的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。　　iv. 荧光信号或化学信号(例如 pH 值变化)由高分辨率相机或扫描仪捕获并转换为数字数据。　　v. 通过计算分析信号以确定碱基身份和序列。　　c. 核苷酸化学方法：涉及使用修饰核苷酸或探针影响第二代测序仪中 DNA 合成的过程。 它基于互补碱基配对的原理，其中A与T配对，C与DNA中的G配对。 核苷酸化学方法根据测序平台和化学方法的不同而有所不同，通常遵循以下步骤：　　i. 在测序反应中，DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。　　ii. 测序反应提供经过修饰的核苷酸或探针，它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子或可裂解探针)。　　iii. 根据碱基配对规则将修饰的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。　　通过光学/化学方法检测修饰的核苷酸或探针，然后通过化学或酶促步骤去除或灭活，从而允许下一个循环进行。　　三、第三代测序仪　　基于单分子实时(SMRT)测序，不需要扩增或终止DNA分子。 通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性，对 DNA 分子进行测序。 代表性仪器主要有 Pacific Biosciences 及其 PacBio RS II 和 Sequel 平台 Oxford Nanopore Technologies 及其 MinION、GridION 和 PromethION 平台 以及 Ultima Genomics 及其 Ultima 平台。 工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子 使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序 以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。　　a. 零模波导 (ZMW)、纳米孔和纳米通道是三种类型的纳米结构，可以限制和观察单个 DNA 分子以进行第三代测序。　　i. ZMW 是金属薄膜中的纳米级孔径，可产生高度受限的光学观察空间。 当激光照射在金属薄膜上时，只有少量的光可以进入ZMW并激发内部的荧光分子。 这样可以检测通过 DNA 聚合酶掺入 DNA 链的单个荧光标记核苷酸或探针。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用 ZMW。　　ii. 纳米孔是膜上的纳米级孔，可在膜上产生电势差。 当 DNA 分子穿过纳米孔时，它会破坏离子电流并产生反映 DNA 碱基序列的特征信号。 纳米孔可以是生物的(例如蛋白质孔)或合成的(例如固态孔)。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用了纳米孔 。　　iii. 纳米通道是表面上的纳米级凹槽，为 DNA 分子拉伸和排列创造了一个有限的空间。 当荧光染料应用于 DNA 分子时，可以通过显微镜对它们进行成像，并且可以通过将荧光图案映射到参考基因组来确定它们的序列。 纳米通道可以通过多种方法制造，例如蚀刻、光刻或模制。 Ultima Genomics 在其 Ultima 测序平台中使用了纳米通道。　　b. 磷酸化核苷酸和纳米孔接头是两种类型的修饰核苷酸或探针，可对单个 DNA 分子进行连续测序。　　i. 磷酸化核苷酸是荧光标记的核苷酸，其磷酸基团上连接有可移除的接头。 连接体可防止焦磷酸盐的释放，否则会终止 DNA 合成。 连接子还允许在每个掺入循环后裂解荧光染料，从而可以在多个循环中重复使用相同的 ZMW。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用了磷酸化核苷酸 。　　ii. 纳米孔接头是具有发夹结构和条形码序列的合成寡核苷酸。 这些接头连接到 DNA 分子的两端，形成可以多次通过纳米孔的环状 DNA 分子。 条形码序列允许对同一 DNA 分子的重复读取进行识别和比对，从而提高准确性和共识质量。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用 Nanopore 适配器 。　　c. 人工智能是计算机科学的一个分支，它使用机器学习、深度学习、神经网络和其他方法来执行需要人类智能的任务，例如自然语言处理、图像识别、语音识别和决策。 人工智能通过以下方式提高第三代测序中的碱基检出准确性：　　i. 使用来自不同测序平台和化学物质的原始信号和相应序列的大型数据集来训练神经网络。　　ii. 开发可以纠正原始信号中的噪声、伪影和错误的算法，例如信号漂移、同聚物错误、插入/删除错误和碱基修饰。　　iii. 实施可以利用多个来源信息的方法，例如参考基因组、共识序列、质量评分和元数据。　　iv. 优化方法，适应不同的测序条件，例如读长、覆盖深度、测序速度和样品质量。　　d. 用于第三代测序中碱基检出的人工智能方法的一些示例：　　i. DeepNano：一种深度循环神经网络，使用原始电流信号执行碱基识别。　　ii. Guppy：一种基于神经网络的软件工具，使用原始电流信号执行 Oxford Nanopore MinION 读取的碱基识别。　　iii. DeepMod：一种双向循环神经网络，使用原始电流信号进行碱基识别和碱基修饰检测。　　iv. NanoMod：一种卷积神经网络，使用原始电流信号进行碱基修饰检测。　　v. Megalodon：一种软件工具，可使用原始电流信号读取执行碱基识别、碱基修饰检测和选择性剪接检测。　　vi. DeepSimulator：一种深度卷积生成对抗网络，模拟 Oxford Nanopore MinION 从参考基因组中读取的内容。　　vii. Clairvoyante：一种多任务卷积神经网络，使用原始信号强度值对 Pacific Biosciences SMRT 读取执行变体识别。　　viii. IsoPhase：一种深度卷积神经网络，使用原始信号强度值读取执行单倍型感知亚型重建。　　ix. DeepIso：一种深度卷积神经网络，使用原始信号强度值读取进行异构体量化。　　总之，第一代、第二代和第三代测序是DNA的三种不同读取方法，在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。第一代测序是基于桑格测序方法，使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的 DNA 片段，并通过电泳分离和荧光检测，工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发。第二代测序是基于大规模并行边合成边测序 (SBS)，使用修饰的核苷酸或探针，在每个循环后终止或可逆终止 DNA 合成，并通过光学或化学检测进行测序，工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。第三代测序是基于单分子实时(SMRT)测序，不需要扩增或终止 DNA 分子，而是通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性进行测序，工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子；使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序；以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。这三代测序技术各有优缺点，适用于不同的目标和场景。选择合适的测序技术需要考虑多种因素，例如读长、准确性、速度、成本和样品质量。随着科技的进步，DNA 测序技术仍在不断发展和改进，为生命科学领域带来新的机遇和挑战。

——2022上半年生命科学仪器新品盘点系列基因测序是指利用血液、组织、细胞等生物样品，对DNA进行检测的技术，迄今为止已历经四代发展，是实现精准医疗的重要手段之一。齐碳科技在今年6月份发布了纳米孔基因测序仪家族新成员QNome-3841hex，作为一款桌面式测序仪，其最大的特点在于更为灵活的通量，支持最多6个测序任务独立运行；铭毅智造在5月推出了自主研发的单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM，采用微流控芯片技术，能够实现对不同类型的科研和临床样品进行基因测序；赛默飞基于成熟的Applied Biosystems技术推出了新型SeqStudio Flex系列基因分析仪，可进行Sanger测序和多重荧光片段分析；赛纳生物在今年1月线上发布了S100测序仪。为了方便大家熟悉了解基因测序仪新品的看点与亮点，小编特别进行了一期简评，供大家学习了解。齐碳科技:换新升级 纳米孔基因测序仪家族再添新成员2022年6月6月28，齐碳科技发布国产自研量产纳米孔基因测序仪升级版QNome-3841hex，作为一款桌面式测序仪，其最大的特点在于更为灵活的通量，支持最多6个测序任务独立运行，测序过程中可自由组合测序芯片，灵活可控，无需凑样，最大程度上降低开机成本。升级版测序仪QNome-3841hex还搭载全新升级测序芯片QCell-384，单张芯片可产出3G数据量，在6张芯片同时运行的环境下，一次测序可获取18G数据，满足了更高通量的测序需求。齐碳科技 QNome-3841hex基因测序仪小编点评：作为齐碳QNome家族的新成员，QNome-3841hex的成功发布，标志着国产纳米孔基因测序仪开始矩阵化发展，将满足市场更多元的测序需求，为各领域的研究及应用提供核心支持。铭毅智造:新品UniSeq2000TM 微流控与单色荧光发光测序结合2022年5月5月9日，铭毅智造科技有限公司发布了自主研发的单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM。根据产品介绍，UniSeq2000TM采用微流控芯片技术，结合单色荧光发光测序化学技术，可以实现对不同类型的科研和临床样品进行基因测序，目前设计最大芯片数量为2张，每张芯片通量为160-320M Reads，可提供SE50/75/100/150，PE75/100/150等多种读长模式，测序数据质量Q3080%，测序周期为12-24小时，具有测序精度高、效率快、成本低、操作简单等优势。铭毅智造 UniSeq2000TM高通量基因测序仪小编点评：铭毅智造发布的新品UniSeq2000TM是一款针对临床应用的测序设备，操作简单，无需值守，适合医院本地化检测使用。高通量测序技术这个关键技术过去一直被国外公司垄断，国产单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM的发布，代表着国产基因测序仪新势力的崛起，期待越来越多的国产高端科学仪器的诞生。赛默飞:推出新品SeqStudio Flex基因分析仪 兼备测序和片段分析2022年4月2022年4月，赛默飞世尔科技推出了新型Applied Biosystem SeqStudio Flex系列基因分析仪，基于成熟的Applied Biosystems技术，通过改进优化设计和技术，使其高效灵活、简单易用且智能连接。该新品也是市面上第一款具备远程服务功能的毛细管电泳基因分析仪，打破了物理距离的限制并简化了数据传输、分析和科研协作过程，帮助科研工作者把更多的时间集中在重要工作上。SeqStudio Flex基因分析仪可进行高水平的Sanger测序和多重荧光片段分析，应用广泛，从简单的靶向测序到识别最新SARS-CoV-2病毒变异株，为科研人员提供所需的高质量数据和可靠性能。赛默飞 SeqStudio Flex基因分析仪小编简评：赛默飞推出的新一代中通量SeqStudio Flex基因分析仪，进一步扩展了Applied Biosystems产品组合，凭借成熟的Applied Biosystems的技术和智能化设计将继续引领Sanger测序和多重荧光片段分析未来的发展方向。赛纳生物: S100测序仪 采用荧光发生和纠错编码测序技术2022年1月2022年1月12日，赛纳生物线上发布S100测序仪，它是一款高通量测序平台，具有检测速度快、灵活部署、无需凑样的特点。赛纳生物测序仪采用了独创的基于荧光发生原理的边合成边测序（Fluorogenic SBS）技术。处于暗态的Fluorogenic核苷酸分子无荧光发出，当被DNA聚合酶识别并结合进入待测DNA模板时放出荧光，通过依次参与反应的核苷酸种类及荧光强度可判断DNA序列信息。该技术将发光集团修饰在磷酸键上，使用天然碱基和简单常用的聚合酶及磷酸酶，没有分子疤痕和测序偏差，降低测序过程的复杂度，可在短时间内完成天然状态DNA合成并获得精确的荧光信号，测序过程快速、结果准确，易于获得长读长。赛纳生物 S100测序仪小编简评：赛纳生物发布的S100测序仪，体型小，操作简单，具有通量灵活、准确度高、多场景适用的特点。该新品于6月获得欧盟CE-IVDR认证，在一定程度上证明了赛纳生物的研发能力和产品质量得到国际机构的认可与肯定。后记：国产企业在生命科学上游高端仪器设备持续发力，4款新品基因测序仪中，国产品牌占据3席。今年国家发改委印发的《“十四五”生物经济发展规划》提出，加快发展高通量基因测序技术，推动以单分子测序为标志的新一代测序技术创新，不断提高基因测序效率、降低测序成本。可以说，测序技术的创新已上升至国家战略层面，希望国产厂商能够乘势而上，奋勇向前。

1996年，Kasianowicz等人首次发现单链DNA和RNA电泳穿过α溶血素（α-HL）纳米孔的时候会产生对应的阻塞电流信号。此后，众多科研学者在这一研究基础上开始了更为广泛的研究。经过二十余年发展，生物纳米孔技术现已开始商业化，且市面已有成型的基于生物纳米孔单分子测序技术的基因测序仪产品。纳米孔最具前景的应用之一是其可以用于第三代DNA测序技术，因其不需要复杂的酶扩增以及荧光标记，且其具有低成本高通量的特点而受到广大研究者们的青睐。纳米孔是单分子测序仪最核心部件图1 纳米孔DNA测序的基本原理图。（a）基于纳米孔的DNA测序传感器搭建示意图，图中显示一条单链DNA正在电泳穿过石墨烯纳米孔。（b）单链DNA过孔时产生的阻塞离子电流信号细节示意图，每个碱基的体积及其与纳米孔之间的相互作用强度不同导致对应的阻塞电流幅值存在差异，从而可以用来区分不同的DNA碱基。【Si Wei, et al. Chin. Sci. Bull., 2014, 59(35): 4929-4941.】纳米孔单分子DNA测序传感器基于库特计数器原理，如图1所示在固态薄膜的顺式端（cis）和反式端（trans）都注满了离子溶液，两端的溶液仅通过纳米孔进行连接，当带电的DNA分子被置入到液池的顺式端后，在纳米孔的两侧施加电压，DNA分子会在电场力的作用下电泳穿过纳米孔，由于DNA碱基自身在孔内的物理占位以及其与纳米孔间较强的相互作用使得通过纳米孔的电流会被阻塞。一条单链DNA（ssDNA）由腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）组成。因为四种碱基的尺寸及特征各异，当单链DNA穿过跟自身尺寸相当的纳米孔时，不同的碱基会产生对应幅值的阻塞电流，通过研究这些电流之间的差异就可以实现对DNA四种碱基的辨识，如图1所示。通过分析这些阻塞电流信号（如阻塞电流幅值和过孔时间等），DNA链上所含的碱基很有可能被检测和区分开来。纳米孔作为单分子测序仪器设计与制造的核心检测部件，因此如何保证纳米孔单分子传感器的检测灵敏度、时间空间分辨率、稳定性和寿命等是影响纳米孔单分子测序仪器工作效率和稳定性的关键技术问题。三大技术突破成就了如今的纳米孔单分子测序仪自1996年纳米孔被Kasianowicz等人发现以来，众多科学家投入大量精力深入研究，在研究过程中也遇到很多难题。例如，尽管研究者们都相继报道了纳米孔离子电流可以用于四种碱基的区分，然而他们得到的结论却大相径庭，使得阻塞电流的幅值和相应碱基之间的对应关系至今仍然含糊不清。研究者们对单链DNA均聚物在过孔时产生的阻塞电流幅值跟碱基体积大小的相关性进行了研究，组成DNA四种碱基的体积大小顺序为GATC，理论上DNA碱基的尺寸对离子电流信号的影响较大，然而其与纳米孔的强相互作用在阻塞电流幅值检测方面也会起到主导作用，且在不同的纳米孔材料或者实验条件下获得的实验结果差异较大，这也制约了基于纳米孔DNA测序的发展。经历了20余年的发展，三大技术突破与革新也成就了现今的纳米孔单分子测序仪的研制。首先是纳米孔检测DNA或RNA全新技术方案的提出，其次是采用酶对DNA分子的剪切或复制用于纳米单分子测序技术中，最后是单碱基信号的测序精度精准调控。之后数年的时间，Oxford Nanopore 公司于2013年11月启动了MinION测序仪的早期试用计划，这时首款纳米孔单分子测序仪也正式开始步入人类的视野。便携、低成本和高通量 纳米孔单分子测序成为最具潜力的DNA测序技术人类基因组计划人类基因组计划在2003 年完成人体全序列的基因测定，历时12 年，耗资数十亿美元，人类基因序列图已成为全人类共同的财富。但是，第一代的 Sanger测序方法也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人望而生畏。近两年发展迅猛的第二代测序仪让人类基因组重测序的费用降低到10 万美元以下，测序时间也缩短到6 个月。但是，这样的价格和时间，相对于个人用户仍然太高，极大地限制了其临床应用和基础理论研究。与传统Sanger测序技术相比，纳米孔单分子测序技术的核心优势在于它的便携性、低成本和高通量。强大的市场需求和探索生命科学未知领域的渴望，有力地推动着DNA 检测水平的提高。2004 年，美国国家人类基因组研究所（NHGRI）启动了“千元基因组测序研究项目”, 目的是让人类基因组的测序费用降至1000 美元以下。基于纳米孔的单分子DNA 测序方法是第三代测序技术中成本最低，最具有竞争力的技术。同年，美国国家卫生研究院（NIH）提出了“1000美元测序”的概念，而基于纳米孔的DNA测序技术是最有潜力实现这一目标的方法之一，众多实验研究也进一步验证了纳米孔DNA测序技术的可行性。该方法的优势在于它简化了对DNA 的化学修饰、扩增和表面吸附等工艺，具有结构简洁、速度快、操作简便等特点，同时省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机的费用。最为重要的是它的效率高，单个核苷酸分子通过纳米孔的时间仅在微秒级，如果考虑单个芯片上集成成百上千个纳米孔阵列，有望在24 小时内完成对个体的基因测序，而目前的二代基因测序仪则需要6 个月时间。 商业化进展慢 提高纳米孔稳定性迫在眉睫纳米孔单分子测序技术现有市场的典型产品是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪，它具有低成本、高通量、读速快、读长长（约150kb）和高便携等特点，因此纳米孔单分子传感器目前已被广泛应用于物理学、生物学和化学等学科涉及单分子应用的科学研究，助力人类科技的发展，造福人类。基于上述纳米孔单分子测序技术的特点，相比传统测序仪器而言，它的典型应用场景之一是极端环境中病毒或细菌的高精度检测。例如，在偏远贫困地区，在疫情爆发或在没有足够的设备资源的情况下，便携的纳米孔单分子测序仪可以快速的协助病毒检测和疾病诊断。数年前西非爆发埃博拉病毒时，单分子测序仪便在病毒检测过程中起到的重要作用。再例如，存放在外太空空间站的土壤和水等是否已经出现微生物依然成谜，要将样品带至地球进行采样分析方能揭晓，而轻便的纳米孔单分子测序仪仅有u盘大小，可以方便的携带至外太空，在其他辅助条件下协助检测。虽然基于纳米孔的单分子测序仪具备很多优势，而且已经进入商业化进程，但是它的市场占有率相比传统测序技术而言依然偏低。其原因主要是目前市场已有的纳米孔测序仪采用的仍然是生物纳米孔和磷脂膜，这样的生物体系不可避免的面临着寿命短和稳定性不持久的缺陷。因此要推进纳米孔单分子测序技术的发展，这些问题必须得到解决。而固体纳米孔（例如氮化硅，二硫化钼）目前的报道也可以辨识单碱基，因此固体纳米孔有望在未来代替生物纳米孔实现稳定、可重复利用的高精度DNA测序。然而固体纳米孔在信噪比方面不如生物纳米孔，而且DNA在相同条件下通过固体纳米孔的速度偏快，因此如何提高固体纳米孔的信噪比和实现有效的DNA控速也是亟需解决的关键科学问题。作者简介：司伟，博士，东南大学硕导/讲师，2020年度东南大学“至善青年学者”，江苏省2019年度优秀博士学位论文和东南大学2019年度优秀博士学位论文获得者，入选2019年、2020年东南大学机械工程学院“优才培育计划”，担任《MaterialsInternational》(ISSN: 2668-5728)期刊助理编辑和《Bioengineering International》(ISSN 2668-7119)期刊编委，获得2019年Nanotechnology期刊杰出审稿人奖。主要研究方向：（1）机械操控及机器人技术、（2）工程流体动力学及传感器、（3）结构工艺设计及加工制造、（4）程序语言算法和三维建模与仿真。

p style="text-align: center "/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/b9badc3b-2ddc-463d-94cc-6895afc62199.jpg" title="黄岩谊.jpg" width="627" height="195" style="width: 627px height: 195px "//pp style="text-align: center "图. 全新设计的核苷酸底物通过聚合酶的延伸反应产生荧光产物用于测序br//pp　　在国家自然科学基金项目(项目编号：21327808，21525521)等资助下，北京大学黄岩谊课题组日前在DNA测序方法与技术上取得重要进展，发展一种全新概念的测序方法—纠错编码测序法(简称ECC)，该方法采取一种独特的边合成边测序(SBS)策略，利用多轮测序过程中产生的简并序列间的信息冗余，大幅度增加了测序精度。研究成果于2017年11月6日发表在Nature Biotechnology(《自然-生物技术》)期刊上。论文链接：http://www.nature.com/articles/nbt.3982。/pp　　序列信息的冗余来自黄岩谊团队新发展的“对偶碱基荧光发生”SBS测序流程，该流程通过全新设计的特殊测序反应底物，对待测DNA序列进行三轮独立的SBS测序，继而产生三条互相正交的简并序列编码。这三条编码可互为校验，后续不但能够通过解码推导出真实碱基序列信息，而且具备对单轮测序错误位点的校正能力。这种编码和解码策略已被广泛应用在其它科学领域中，用于有效检测和纠正错误。此次黄岩谊团队在测序技术中首次引入冗余编码概念，通过和低错误率的荧光发生测序技术相结合，在实验室搭建的原理样机上获得了单端测序超过200碱基读长无错误的实验结果。在ECC测序中，黄岩谊团队首先从化学原理上对荧光发生测序技术中的荧光标记分子进行了结构优化，设计合成了具有不同波长、更优性能的测序底物分子，并对聚合酶参与的各阶段反应动力学进行了细致的测量和建模。在深入理解荧光发生测序化学反应速度、完成度、副反应等关键技术细节的基础上，构建了精确的测序信号失相模型并提出了次级延伸理论，并据此开发出算法软件对测序反应失相过程做出了合理简化使其具备实用性。/pp style="text-align: right "【原标题：我国学者在DNA测序方法与技术上取得重要进展】/ppbr//p

一家由Facebook亿万富豪尤里&bull 米尔纳(Yuri Milner)支持的小型企业正在寻求进入DNA测序的热门领域，其所研发的产品是一款和笔记本电脑相同尺寸和重量&mdash &mdash 可能也会是相同价格&mdash &mdash 的设备。　　&ldquo 我们所谈论的DNA测序工具是一款类似于iPad的设备，使用起来非常简便，成本也相当低廉，&rdquo GenapSys公司31岁的联合创始人兼首席执行官何塞姆&bull 艾斯方迪亚普尔(Hesaam Esfandyarpour)表示，&ldquo 我们的目标是将它带到普罗大众的手中。&rdquo 　　这一观点和Illumina截然不同：Illumina是一家出售面向研究人员的DNA测序工具、化学品和其他工具的企业，去年的销售额高达14.2亿美元。今年早些时候，Illumina宣布，其成功到达了生物学上期盼已久的一个里程碑：以1,000美元的价格解密人类的全套DNA序列。　　然而相关设备的成本价高达100万美元，且必须十个一组进行购买，明年仅有几十个可供出售。这是DNA测序工厂的中心 大型实验室，如位于剑桥的哈佛-麻省理工布罗德研究所(The Harvard-MIT Broad Institute)，以及澳大利亚的嘉万医学研究所(Garvan Institute of Medical Research)立刻进行了订购。　　艾斯方迪亚普尔表示，他的机器每台售价仅为几千美元，用户可能需要为使机器运作起来的原料和化学品支付更多资金。但他尚未定下官方价格。GenasSys即将上市的原因是想要让科学家们更早地使用到这些机器。商业性质的产品上市将在一年多以后实现。艾斯方迪亚普尔在佛罗里达州马可岛的年度基因组生物学及技术进步研讨会(Advances in Genome Biology & Technology Meeting，以下简称&ldquo AGBT会议&rdquo )上首次谈论了该项技术。　　DNA测序背后的概念类似于生命科技公司(Life Technologies)出售的Ion Torrent设备的原理 后者正使用一种半导体芯片试图和Thermo Fisher的产品进行融合。(艾斯方迪亚普尔曾经致力于该设备的授权专利的研究。)但两款设备的原理有所不同：Ion Torrent设备测量的是DNA反应时释放的离子，而GenapSys设备测量的则是DNA分子在进行复制、释放其编码时的电信号。　　艾斯方迪亚普尔表示，Ion Torrent的设备需要多块芯片，每次运作可能需要几百美元的代价。第一次运作将测量1 个gigabase的DNA，第二次测量20个gigabase，第三次则测量100个gigabase&mdash &mdash 这是精确分析人类基因组所需要的DNA编码数量。　　&ldquo 这可能是一块利基市场，一种真正小型的设备，价格仅相当于一台笔记本电脑，大小也与笔记本差不多，&rdquo GenasSys顾问委员会受雇顾问、哈佛大学的乔治&bull 彻奇(George Church)表示，&ldquo 价格绝对低廉，甚至都不能称其为设备。它填补了(Illumina)MiSeq或(Ion Torrent)或Nanopores公司尚未涉足的一块利基市场。&rdquo 此外，他还希望，GenasSys的DNA测序设备的价格能在该产品正式推出后进一步下降。彻奇表示，他在GenasSys总部亲眼见证过这些机器的运作。　　GenapSys科学顾问委员会的另一名成员、斯克瑞普斯研究所(Scripps Institute)的埃里克&bull 拓普尔(Eric Topol)也同样表达了乐观情绪。他表示，这款设备的重量仅有几磅重，在另一种重要的DNA测序方法上表现良好：读数长度(read length)，即设备一次所能读取的DNA数量。(所有测序设备都只能解码部分基因编码，然后采用超级计算机进行重新组合。)　　&ldquo 我们正开始一个针对患有糖尿病儿童的抗体测序的研究项目，如果不能进行长读数，这个项目甚至无法开展，&rdquo 拓普尔说，&ldquo 随着时间的推移，这将被证明是有用的、重要的，但显然现在还处于非常早期的阶段。&rdquo 　　阿拉巴马州亨茨维尔的哈德孙阿尔法研究所(HudsonAlpha Institute)所长兼主任里克&bull 迈尔斯(Rick Myers)为一家风险投资基金对GenapSys进行了审查。&ldquo 我对此感到激动，因为我认为这家公司真的有潜力，&rdquo 迈尔斯说，&ldquo 他们一定要这么做，把产品带到科学家手中，而他们有潜力成为这个领域的真正玩家。&rdquo 　　基因组学研究人员此前一直都是广告宣传的受害者。几年前，采用激光技术来对DNA单个分子进行测序的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)发誓要赶超Illumina 它从未成功，但成为了超长DNA读数领域的利基玩家。两年前，一家名为Oxford Nanopore的公司展示了一款指状存储器大小的DNA测序仪，并表示将很快有售&mdash &mdash 但目前为止市场上仍不见其踪影，不过14日上午，布罗德研究所的一名研究员大卫&bull 杰夫(David Jaffe)在AGBT会议上展示了源自于该设备的数据。研究人员对此表示激动，但也警告说，这款设备可能&ldquo 易于出错&rdquo 。高盛分析师艾萨克&bull 罗(Isaac Ro)称，这一演示对Illumina公司来说&ldquo 完全是积极的&rdquo ，因为这使得竞争变得更为不可能了。　　艾斯方迪亚普尔表示，他从未想过单个DNA分子测序&mdash &mdash 正如Oxford Nanopore和太平洋生物科学公司所做的那样&mdash &mdash 会有高准确率 物理学原理使得这非常困难。他认为，他的方法既便宜又更好。他利用400万美元的奖励金和来自Facebook亿万富豪尤里&bull 米尔纳、德诚资本、盈富泰克创业投资公司(IPV Capital)的不到5,000万美元资金打造了自己的仪器。现在，他必须证明这款仪器可以实现他的愿望。

p　　从1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始，测序技术发展至今已有四十多年时间，先后经历了以GS FLX、Solexa、SOLID为基础的二代测序技术，以及基于单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序技术的三代测序技术。虽然三代测序在蓬勃发展，并在基因组和转录组测序等领域展现出前所未有的优势，但限于成本问题，其应用范围尚不及二代测序。br//ppbr//pp　　二代测序技术以其短读长、高通量、准确性高的特点，仍在测序市场上占优势地位。以Illumina Solexa为例，首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库，加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面，经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”，实现碱基信号强度放大，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面，准确的测序。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/55d34bab-6612-47a8-873c-49b4c5dcb0eb.jpg" title="1.jpg" style="width: 600px height: 276px " width="600" vspace="0" hspace="0" height="276" border="0"//ppbr//pp style="text-align: center "strong图1 Hiseq Xten (左) 与 NovaSeq 6000（右）/strong/ppbr//pp　　2014年Illumina推出HiSeq X Ten测序仪，它利用数十亿个纳米孔的流动槽，较大缩短了测序周期。2017年它又推出了新一代测序仪NovaSeq系列，我们以相同文库分别进行Hiseq Xten系列和NovaSeq系列测序，DNA重测序产出数据指标如下：/ppbr//ppstrong表1 DNA重测序结果比较/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/5454c24d-abf7-4aef-b3d4-a4cfe7b68c24.jpg" title="2.jpg"//ppbr//ppbr//pp看完重测序，再看看转录组文库测序比较：/ppbr//ppstrong表2 转录组测序结果比较/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/9429bf33-74ea-4c0a-b71e-150a0478b58e.jpg" title="3.png"//pp基于以上结果，图谱君总结了以下几点：/ppbr//ppstrong1.测序原理/strong：X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理；Nova6000采用Illumina的EX-AMP簇生成技术，以及新一代的Patterned Flow Cell。/ppstrong2.Q30质量值/strong：在实际测序中Nova6000的Q30相对于X-ten更稳定且测序时长更短，试剂衰减对质量影响更小，整体的Q30 Nova6000要优于X-ten。/ppstrong3.测序方式/strong：受限于X-ten的控制软件以及试剂等因素，X-ten只能进行单Index的测序识别；而Nova6000可以进行I7 I5双端Index的测序，理论上可以做到更精准的识别。/ppstrong4.DNA文库冗余度/strong：Nova6000明确优于X-ten平台。/ppbr//pp　　有没有发现随着二代测序仪器的发展，测序结果真是又快又好，目前二代测序较多的应用于基因组重测序，转录组分析，小分子RNA研究等领域。基于二代测序技术进行遗传图谱构建，基因定位的研究也越来越多。/p

深圳共进电子股份有限公司6日正式宣布与上海小海龟科技有限公司签署战略合作协议，强势进军大健康领域，双方将共同打造国内首款自主研发的基因测序新产品——半导体高通量基因测序仪，为精准医疗发展注入强力，成为基因测序领域迅速崛起的新兴力量。 共进股份作为全球领先、中国最大的高端通信电子产品生产巨擘，于2015年2月在上交所成功上市，产品涵盖各类网络通信终端设备、智慧家庭、可穿戴产品。小海龟科技是一家从事创新生物芯片及高端医疗器械研发、生产和服务的高科技公司，已自主研发成功半导体高通量基因测序仪和测序芯片，并启动预研更下一代的基因测序技术。 去年上市以来，共进股份就已确定转型升级目标领域，包括实施智能化工厂解决方案，拓展智慧家庭领域、大数据个性化服务领域及智能生物传感器领域。去年6月的16亿元定增计划进一步锚定“互联网+医疗健康”、“互联网+智慧家居”两大领域，此次联姻小海龟科技是其转型大健康医疗领域的第一步。 据1月5日晚间共进股份刊登的公告，此次向小海龟科技共注资人民币3000万元，所占股份达10%。另据发布会介绍，共进股份此前已间接持有小海龟科技5%的股份。因此，共进股份目前共持有小海龟科技15%的股份。 在发布会上，共进股份和小海龟科技联合推出一款新产品——半导体高通量基因测序仪。据小海龟科技首席科学家吴东平介绍，该产品的核心原理是利用半导体芯片中高度集成的传感单元测量离子变化并转换为电信号读出，具有通量高、速度快、精度高的优点。据悉，该产品是国内首款自主研发的半导体基因测序仪，拥有全自主知识产权，技术先进。更吸引市场的是，该仪器价格和测序费用都将大大低于目前的市场行情，将有力推动基因测序技术的普遍使用。 共进股份董事长汪大维告诉记者，“对于进军基因测序行业，我们和小海龟的合作可谓是珠联璧合，除资本合作以外，共进股份将与小海龟科技在半导体高通量基因测序仪新产品的生产、产业化、市场营销等方面达成深度合作。” 共进股份总经理唐佛南说，“共进股份与小海龟之间的战略合作，是共进股份布局大健康产业链的第一步，这也是共进股份在拓展智慧家庭领域、大数据个性化服务领域及智能生物传感器领域以外又一次重大的新的尝试。” 早在去年6月，共进股份就推出了募集资金约16亿元非公开发行预案，募投项目中包括了“宽带通讯终端产品升级和智能制造技术改造项目”、“基于人工智能云平台的智慧家庭系统产业化项目”、“可大规模集成智能生物传感器研发项目”、“生物大数据开发利用关键技术研发项目” 等五大项目。 中国是生物和基因测序技术大国，基因测序技术的发展在众多领域都有着极其重要的意义。作为传统治疗与健康管理方式的革新，基因测序广泛应用于个体化医疗，遗传病检测、传染病监控、体检，食品安全检测、育种，药物开发，医疗保险系统、公安安全系统，生命科学研究等领域。 近年来，基因测序产业得到迅猛发展，全球基因测序市场总量从2007年的794.1万美元增长至2013年的45亿美元。预计未来几年，全球市场仍将继续保持快速增长，而Markets and markets预测，中国的基因测序产业2012-2017年间复合年均增长率达到20%-25%。

在基因测序领域，谁控制仪器，谁就会赢得天下，从ABI的3730测序仪到后来的illumina的测序仪，都可以证明这点，这个行业目前是由上游技术驱动的，对技术的依赖度很强。测序公司、诊断公司都加大对测序技术领域的投资，以期能在未来基因测序爆发时期，获得可观的市场份额。根据安永的最近一份报告显示，未来5年内，基因测序的仪器市场规模同基因测序服务基本相当。　　罗氏、illumina公司都加大对新技术的投资。2012年，Roche公司宣布基因测序仪454从测序市场退出时，就加紧在纳米测序技术领域的布局，先后投资了Genia Technologies公司和Stratos Genomics公司。illumina公司也早就盯上了纳米孔测序技术，是牛津Nanopore公司的主要股东之一。然而令illumina公司恼火的是，2013年10月，牛津Nanopore公司回购了illumina公司持有的13.5%股份，从而保持该公司更加独立运营，此次回购价值共超过5640万美元。　　纳米孔测序原理　　在A，T，G，C四种不同的脱氧核苷酸通过纳米孔进入的时候，其所引起的电流变化也是不一样的，随即可通过电流来检测DNA序列。双链DNA直径为2nm，单链DNA直径为1nm，所以采用的纳米孔尺寸有着近乎苛刻的要求。纳米孔：分为生物纳米孔和固体纳米孔，生物纳米孔：a溶血素(一般嵌入在双层脂膜当中)，最窄直径尺寸为1.5nm，可允许单链DNA分子通过。但是生物纳米孔对稳定性、电流、噪声等方面有很高的要求。固态纳米孔：由硅及其衍生物制造，通过电子束和离子束在硅或其他材料薄膜上钻出纳米尺度的孔洞。固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势，但是目前有技术瓶颈，以及造价高昂。　　固态纳米孔工艺　　固态纳米孔的制作与半导体工艺的结合使得DNA测序芯片的大规模生产成为可能. 2001年，Li等人使用聚焦离子束在 Si3N4 薄膜上制作出了直径61 nm 的孔，随后又采用 Ar将孔径缩小到了1.8nm。2003年， Storm等人用高能电子束在SiO2薄膜上制作出了直径2 nm的孔. 如今， 人们已经可以在很多材料上制作出亚 10 纳米尺度的固态纳米孔，例如，SiNx，SiO2，SiC，Al2O3等. 此外， 石墨烯因其本身超薄的结构和特殊的电子特性也作为薄膜材料的一种新选择，它的超薄的单原子层结构十分适合隧道电流的测量。　　纳米电极制作　　纳米电极的制作在测序用纳米孔制造工艺中也是一项重要的挑战。前文提到， 纳米电极的形状、与纳米孔重合度的好坏直接影响到电流信号的好坏， 因此要在纳米尺度制作出形状规则、 电学特性良好的电极并不容易。　　目前研究者们所做的工作都是在实验室中对单个纳米孔进行研究， 而无法将其运用到商业中. 到目前为止， 还没有办法能够快速制作出直径大小均一且都在5 nm以下的纳米孔阵列， 在DNA测序芯片向商业化转变的道路上， 这是必须解决的一个问题. 但是， 相信随着半导体制造工艺和纳米电子学的不断发展， 人们一定会制作出高质量的纳米孔芯片。　　产品：Minion　　由英国公司Oxford Nanopore开发设计MinION测序仪则拥有很长的读长，而且只有普通U盘大小，由一个传感器芯片，专用集成电路和一个完整的单分子感应测试所需的流控系统构成，可随身携带，理论上可实现想测就测。日前该测序仪已投入市场使用，或许未来它将基因测序仪变得如同手机一样普通、便捷、廉价。该技术被MIT Technology Review杂志评为&ldquo 2012年10大年度科技突破之一&rdquo 。但是其错误率很高，据称有35%的错误率，平均10个碱基，就有3.5个测序错误。这也意味着基因突变检测成为纳米孔测序的禁区，也成为纳米孔测序的致命弱点，并让其长读长的优势黯淡无光。　　面临挑战　　虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势，但是目前还处在起步阶段，从测序原理到制造工艺都存在有许多问题，许多技术也都只停留在理论阶段。其面临的挑战主要是如下几个部分：　　电流检测系统：电流识别最短距离为3nm，而且目前的材料几乎很难寻找到孔径这么小的材料。　　纳米膜系统：限制目前的纳米孔大小，目前有关纳米孔制作方面仍有很大的阻力　　数据分析系统：即使很多人获取这些数据，但是对于数据的运行和分析仍旧存在很大障碍。　　主要纳米孔技术公司　　Base4, UK　　Fullgen, Argentina　　Genia, USA, California　　INanoBio, USA, Arizona　　Ionera, Germany　　Izon Science, New Zealand　　Nabsys, USA, Providence　　Nanion, Germany　　Nanopore, USA, New Mexico　　Noblegen Biosciences, USA, Massachusetts　　Oxford Nanopore Technologies, UK　　Quantapore, USA, California　　Quantum Biosystems, Japan　　中国从事相关技术研究学者　　龙亿涛　　华东理工大学，上海市曙光学者，&ldquo 东方学者&rdquo 特聘教授，研究方向纳米光谱电化学，纳米通道单分子分析，仿生界面等。　　赵清　　北京大学凝聚态所副教授，主要从事ZnO、AlN纳米线的制备、掺杂，表征，电学，光学，场致电子发射性能方面的研究。　　注：部分内容来自生物通和贺建奎博客

基因测序技术已成为在生物医学领域影响最大，竞争最激烈的高新技术研究领域之一。根据通量、读长及技术出现时间等不同，基因测序仪可划分为一代基因测序仪（Sanger测序）、二代基因测序仪（MPS，大规模并行测序）、三代基因测序仪（单分子测序）等。由于基因测序仪研发难度大、市场准入门槛极高，研发出测序仪器的企业不多，而能够批量生产基因测序仪的企业更是屈指可数。目前国内基因测序仪市场有小20家测序设备智造企业，其中多家为贴牌生产单位，测序仪自主研发企业仅不到10家。尽管当前基因测序仪市场仍然以二代测序技术为主流（约占到整体市场份额的八成），但作为测序“黄金标准”的一代测序仪在市场仍有较大影响力和部分受众用户，而以纳米孔技术为典型的第三代测序仪市场开始崛起。近一年来，笔者观察到国内外市场共有5款新型基因测序仪宣发上市。从技术路径上看，其中4款为二代基因测序仪，1款为纳米孔测序仪。仪器机型整体向更高通量、更小体积、更快速度、测序流程更简单方向发展。2021年以来基因测序仪新品国产企业在生命科学上游高端仪器设备持续发力，5款新品基因测序仪中，国产品牌占据三席，进口品牌占到两席。以下是上文出现的基因测序仪新品详细信息：赛默飞2021年10月，赛默飞发布Ion Torrent Genexus高通量测序系统 。赛默飞 Ion Torrent Genexus 高通量测序系统Ion Torrent Genexus系统是行业内第一个真正落地实现 “All in One，One for All” 理念的高通量二代测序（NGS）系统，由纯化系统、一体化测序仪和软件组成，极具创新性地将NGS全部湿实验和干实验，及全流程硬件系统和软件系统实现一体化。只需2步、15分钟的手动操作和设置，1~32个样本通量，最快一天完成NGS全流程。华大智造2021年华大智造没有推出新型测序机型，但华大智造在10月份启动了DNBSEQ-T7和MGISEQ-2000的产品性能全新升级。在日通量超高的测序仪DNBSEQ-T7上，主要升级包括：全新版本的测序试剂（V2.0）、仪器控制软件和算法更新、配套MGIDL-T7（DNB自动化加载仪器）软硬件升级，推出高通量测序试剂套装V2.0，数据产出更高、更稳定。华大智造 MGISEQ-2000 基因测序仪在中高通量测序仪MGISEQ-2000上，目前已经支持6种读长模式的MGISEQ-2000又一次完成“自我突破”—，在读长方面实现了从PE200到PE300的飞跃。在此之前，市面在售能首次实现PE300或SE600的只有两个系列的机型：一个是Illumina的MiSeq系列，另一个是Thermo Fisher的Ion GeneStudio S5系列，如今华大智造MGISEQ-2000终于跻身此列。Singular Genomics12月16日，Singular Genomics Systems, Inc.（纳斯达克股票代码：OMIC），一家利用新型下一代测序(NGS) 和多组学技术为研究人员和临床医生赋能的公司，宣布推出台式测序仪G4。Singular Genomics G4台式测序仪通量：每次运行 15-400 GB 数据TAT：6-19 小时的运行时间准确度：所有套件的准确度为 99.6-99.9%NGS平台具有新颖的高性能化学和先进的工程技术，可为包括肿瘤学和免疫学研究在内的一系列应用提供准确性、灵活性、速度和功能。据悉，G4 仪器和耗材套件的订单现已开始接受，预计将于 2022 年第二季度开始发货。齐碳科技2021年12月底，齐碳科技发布QNome-3841纳米孔基因测序仪。齐碳科技纳米孔基因测序仪 QNome-3841相比起去年发布的QNome-9604，这款测序仪新品最大的提升在于电路的设计，将原来的板级电路升级为集成电路——将原本分离的元器件集成到齐碳科技自主研发的ASIC芯片上，可以进一步缩小仪器尺寸、提高通量，为下一步中、高通量机型的研发打下基础。同时，仪器的小型化并不以牺牲性能为代价，纳米孔测序的技术原理决定了纳米孔基因测序仪具有小型化的潜力。经过模型迭代，目前K1孔的单次准确率已经提升至94%，而最新研发的K2孔的单次准确率最高已达97.6%。塞纳生物2022年1月12日，赛纳生物线上发布S100测序仪。塞纳生物S100测序仪赛纳生物S100测序仪是一款高通量测序平台，具有检测速度快、灵活部署、无需凑样的特点。赛纳生物测序仪采用了独创的基于荧光发生原理的边合成边测序（Fluorogenic SBS）技术。处于暗态的Fluorogenic核苷酸分子无荧光发出，当被DNA聚合酶识别并结合进入待测DNA模板时放出荧光，通过依次参与反应的核苷酸种类及荧光强度可判断DNA序列信息。该技术将发光集团修饰在磷酸键上，使用天然碱基和简单常用的聚合酶及磷酸酶，没有分子疤痕和测序偏差，降低测序过程的复杂度，可在短时间内完成天然状态DNA合成并获得精确的荧光信号，测序过程快速、结果准确，易于获得长读长。附“基因测序专场”

基因测序技术是一种基因检测技术，也被称为DNA测序技术，是进行分子生物学研究和基因改造的基础，也是解锁人类生命奥秘的重要方式之一。基因测序技术发展了40余年，已在众多领域被广泛应用，包括生物的基因组图谱绘制、物种进化演替过程、表观遗传学、疾病相关基因的确定和诊断等等。近年来，基因测序相关产品和技术由实验室研究演变到临床使用，为我们理解人类生物学特征和疾病，评估遗传疾病提供了关键性信息，所以说基因测序技术是下一个改变世界的技术毫不为过。 在新冠疫情期间，这项技术得到了更多人的关注。疫情爆发初期，在不到一个月的时间内，通过基因测序技术，新冠病毒(COVID-19)的基因组序列被公布，为分析武汉新型冠状病毒的进化来源、致病机制提供了第一手资料。不少国家也发起了COVID-19患者基因测序计划，以了解个人基因对病毒感染反应的影响，这项研究的数据将为患者护理及药物处方提供信息，未来还可以帮助疫苗设计，从而拯救更多生命。 整个测序环节中，从样品收集到上机测序，水贯穿了包括测序仪的日常清洗维护和试剂配制在内的每一个环节。作为一个必不可少的基础试剂，水的品质对最终测序结果会产生显著影响。水中的杂质，如无机盐、有机物、核酸酶、颗粒物等，不仅会污染设备，缩短测序仪毛细管的使用寿命，而且还会降低DNA聚合酶的活性，最终干扰测序结果的准确性。下面这些基因测序经常遇到的问题很有可能是使用的水有问题，快来看看你有没有中招̷Q1：DNA测序样品用什么溶剂溶解比较好？溶解DNA测序样品，使用超纯水溶解最好。原因： DNA的测序反应的原理其实就是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果溶解DNA样品的溶液含有过多的盐，会影响测序反应体系，造成Taq酶的聚合性能下降，干扰测序反应甚至无法产生信号。纯水应用Tips: 超纯水机采用基因测序专用超纯化柱，RephiLe独创配方填料的低镁型纯化柱，可以特异性去除水中的镁离子，降低空白本底对测序反应体系的影响。Q2：测序结果怎么没有峰图呢？原因：模板被降解，罪魁祸首可能是测序使用的水中含有核酸酶。纯水应用Tips: 制备超纯水的超纯水机需要带有终端滤器，如乐枫生物的RephiBio终端滤器，可以去除DNA酶和RNA酶。Q3：为什么测序峰图出现了“瀑布效应”？“瀑布效应”是基线突然从高处下降的现象。原因：样品被有机物污染，有机物会被激发产生荧光，抬高基线。纯水应用Tips: 使用带有TOC检测系统的超纯水机,如乐枫Genie系列智能超纯水系统，有机物含量低于5 ppb，采用全氧化法设计的TOC在线监测系统，在线监测TOC含量，符合ISPE制药工程指南 / 美国药典USP等标准对于TOC检测的要求。Q4：“钉子峰”如何避免？“钉子峰”是A、T、C、G四个颜色的峰都被突然拔起，形成的尖锐峰形。原因： 溶液中可能存在气泡或者颗粒，气泡和颗粒对激光全反射，形成“钉子峰”。纯水应用Tips: 纯水机取水口配备0.22μm的终端滤器，测序之前使用超声波对超纯水进行脱气可以有效地防止“钉子峰”。 乐枫生物Genie系列智能纯水系统以稳定的水质、智能的操作系统充分满足基因测序用水需求，在诸多应用到测序仪的实验室常常会看到乐枫生物Genie系列智能超纯水系统的身影。华大基因海外“火眼实验室”采用的超纯水机是Genie 系列的超纯水系统。关于乐枫生物 乐枫生物(Rephile Bioscience，Ltd.) 是一家专业从事高端水纯化和实验室分离纯化产品研发、设计和制造的企业，为高科技生物技术和生命科学领域的用户服务。乐枫公司着眼于全球发展，在中国、美国、法国、印度、南非等近20个国家建立了销售机构，同时也为国际大型公司提供OEM和ODM，产品销往包括欧美的近100个国家。成立十余年，乐枫持续投入研发，创立出了自己的产品品牌RephiLe（瑞枫），推出了多个新概念产品- 无线连接的Genie系列纯水系统和智能型大流量纯水工作站Super-Genie等。目前乐枫纯化柱填料配方齐全，也提供多款密理博纯水系统的兼容耗材。关键词：纯水，超纯水，实验室，Genie纯水机，基因测序，测序峰图，乐枫关注RephiLe 企业微信：乐枫纯水，关注乐枫动态！

7月14日，国家药监局官网发布医疗器械批准证明文件，真迈生物GenoCare 1600单分子基因测序仪通过国家药品监督管理局（NMPA）审核，获准临床应用。GenoCare 1600获批临床应用是真迈生物发展的重要里程碑，从启动GenoCare 1600研发到获得NMPA上市批准，真迈生物实现了做中国人自己的测序仪的梦想；同时，也是真迈生物国产测序平台在生育健康领域临床布局和推广应用的关键一步。真迈生物联合创始人兼 CEO 颜钦表示：“本次获得单分子测序仪NMPA上市批件，这是对真迈生物单分子测序技术及产品服务能力的有力证明，同时再次展现出国家及大众对基因测序仪在生命健康行业中重要作用的认可。打造满足临床需求的有价值的产品，让每个生命拥有实现健康理想的基建，我们有信心为精准医疗和人类生命健康提供国产平台支撑，国产基因测序仪有能力为人民生命健康福祉做出更大贡献。”GenoCare 1600单分子基因测序仪采用基于单分子芯片的表面荧光测序技术SURFseq，利用全内反射光学原理（TIRF）对碱基的荧光信号进行识别，实现边合成边测序。凭借自身无需扩增、操作简便、自动分析等技术特点，GenoCare 1600单分子基因测序仪大大地简化了基因检测过程，显著降低了测序成本和检测周期。GenoCare 1600单分子基因测序仪在无创产前基因检测（NIPT）等应用方向具备明显优势。GenoCare 1600的获批，意味着国产单分子基因测序技术临床诊断时代的开启。未来，真迈生物将与合作伙伴一起，共同推动单分子测序技术在临床诊断领域的应用，助力临床诊断水平提升和基因测序行业发展，为人类生命健康保驾护航，为健康中国建设贡献企业力量。

来自北京大学的研究人员报告称，他们开发出了一种基于乳液的扩增方法来抑制扩增偏移检测单细胞拷贝数变异(CNV)，同时以高精确度检测单核苷酸变异(SNV)。这一方法能够与各种扩增实验方案包括广泛使用的多重置换扩增(MDA)相兼容。这一重要的成果发布在9月4日的《美国国家科学院院刊》(PNAS)上。　　北京大学的谢晓亮(X. Sunney Xie) 教授及黄岩谊(Yanyi Huang)教授是这篇论文的共同通讯作者。　　谢晓亮教授是单分子生物物理化学和相干拉曼散射显微成像的开拓者之一，其研究组在离体实验及活细胞内生物系统在单分子水平的动力学研究方面取得了不少重要的成果，尤其是单分子荧光显微技术，比如相干拉曼显微成像技术(CARS、SRS)等方面成果斐然。近年来，他又在单细胞测序技术上取得突破，发表了不少重要成果。黄岩谊教授课题组主要致力于发展应用于集成生物学研究的新技术。　　过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。　　然而，一直以来的测序材料都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。　　另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。　　作为“在单个细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术能够解决上述难题。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。近年来单细胞基因组学揭示出了各种生物学过程，如肿瘤进化、胚胎发育和神经体细胞嵌合前所未有的细节。　　下一代测序的全基因组扩增(WGA)技术已被广泛应用生物学和医学领域用于确定单细胞基因组特征。WGA的高度均一性和保真度是精确测定CNVs和SNVs等基因组变异的必要条件。扩增产量沿基因组波动及SNV识别假阳性及假阴性结果限制了当前流行的WGA方法。　　在这篇新文章中研究人员报告称，他们开发出了一种乳液WGA (eWGA)方法来克服这些问题。他们将单细胞基因组DNA分到油溶液包裹的大量(105)微微升水滴中。每个水滴中只包含少量的DNA片段，在反乳化作用之前每个水滴便达到了DNA扩增的饱和，因此将片段间扩增的差异被降至最小程度。研究人员进而采用MDA对eWGA方法进行了原理证明。　　研究人员表示，这种容易操作的方法可实现在单个人类细胞中同时检测CNVs和SNVs，大大改善了扩增均一性和精确度。

近日，今是科技有限公司（简称 " 今是科技 "）宣布完成由广发信德和万原点基金联合投资的B+ 轮融资。所募集的资金将用于实现 Gseq500 中通量纳米孔基因测序仪的量产工作。今是科技成立于 2017 年，致力于开发并商用基于第四代（纳米孔）基因测序仪的测序全流程自动化解决方案，立志成为基因测序在临床广泛应用的推动者。公司基于 " 边合成边测序 " 技术路线研发的纳米孔测序仪及其配套全流程解决方案，可解决基因测序成本高、操作复杂、效率低，数据质量不佳的痛点，实现 " 让基因测序成为精准医疗的常规手段，提升人类健康水平 " 的公司愿景。公司于 2022 年 12 月发布了其首款中通量纳米孔基因测序仪产品 Gseq500 的 Alpha 机，计划于 2023 年上半年完成 Beta 测试、生产基地建立等量产准备工作，在下半年实现量产和销售，进入商业落地阶段。基于深厚的技术沉积与敏锐的市场洞察，今是科技预计在 2024 年将完成高通量测序仪 Gseq10K 的研发和产业化，解决测序环节的成本、数据质量、效率和适用范围问题，实现从核酸提取直至生信分析的测序全流程自动化，为基因测序行业提供完整、方便、快捷的测序解决方案。万原点基金创始合伙人姜傥教授表示：" 基因测序技术的出现对生命科学和医学发展起到了革命性的作用。自 Sanger's 技术以来，人们在追求测序结果高精度、高通量、长片段和低费用的道路上，持续不懈地努力着，各种创新、突破层出不穷。尤其是纳米孔测序技术，已经被认为是最有望实现上述黄金标准的技术之一。全球范围内相关专利申请高达 8800 件，技术发展呈线性增长趋势。目前纳米孔测序核心专利主要掌握在美、英、中三个国家。凭借技术优势和巨大的市场潜力，中国在这一领域是最有可能引领全球的。今是科技是国内领先的纳米孔测序仪及配套测序芯片研发生产商，其独特的底层测序原理决定了其可以真正实现单碱基信号读取，从而达到更高的测序准确度。超高通量测序芯片设计则保证了更有市场竞争力的测序成本。我们非常看好今是科技纳米孔测序平台未来在国内乃至全球长读长测序领域的市场竞争力和广阔应用前景。期待通过迪安的产业资源加持，助力今是科技未来更健康、更快速地发展。"广发信德李辰博士表示：" 广发信德一直关注和积极布局基因测序技术和上下游相关企业。今是科技采用的基于边合成边测序的蛋白纳米孔技术路线，具有读长长、高通量、测序数据质量高、建库简单等优点，有潜力应用于全基因组测序、全长转录组测序、单细胞测序、宏基因组测序、靶向测序（复杂区域和旁系同源区域）、甲基化测序等领域，我们期待今是科技的蛋白纳米孔测序仪成为下一代生命科学研发和临床应用的重要基础。"

近日，华大智造发布了最新款的中小通量基因测序仪DNBSEQ-G99。此次推出的DNBSEQ-G99又一次进行了全方位的突破性尝试，是全球同等通量测序仪中速度最快的机型之一，特别适用于靶向基因测序和小型基因组测序，数据产出速度快、质量高。与此同时，DNBSEQ-G99平台的性能优势也引发了业内的广泛关注，为了让大家能够更深入地了解G99，华大智造特别整理了G99最值得关注的9个热点话题，让我们一探究竟！Q1G99测序速度究竟有多快？在中小通量机型中，G99是唯一一款具备双载片测序平台的机型，这使得G99可以在一天之内满跑4张测序载片、两轮PE150，实测通量甚至最高可以达到99Gb，所以命名G99。通常来讲，G99可在12小时内完成PE150测序流程，从上机测序到下机数据只需半天时间。与此同时，G99支持多时点数据输出，最快可在测序开始后的2.5小时内获得第一批下机数据（SE35），是全球目前中小通量测序仪中速度最快的机型之一。Q2G99为何如此快？DNBSEQ-G99通过对载片、生化、流体、光学、温控等多个核心系统进行全面优化，实现了对测序效率、质量和交付能力的极致提升。围绕“DNBSEQ 测序技术”、“规则阵列芯片技术”、“测序仪光机电系统技术” 这三大源头性核心技术，华大智造G99平台的技术创新点的具体体现是：首先，在DNBSEQ测序技术方面，G99通过试剂优化首次达到了10s极速荧光反应，同时生化孵育进程由分钟级跨入秒级，全面降低单循环的测序时间；其次，在规则阵列芯片技术方面，G99的测序载片首次采用了三角形矩阵式信号位点，信号密度提升68%，在更小面积的载片上实现了更高密度的数据产出；最后，在光机电系统技术方面，G99通过对温控系统的升降温算法进行不断改进，最终实现升降温速率大于7℃/s，甚至比PCR仪还要快2倍；与此同时，G99配备了华大智造自研的超高分辨率物镜，突破了光学衍射极限，使得信号捕捉效率提升，缩短了单位面积的载片拍照时间，从而使得测序速度更快。Q3G99为何如此简单？DNBSEQ-G99配备了超简易的卡式测序载片和一体化的测序试剂盒，上机实验操作简单，无需手工配制试剂，一步按压即可完成测序试剂的配制。此外，通过生信计算的一体化集成，G99可实现对原始下机数据的自动分析和结果输出，同时支持测序数据的本地化产出，安全有保障。与此同时，DNBSEQ-G99提供行之有效的数据安全保护。Q4G99为何如此灵活？DNBSEQ-G99配备双载片测序平台，且双载片运行流程相互独立，能够让用户在一台测序仪上实现灵活的数据产出，支持单载片上机、双载片同时上机、双载片滚动上机，以及混合读长的双载片混动上机测序等多种测序模式，能够让测序实验人员可以根据样本数量和到样情况，通过调整上机运行的载片个数和测序策略，灵活掌控自己的工作节奏。Q5G99测序的数据质量如何？G99不仅拥有出色的测序速度，在数据质量方面的高准确性和高可靠性同样出色。根据华大智造的早期内测数据显示：在12台G99上对92个标准品进行了测试，下机数据质量Q30≥90%，数据产量＞80Mb/载片。通过对肿瘤Panel检测、未知病原体测序、小型基因组测序和甲基化测序等早期客户试用结果的评价来看：96%以上的下机数据质量Q30≥85%，数据产量＞80Mb/载片。Q6G99的应用场景及相关推荐？G99单张载片通量为80M，最多可同时运行两张载片。测序读长从SE35到PE150，G99的快速可以助力生育健康、传感染、肿瘤检测等临床科研的多种应用场景。Q7G99机型提供哪些型号？G99可以提供DNBSEQ-G99RS和DNBSEQ-G99ARS两种不同版本的型号，其中：① DNBSEQ-G99RS：无生信模块，下机能够稳定输出FASTQ报告，适用于有生信流程和分析集群的用户，这部分用户可以选择不含生信模块的标准配置版。② DNBSEQ-G99ARS：内置生信模块，能够自动启动高级分析，兼容基础的生信分析流程，如华大智造PFI，MetargetCOVID，MGAP，Flu track等。Q8G99适配的读长具体有哪些？目前，G99适配读长有SE50、SE100、PE100、PE150，涵盖SE100/PE50兼容试剂盒，APP-C PE150/ SE100试剂盒。此外，DNBSEQ-G99还有更长读长试剂的研发规划，将会在2023年发布PE300和SE400读长。Q9G99平台的兼容性与适配性如何？首先，在兼容性方面，DNBSEQ-G99对碱基不平衡文库具有优异的兼容性，与MGISEQ-2000的表现高度一致。其次，在适配性方面，G99平台开发了一体化的APP-C SE100和APP-C PE150试剂盒，可以进行转化测序，且引物序列已经内置在试剂盒中，无需手动加入。同时，测序人员若用常规试剂盒测双barcode，不需要和其他平台一样额外购买双barcode测序盒子。

基因测序仪是解码生命科学的利器，因其技术壁垒高、开发难度大，市场长期被少数几家跨国企业垄断。近些年，基因测序仪市场格局正在快速发生变化，涌现出许多新企业并纷纷推出自主研发的商品化测序仪。基于此，仪器信息网特别策划“ 基因测序仪新势力” (点击查看约稿详情 ）专题，并向测序技术研究专家、测序仪应用专家和基因测序仪企业广泛约稿（欢迎大家投稿，投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），充分了解基因测序新企业、新仪器、新技术及新应用进展。本篇为PacBio供稿。PacBio是一家生物技术公司，全称是Pacific Biosciences of California，成立于2004年，总部位于美国加利福尼亚州门洛帕克 (Ienlo Park)。PacBio核心技术是第三代单分子实时DNA测序技术；2021年收购Omniome，随后开始开发高度差异化短读台式测序仪；2022年10月，PacBio推出高精度短读长测序平台Onso；今年第二季度，Onso平台开始发货，近日，亚太首套Onso落地基因集团紫竹高新区测序实验室。下面跟随本篇内容，详细了解PacBio高精度短读长测序平台Onso。点击图片了解详情与近年来长读长测序技术的重大进步相比，传统短读长测序的核心边合成边测序 (SBS) 化学成分几乎没有发生任何变化。因此，许多研究计划和方法都受到这种旧技术的基础化学所造成的准确性限制。然而，PacBio 通过其独特的边结合边测序 (SBB) 技术核心的革命性新化学物质有能力彻底颠覆这些限制。什么是SBB测序？SBB 测序是一种 Q40+ 短读长测序技术，其工作原理是测量荧光标记的核苷酸与 DNA 链上的聚合酶结合（但未掺入）时发出的荧光信号。然后计算机将这些光信号与相应的核苷酸碱基识别相匹配。与其他短读长技术不同，SBB 将测序过程中的结合步骤和后续延伸步骤分开，从而消除了分子疤痕引入的错误。SBB测序也是由 DNA 链上的聚合酶启动，并在 3' 端带有可逆阻断剂，以防止其他碱基完全掺入这条不断增长的链中（步骤 1）。然后，在碱基识别阶段，荧光标记的碱基充满流动池。与传统的 SBS 测序不同，这些标记碱基不包含阻断剂。一旦适当的标记碱基与 DNA 链结合，就会发出荧光信号，并使用强大的光学器件进行测量（步骤 2）。与 SBS 测序的一个关键区别是，这种标记的核苷酸碱基不会并入 DNA 链中，而是在测序仪器捕获碱基信号后被洗掉。此后，通过去除可逆阻断剂来激活核苷酸的 3' 末端（步骤 3）。这确保了从充满流动池的未标记、封闭的核苷酸中掺入适当的碱基，从而阻止额外的掺入，直到下一个循环的适当时间为止（步骤 4）。Onso是PacBio推出的短读长测序平台PacBio基于SBB技术开发了Onso 短读长测序系统。它是一个可扩展且灵活的台式测序平台，通过其独特的SBB技术提供非凡的准确性。 Onso 系统具有较低的测序噪音，使研究人员能够以较低的测序深度就能发现以前遗漏的罕见变异。 Onso 系统提供的准确性将有助于推动微小残留病灶液体活检测试（MRD）、微生物群落抗生素耐药性监测、基因编辑实验中的脱靶分析以及许多其他需要高灵敏度测序的应用。由于SBB 测序在测序周期的每个阶段都使用优化的条件，所以相对于SBS测序，Onso平台拥有：极少的重复reads除了避免分子疤痕造成的测序错误累积之外，PacBio SBB测序的重复率比传统的短读长技术低得多。与重叠的读数不同，重复的序列不会为分析添加额外的信息价值，并且通常通过生物信息学在称为去重的过程中被过滤。由于 SBB 测序产生的冗余序列较少，因此重复数据过滤过程所浪费的数据和计算资源较少，从而使整体分析更加简化。极少的标签跳跃传统 SBS 测序使用的图案化流动池的扩增方法可能会导致部分独特索引在测序过程中在样品池之间交叉。这会导致数据中的噪声增加，这是由于一个样本的reads被错误地分配给另一个样本而引起的，而SBB测序不存在这个问题。更高水平的准确性通过消除分子疤痕、减少重复并最大限度地减少标签跳跃，SBB 测序可提供非凡的读取准确性，其错误率仅为万分之一或更少 (Q40+)，这是前所未有的。Q40是不是终点？来自Weill Cornell医学院的Chris Mason 博士说：“我们看到了Onso令人印象深刻的数据质量，远高于 Q30 的行业标准。我们已经进行了几次原始质量得分超过 Q50 的运行，这是我从未见过的情况。我们看到 Onso 的性能为医学研究和转化医学应用开辟了新的可能性，在这些应用中，准确性是成功的关键。”事实上，当使用改进的文库构建试剂和流程后，SBB测序能够达到Q50+水平的准确率。Onso测序平台参数

p　　中国首个应用于临床的第三代测序仪投产，有望把一个人的全基因测序成本从1000美元降至100美元，但仍需进一步完善相关技术。/pp　　7月31日，南方科技大学生物系80后教授、瀚海基因创始人贺建奎宣布，自主研发的第三代基因测序仪GenoCare正式投产，首笔订单达到700台测序仪。/pp　　21世纪经济报道记者独家获悉，该笔订单合同期三年，购买方包括国内外研究机构和医疗机构。目前测序仪已在科研市场应用，但投入临床市场所需的批文还在申报中。/pp　　贺建奎表示：“我们使用单分子测序，不需要扩增，并可大幅降低试剂消耗量，同时，所有试剂、仪器都在国内生产、集成和组装，成本因此降低，一个人的全基因组测序价格可降到100美元。”/pp　strong　截至目前，全球自主研发三代测序仪的企业只有三家，另外两家分别是美国Pacific Biosciences和英国Oxford Nanopore Technologies。/strong/pp　　过去的十余年里，三代测序主要在科研市场崭露头角，但因错误率高、成本高等原因始终未能进入临床市场，更谈不上产业化。/pp　　目前，基因测序市场的主流是二代测序，三代测序的样本量、数据量需要积累，中下游应用开发也刚起步。即便是应用相对广泛的二代测序，在各病种的覆盖率也不算高，三代测序的普及之路更为漫长。/ppstrong　　研发破壁 估值15亿/strong/pp　　瀚海基因已开始在罗湖莲塘工业园建设1万平米的第三代测序仪生产线，建成之后产能将达到每年1000台，产生50亿元价值。/pp　　“除团体订单外，我们的测序仪没有公开发售，价格还不能透露，”贺建奎表示，“目前已进入小批量试产阶段，年底生产线建好后可以大批量生产，年终可接受国内外医院、科研机构订单，到明年年初，群众就能用到三代测序服务了。”/pp　　深圳一名熟悉瀚海基因的投资机构合伙人告诉21世纪经济报道记者：“瀚海基因的技术是吸收后创新。”/pp　　记者了解，贺建奎在斯坦福大学的导师斯蒂芬· 奎克教授是一位拥有12家公司的企业家，也是世界上首个第三代单分子测序仪Helicos的发明人。资料显示，Helicos公司于2004年创办，并于2012年破产。/pp　　也是在2012年，贺建奎完成斯坦福大学博士后研究员的工作，回国入职南方科技大学，成为该校生物系第一位教师。同年，他创办了瀚海基因，启动国产三代测序仪研发。/pp　　起初行业内外对这一项目并不看好，瀚海基因前4年也一直没有销售收入，研发遭遇资金危机，两次险些关门倒闭。贺建奎直言：“一开始见了20多位风险投资人，无一例外都被拒绝，理由之一是当时还没有在职教授创业的例子。”/pp　　另外，测序仪研发难度非常大，国产三代测序仪更是首次尝试。贺建奎指出：“基因测序的样品前处理非常复杂，耗费时间、人力，还需要有后续的生物信息及专业人才。三代测序仪要把这些集成在一起，改变二代测序的半自动场景，测完自动完成生物信息学分析，难度不小。”/pp　　测序仪研发对人才要求很高，其涉及光学、流体、化学、分子生物学、生物信息学和精密机械等，需要多学科交叉知识和人才。/pp　　即便到了今天，瀚海对人才的渴求依旧跃然纸上。记者获悉，与生产线同时启动的是瀚海研究院计划，预计未来5年引入至少50名遗传解读分析专家以及50名医学专家(包括生殖、肿瘤、传染病等各学科)。/pp　　2015年，瀚海基因终于拿到第一笔大额融资——南京中正科技投资1700万元，同年，瀚海基因发布了GenoCare原理样机。此后，公司身价一路水涨船高，目前共获得5轮、2亿元风险投资，测序仪虽未真正走向市场，但估值已达15亿元。/pp　　深圳一名中小企业投资机构负责人告诉21世纪经济报道记者：“去年11月我们去看的时候，估值已经10亿元了，项目还很早期，对我们来说太贵，投不起。”/pp　　strong产业化起步 大幅降低成本/strong/pp　　采访过程中，贺建奎多次提到，降低临床基因测序成本，这也是二代测序仪的发力方向。/pp　　原中国科学院北京基因组研究所副所长于军指出：“第一代测序仪测一个人的基因组测序接近30亿美元，第二代降到1000美元，第三代使用单分子测序，不需要扩增，价格有望降到100美元。”业内将其称为摩尔定律，以说明价格急剧下降趋势。/pp　　翻看基因测序成长史，第一代测序技术主要基于Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。/pp　　第二代测序技术设备供应商主要是Illumina，业内普遍认为，其市场占有率达到70%。今年年初，Illumina公司宣布推出NovaSeq系列测序仪，据称，其简捷操作、低成本及灵活性有望将基因组测序成本降至100美元。/pp　　根据Illumina2017年第一季度财报，Illumina共收到135个NovaSeq测序仪订单。不过，中国科学院院士陈润生指出：“NovaSeq系列测序仪的使用窗口目前没有开放。”/pp　　国内基因企业也在通过技术合作、收购等方式破壁测序仪国产化。如Illumina和贝瑞和康、安诺优达开发了一款适用于无创产前检测的二代测序仪NextSeq CN500和NextSeq 550AR，并已获得CFDA批准。/pp　　华大基因通过收购的方式布局，先后推出三款国产二代测序仪。华大基因CEO尹烨此前向21世纪经济报道记者透露：“算上临床机构、科研机构和友商，国内应该已经超过两百多台我们的测序仪在‘服役’了。”/pp　　第三代测序技术原理最早发表于2003年，后来，Pacific Biosciences和Oxford Nanopore相继入局，Pacific Biosciences于2015年10月推出小型单分子测序仪Sequel。一名基因测序公司技术总监告诉记者：“中国市场目前唯一的三代测序仪就是这家公司提供，也是针对科研市场。”/pp　　英美测序仪的研发起步虽早，但进展一直缓慢，临床应用更谈不上。瀚海基因化学部副总监赵陆洋告诉21世纪经济报道记者：“三代测序仪很受科研市场欢迎，因其提供了RNA直接测序的可能性，这是二代测序做不到的。”/pp　　上述投资机构合伙人表示：“科研型测序仪对易用性、可靠性要求低一些，对可调节因素要求高一些，也不需要申请注册证。相比之下，临床市场的门槛高很多，空间也比较大。”/pp　　虽然瀚海基因对自己的测序仪信心满满，但在评价一款基因测序仪的三大核心指标：通量、读长、准确度方面，瀚海基因却三缄其口。/pp　　据贺建奎介绍，GenoCare第三代基因测序仪的核心技术为单分子荧光测序，此项技术使用全内反射荧光成像方法，能够检测单个荧光分子，无需PCR扩增。/pp　　资料显示，二代基因测序技术在上机测序前需要对样本进行PCR扩增，可以在试管里、在很短的时间内，将待测基因扩增50万倍乃至上百万倍，这能提高基因诊断的灵敏度，但带来问题是实验要求比较高，成本也居高不下。/pp　　同时，贺建奎团队联合中美两国科学家协作使用Genocare对大肠杆菌测序。数据结果显示，Genocare与测序行业龙头Illumina生产的MiSeq二代基因测序仪的一致性达到99.7%。/pp　　“预计明年年初会公开发售价格。临床实验也已经启动了，在走试验、申报流程。其他领域如科研市场不需要医疗器械证就可以使用，这些领域已经有我们的测序仪在应用了。”贺建奎说。/pp　　strong应用存短板核心部件依赖进口/strong/pp　　研发出三代测序仪后，瀚海基因一面要推动大批量生产，一面要开拓中下游。/pp　　目前，基因测序已形成了明确的产业链分工：上游为设备和耗材供应商 中游为第三方测序服务供应商，需依赖设备投入、运营管理与终端维护开发 下游为生物信息分析服务商。/pp　　贺建奎阐述了瀚海基因的商业模式：“中游的应用开发比如肿瘤基因检测、遗传基因检测、传染病检测，通过合作伙伴来完成。希望越来越多的测序服务公司和相关的机构在我们测序仪上开发各类疾病检测，形成生态圈，并且通过他们或者其他人把测序仪销售到医院。”/ppstrong　　上下游企业的互相“成全”，也是Illumina和华大基因成长的路子。/strong/pp　　前述投资机构合伙人指出：“华大基因向Illumina购买了100多台测序仪才成为第一，华大基因也通过这些测序仪开发出了很多服务。测序仪未来的销售量如何，可能要依靠整个行业，包括合作伙伴、临床以及科研机构有没有充分地把临床意义和科研意义发挥出来。”/pp　　记者在瀚海基因测序仪上市发布现场注意到，华大基因、北科生物、从事体外诊断的安图生物等都有相关负责人到场，这些都是瀚海的潜在合作伙伴。/pp　　不过，是否牵手瀚海基因还需要考量。一家生物技术公司产品部负责人告诉21世纪经济报道记者：“瀚海的测序仪一次只能测一个人的全基因组，Illumina的人数会多一点。另外，现在体外诊断主要还是对已知疾病的检测，瀚海基因主要是早期筛查，这虽然是趋势，但目前市场有限，二代测序也很早就在做了，样本和数据更多。”/ppstrong　　而更多的挑战还是来自老问题：错误率高。/strong/pp　　兴证医药研报指出，第三代基因测序单读长错误率依然偏高，在15%-40%，二代测序的错误率低于1%。前述中小企业投资机构负责人告诉记者：“单分子测序不需要切断DNA和RNA序列，看重对碱基对一下子读下去能读多长，而影响读长的一个是机器，一个是生物合成酶。”/pp　　广发证券也指出，单分子测序可收集到的信号非常弱，这对光电元件提出很高要求，虽然目前部分仪器已经实现商业化，但离理想状态还有较大距离。另外，还有测序通量不高、插入缺失错误等不足之处，这都影响了三代测序的推广。/pp　　值得一提的是，与其他国产测序仪一样，瀚海基因测序仪核心零部件依旧需要进口，例如光学系统中的部分核心器件来自日本、德国，测序芯片和微流控系统需来自新加坡、美国。/pp /p

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（下篇）前面描述了目前成熟的蛋白质测序方法，并对最流行的基于质谱的蛋白质测序方法进行了综述。非质谱依赖的蛋白质测序手段，除了几十年前发展的基于Edman降解法通过气相或液相色谱测序的方法，最近热门领域的方法主要包括基于荧光或纳米孔的单分子蛋白质测序，代表了未来的发展方向。基于纳米孔单分子蛋白质测序方法纳米孔测序（nanopore sequencing）法是借助电泳驱动力使待测单个分子逐一通过纳米孔，通过检测纳米孔截面的电流变化来实现对序列的测定。纳米孔测序最初在1996年被提出，通过膜通道检测多核苷酸序列，也就是单分子DNA的测序[1]。随着使用纳米孔对单分子DNA测序技术的逐渐成熟[2-5]，纳米孔技术也被应用在单分子蛋白质的鉴定上。对于DNA来说，其二级结构和电荷相对比较一致，它的聚合物比较容易处理，而且仅由四种碱基组成，单分子DNA测序比较简单。相比之下，蛋白质分子由20种氨基酸组成，并且蛋白的电荷和疏水性多变，还存在大量的二级和三级结构，因此基于纳米孔技术对蛋白质的鉴定要比DNA困难很多[6]。当前的基于纳米孔对蛋白质分析的主要探索方向是通过寡核苷酸适配子或抗体等亲和分子对纳米孔进行功能化，当蛋白质或肽段分子通过纳米孔时，由于不同氨基酸在纳米孔附近的结合或通过会引起不同幅度的电流变化，基于这些变化就可以确定氨基酸的种类，从而逐个得到所测蛋白质或肽段的序列信息（图1）。图 1 借助纳米孔的横向电流检测单分子蛋白质[2]牛津大学的Hagan Bayley[7]团队将单个α-血溶素蛋白孔插入两侧带有电极的膜中，磷酸化的蛋白质在DNA寡核苷酸的牵引下展开，并穿过纳米孔，通过记录纳米孔的电流变化区分出了202个磷酸化蛋白质的4种不同亚型，但无法鉴定蛋白质的一级结构。Francesco[8]团队将蛋白质或氨基酸吸附在金纳米星上，并施加电等离子体力将粒子推进并约束在金纳米孔内，利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了单分子表面增强拉曼散射（SERS）探测，用于检测氨基酸，并且可以分辨仅含有两个不同氨基酸的单个多肽分子抗利尿激素和催产素。Cao等[9]通过单个定点突变，在具有锥形识别位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）的纳米孔内腔中引入了甲硫氨酸，从而将该反应有目的的移植到了MspA纳米孔最尖锐的识别位点，并观测到了相应的单分子反应信号。该纳米孔可以引入更多的离子电流，从而放大检测信号，其狭窄的识别位点则提供了更高的空间分辨率，大大削弱了周围氨基酸的干扰，从而拓宽生物纳米孔的单分子检测功能，有望推进基于孔道的单分子蛋白质测序研究。Ouldali[10]研究团队研发出了一种新型气溶素纳米孔，此纳米孔借助将氨基酸附着在聚阳离子载体上，使氨基酸在纳米孔上停留时间变长，并检测其通过纳米孔时电流的变化，最终可识别出组成蛋白质的15种氨基酸，也能检测到组成蛋白质的其余5种氨基酸的电流变化，但是无法对其进行区分。虽然只是对氨基酸进行识别，但作者设想通过对蛋白或者肽段末端氨基酸逐个降解，利用纳米孔技术鉴定从末端释放出来的氨基酸，从而对蛋白质或肽段序列进行测定。Zhao[11]等将一对金属电极分隔在约2nm的孔洞旁，当氨基酸线性穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个回路，并反馈出相应的电信号，常见的20种氨基酸在通过纳米孔时都可以产生电信号。有的氨基酸需通过大约50种不同信号特征被鉴定，但绝大多数的氨基酸仅需要不到10个信号特征被鉴别。这种方法不仅能够高可信度的鉴定氨基酸，还能区分翻译后修饰的氨基酸（肌氨酸）及其前体（甘氨酸）、区分同分异构体的亮氨酸与异亮氨酸、区分对应对映异构体的氨基酸镜像分子L-天冬酰胺和D-天冬酰胺。此技术被应用于对两条由四个氨基酸组成的短肽（GGGG 和GGLL）进行测序，单分子短肽穿过纳米孔，孔道两边电极记录每个氨基酸通过时产生的电信号，通过测序算法，识别代表不同氨基酸的特征信号，从而得到短肽的序列。基于纳米孔单分子蛋白测序目前还属于初步发展阶段，除了需要根据电信号准确区分组成蛋白质的氨基酸以外，另一个关键是设计可一次拉动一个蛋白质或氨基酸穿过纳米孔的“马达”。为了让蛋白质或肽段顺利穿过纳米孔，研究者们在蛋白质一端添加了一串带有负电的氨基酸或者一段短DNA，用氨基酸或DNA链拉动蛋白质，可以使一些蛋白质打开折叠并顺利穿过纳米孔，但另一些复杂折叠的蛋白需要更多拉力，于是研究者在引导序列上添加了可以打开折叠的ClpX的识别位点[12]。这个系统能够将简单折叠的目标蛋白牵引过纳米孔，但对于折叠非常紧密的蛋白质仍要使用变性剂来打开折叠。基于纳米孔技术对单分子肽段或蛋白质测序目前还停留在对氨基酸鉴定和对短肽的区分阶段，还不能实际应用于对蛋白质的测序。虽然纳米孔测序具有高通量、对样品需求量少的优点，但是现有的纳米孔过大，失去了对氨基酸的区分能力，同时蛋白质分子通过孔道过快，加大了对信号读取难度；其次由于需要将蛋白的三级和二级结构破坏掉，纳米孔道需要能够耐受非常苛刻的化学和力学条件；第三，由于蛋白带电不均匀，控制其穿孔的速率也非常困难。所以目前的方法还不能准确的测得蛋白质的序列，基于纳米孔的单分子蛋白质测序技术还有很大的发展空间。基于荧光的单分子蛋白质测序方法基于荧光的单分子蛋白质测序同纳米孔测序一样，都可以对极少量蛋白质样品进行检测，其原理是先将蛋白质酶解成肽段，对肽段中特定氨基酸选择性标记不同的荧光基团[13]，对不同氨基酸上的荧光进行观察，从而确定肽段部分氨基酸序列，再将这些序列与蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白（图2）。图 2 基于荧光的单分子蛋白测序流程[14]。Ginkel[15] 和Yao [16]都利用ClpXP蛋白酶辅助对肽段进行选择性荧光标记，可对序列中的赖氨酸和半胱氨酸进行标记，通过Förster共振能量转移依次读出被标记的肽段的氨基酸的信号。Swaminathan[14] 将蛋白质酶解成肽段，再将肽段固载到玻璃片上[17]，使用特定荧光基团分别对肽段中的赖氨酸和半胱氨酸选择性标记，通过Edman降解技术对固载的肽段进行降解，每次降解后都使用全内反射荧光（TIPF）显微镜进行观测。如果被标记的赖氨酸和半胱氨酸在Edman降解中从肽段N端释放出来，被标记的以上两种氨基酸的位置就会被检测到。同时还发展了用于监测单个肽荧光强度的图像处理算法，并对误差源进行分类和建模，可以测得序列中部分氨基酸的信息。将测得的部分序列与参考蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白，通过与蛋白质组序列比对，可以鉴定到在人源蛋白质组中的绝大多数蛋白质。基于荧光单分子蛋白测序技术主要有三方面难点，一方面在于目前仅能对赖氨酸和半胱氨酸等几种氨基酸进行特异性荧光基团的标记，无法对所有氨基酸都进行标记；第二个难点是Edman降解是在强酸或强碱的环境中进行，对这些荧光基团的稳定性要求很高；第三个难点是对后期图像处理有较高的要求，如果序列中每个氨基酸都标记上不同的荧光基团，且发光峰易交叠难分辨，这给荧光处理算法带来了难度。因此，基于荧光的单分子蛋白测序技术虽然可以对极微量蛋白质样品分析，但目前仅能测得部分氨基酸序列，对蛋白质全序列的测定目前尚不能实现。[1] Kasianowicz J J, Brandin E, Branton D, et al. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(24): 13770-13773.[2] Branton D, Deamer D W, Marziali A, et al. The potential and challenges of nanopore sequencing [J]. Nanoscience and technology: A collection of reviews from Nature Journals, 2010: 261-268.[3] Laver T, Harrison J, O’neill P, et al. Assessing the performance of the oxford nanopore technologies minion [J]. Biomolecular detection and quantification, 2015, 3: 1-8.[4] Karlsson E, Lärkeryd A, Sjödin A, et al. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing [J]. Sci Rep, 2015, 5(1): 1-8.[5] Huang S, Romero-Ruiz M, Castell O K, et al. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array [J]. Nature nanotechnology, 2015, 10(11): 986-991.[6] Nivala J, Marks D B, Akeson M. Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 247-250.[7] Rosen C B, Rodriguez-Larrea D, Bayley H. Single-molecule site-specific detection of protein phosphorylation with a nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(2): 179.[8] Huang J, Mousavi M, Giovannini G, et al. Multiplexed Discrimination of Single Amino Acid Residues in Polypeptides in a Single SERS Hot Spot [J]. Angewandte Chemie 2020, 59(28): 11423-11431.[9] Cao J, Jia W, Zhang J, et al. Giant single molecule chemistry events observed from a tetrachloroaurate (III) embedded Mycobacterium smegmatis porin A nanopore [J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-11.[10] Ouldali H, Sarthak K, Ensslen T, et al. Electrical recognition of the twenty proteinogenic amino acids using an aerolysin nanopore [J]. Nat Biotechnol, 2020, 38(2): 176-181.[11] Zhao Y, Ashcroft B, Zhang P, et al. Single-molecule spectroscopy of amino acids and peptides by recognition tunnelling [J]. Nature nanotechnology, 2014, 9(6): 466-473.[12] Nivala J, Mulroney L, Luan Q, et al. Unfolding and Translocation of Proteins Through an Alpha-Hemolysin Nanopore by ClpXP [M]. Nanopore Technology. Springer. 2021: 145-155.[13] Hernandez E T, Swaminathan J, Marcotte E M, et al. Solution-phase and solid-phase sequential, selective modification of side chains in KDYWEC and KDYWE as models for usage in single-molecule protein sequencing [J]. New J Chem, 2017: 462-469.[14] Swaminathan J, Boulgakov A, Hernandez E, et al. Highly parallel single-molecule identification of proteins in zeptomole-scale mixtures [J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(11): 1076-1082.[15] Ginkel J V, Filius M, Szczepaniak M, et al. Single-molecule peptide fingerprinting [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(13): 3338-3343.[16] Yao Y, Docter M, Ginkel J V, et al. Single-molecule protein sequencing through fingerprinting: computational assessment [J]. Phys Biol, 2015, 12(5): 055033.[17] Howard C, Floyd B, Bardo A, et al. Solid-Phase Peptide Capture and Release for Bulk and Single-Molecule Proteomics [J]. ACS Chem Biol, 2020, 15(6): 1401-1407.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn ）。

前不久，纳米孔技术的一项重要突破在《科学》期刊发表，引起业内关注。在这项研究中，科学家们首次展示了，使用纳米孔技术不仅可以测出DNA分子的碱基序列，还可以直接读出蛋白质分子的氨基酸序列。短短一个月不到，纳米孔技术领域的科学家又带来一项突破性的进展。研究人员以“从头设计”（de-novo）的方式，也就是通过人为设计氨基酸排列，合成出一种人造纳米孔。这种人造纳米孔可以稳定组装在双层脂质膜中，根据应用目的调整孔径的大小，服务于检测DNA和蛋白质分子的需求。研究成果日前发表在《自然-纳米技术》（Nature Nanotechnology）期刊上。“纳米孔传感技术是一种强大的工具，无需标记就可进行单分子检测。”该研究通讯作者、东京农业技术大学（Tokyo University of Agriculture and Technology）的Ryuji Kawano教授指出，“这是首次用从头设计的纳米孔检测DNA和多肽分子。”生物纳米孔技术通常以天然成孔蛋白为基础，成孔蛋白形成的通道可供DNA长链或多肽链分子穿过，由于碱基或氨基酸的不同，会产生相应的电流变化，仪器通过识别电信号的变化，就可以推断出通过纳米孔的碱基或氨基酸顺序。根据纳米孔测序的这个基本原理，不难看出通道的孔径大小和化学性质，对适用于检测什么分子是重要的限制。相比有限的天然成孔蛋白，研究人员决定“无中生有”地设计人工蛋白纳米孔，既能模拟天然蛋白的性质，又能更好地满足检测蛋白质分子的需求。▲SV28的氨基酸序列和它形成的发卡结构（图片来源：参考资料[1]）为此，这支研究团队设计并合成了一种自然界原本不存在的肽，由28个氨基酸组成，命名为SV28。这种肽经过弯折，形成一个发卡结构，插入脂质膜。用SV28组装成的纳米孔结构，可以形成几种不同的孔径，从1.7纳米到6.3纳米，适用于检测DNA分子。研究人员介绍，对SV28的氨基酸进行微调，还可以改变它的弯折方式，由此组装形成均匀分散的孔道，每个孔径1.7纳米，适用于检测单根多肽链。接下来，研究团队还计划设计和构建更多类型的纳米孔，助力蛋白质测序、制造分子机器人等。▲“从头设计”的人工纳米孔效果图（图片来源：参考资料[2]；Credit: Ryuji Kawano/Tokyo University of Agriculture and Technology）研究人员指出，之所以他们要以“从头设计”方式构建的人工纳米孔，一个重要目标就是希望制造出分子机器，用于更广泛地检测不同类型的分子，尤其是用于阐明蛋白质结构和功能的关系。“蛋白质的折叠结构取决于多肽的线性序列，并产生了蛋白质的特定功能。”Kawano教授说道，“独特的氨基酸序列，来自结构的演变，包括氨基酸残基随时间产生的突变和选择。揭示出序列信息与蛋白质结构之间的关系是科学的最终目标之一。”参考资料：[1] Shimizu, K. et al., (2021) De novo design of a nanopore for single-molecule detection that incorporates a β-hairpin peptide. Nature Nanotechnology. Doi: https://doi.org/10.1038/s41565-021-01008-w[2] For the first time, DNA and proteins sensed by de novo-designed nanopore. Retrieved Nov. 25, 2021 from https://www.eurekalert.org/news-releases/935907

据统计，中国每4秒就有一个1个新生儿出生，对应这个数字，中国孕妇是一个十分庞大的群体。多年前，为了防止新生儿出生缺陷，准妈妈们选择羊水穿刺的方式进行产前检查，但是这种方式准确率较低，且存在10%的流产风险，这令不少家庭望而却步，而如今依托于基因检测技术的无痛产检得到越来越多人的追捧。　　目前将基因测序技术商业化比较成功的企业有Illumina、Life Technologies(现被Thermo收购)以及中国的华大基因等。随着基因技术的飞跃发展，检测技术成本大幅下降，新一代基因测序技术的应用范围正在迅速拓展，基因测序市场上将谁主沉浮?　　测序技术飞速发展　　现在国际范围内，各种基因测序主流技术采取的原理各有不同，新一代测序技术特点主要是序列短(30&mdash 150bp)、但是检测通量大(从开始的几百Mb到目前的1Tb以上的通量)、检测周期灵活(几个小时到几天)。正是因为通量高，所以测序的价格已经是第一代测序的万分之一，甚至更低。最早做一个人类基因组测序需要30亿美元，现在测序成本只需要1000美元。　　基因测序领域经过多年的发展，产业脉络已经逐渐清晰。早期测序技术目前硕果仅存的是Life Technologies，这家公司在去年刚刚被Thermo Fisher并购。此后出现的454(罗氏)，SBL(Life Technologies的SOLiD)，以及Helicos等早期出现的技术和公司，或因为技术问题，或因为市场问题、比如被Illumina等强势竞争者的打压，破产的破产，没破产的也基本退出了市场。目前硕果仅存的除了Illumina，只有Complete Genomics(CG)以及Life Technologies的Ion技术。　　三分格局被打破　　由于发展较早，再加上快速降价、挤压对手的利润、以及成立以低价为旗号对下游服务商组织商业联盟等商业手段操作，Illumina成功挤压打垮了一系列竞争对手，成为目前全球最大的基因测序设备供应商。目前Illumina已经开始限制其试剂仪器的使用范围，以保护自己下游应用开发的红利。同时在中国，Illumina也在扶持少数的下游服务商，直接进入服务市场，甚至和自己的测序仪客户竞争，从而实现最大程度控制市场的目的。　　第二个主力公司是Life Technologies。它的Ion Torrent测序技术由于摆脱了常规的光学检测，另辟蹊径，使用半导体检测链聚合反应过程中的质子释放的信号，所以具有快速(4个小时完成测序)、仪器结构简单、小巧、造价便宜的优点。不过，由于整个技术设备市场基本被Illumina占有，所以短时间内Life Technologies凭借其技术特点在市场有一定的优势，但未能形成与Illumina的平等竞争态势。　　在两大主要公司之外，还有一个在基因业界人士看来都有些神秘的CG公司。如果要定位的话，CG可以说是一个测序市场的搅局者，正是由于其平台具有比Illumina更高的通量和更准确质量的特点，在数年前，曾和Illumina在人类全基因组重测序市场上形成制衡并分庭抗礼，带动了测序标准的提高、以及测序价格的显著下降。　　但是CG毕竟是一个初创公司，在商业运作、市场渠道等方面远远比不上具有十足市场优势的Illumina。随着Illumina在市场和各种法律纠纷干扰手段的操作下，CG陷入困境。而迫于Illumina与自己下游竞争和不断提价的商业压力，我国的华大基因利用了这一机会，于2013年并购了CG公司。凭借此次收购，华大基因一举占领了基因测序的上游，并同Illumina、Life Technologies一起奠定了继续测序市场的新格局。不仅如此，凭借自身完整的产学研一体化的布局，华大基因相比前两者更具优势。　　华大的技术王牌　　不过值得注意的是，目前全世界只有前面提到的三家完整拥有测序技术核心知识产权的公司&mdash &mdash Illumina、Life Technologies、华大基因。而且三家公司本身都是通过收购来实现，Illumina收购了Solexa, Life Technologies收购了Ion Torrent,而华大收购了CG 其余的授权或者所谓做出了测序仪的国内公司都会在真实应用的技术、成本和商务层面受较大限制。　　华大在并购完成之后，保留了CG在硅谷的研发团队，并将团队规模扩大了一倍，同时结合中国本土的经验丰富的研发团队共同合作，已经开发出将投入产业化应用的临床测序技术BGISEQ-1000和BGISEQ-100。　　新产品大大简化了样品处理的流程，缩短了整个周期，优化了生物云平台，做到一键式、傻瓜式、大数据库支持，能够进入任何一家医院而不需要任何前期测序基础。在临床产品的精度、可重现性和稳定性方面比市面已有技术提高几个数量级，达到99.999%以上的碱基准确性。　　可以说，CG的技术是非常稳定可靠的，有多篇顶尖的文献可以证明，这一点是华大基因收购CG的重要原因。CG之前的不成功，主要是差在商业模式而不是技术。而在基因测序这一高科技领域，&ldquo 技术为王&rdquo 依旧是一个硬道理，这或许也是华大基因和CG最强大的竞争资本之一。

基因测序仪是解码生命科学的利器，因其技术壁垒高、开发难度大，市场长期被少数几家跨国企业垄断。近些年，基因测序仪市场格局正在快速发生变化，涌现出许多新企业并纷纷推出自主研发的商品化测序仪。基于此，仪器信息网特别策划“基因测序仪新势力”(点击查看约稿详情）专题，并向测序技术研究专家、测序仪应用专家和基因测序仪企业广泛约稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），充分了解基因测序新企业、新仪器、新技术及新应用进展。本文将介绍测序仪新星企业Element Biosciences的Avidity（亲和力）测序技术。新一代测序，英文原文为Next Generation Sequencing，也常被简称为NGS测序，从技术的角度，通常是指一类通过将模版片段化之后进行扩增，然后进行大规模并行测序的技术。与其他测序技术相比，它可以显著提高测序通量，并大幅降低测序成本，所以也通常被称作高通量测序技术。NGS技术沿革自2005年454公司推出第一个商业化的高通量测序平台以来，高通量测序技术经历了长足的发展，应用范围也越来越广泛。454公司的测序平台基于焦磷酸（Pyrosequencing）测序技术，于2005年开始商业化发布，后该公司被罗氏（Roche）公司收购，但后续由于测序成本居高不下、操作复杂及精度的问题，目前已经停产。继罗氏454之后，Solexa公司也于2006年推出了基于边合成边测序（sequence by synthesis, SBS）的测序仪Genome Analyzer，后被美国Illumina公司收购。基于SBS原理的Illumina测序仪是目前全球市场占有率最高的测序平台。与Solexa同期的还有Applied Biosystems从Agencourt公司收购的基于SOLiD技术（Sequence By Oligo Ligation and Detection）的测序仪，后基于SOLiD技术的测序仪也因操作过于复杂，以及性能和价格缺乏竞争力而最终停产。Applied Biosystems被Invitrogen公司收购后组成的Life Technologies。2010年，Life Technologies又通过收购Ion Torrent继续在测序市场占有一席之地。2013年，ThermoFisher赛默飞收购Life Technologies。Ion Torrent测序平台的原理类似于焦磷酸测序，但它检测的不是焦磷酸，而是反应同时释放的氢离子。与罗氏454类似，Ion Torrent存在操作复杂、重复碱基读取精度受限、通量提升困难、测序成本过高的问题，虽然依托于赛默飞的支持与销售网络仍旧在测序市场占有一席之地，但由于技术限制，已经远非主流平台，有逐步淡出二代测序市场的趋势。目前，国内市场还有众多国产NGS平台先后面市，绝大部分均基于SBS的测序原理。Avidity（亲和力）测序技术引人注目随着技术的发展以及测序应用边界的不断拓展，近1-2年来也涌现出了更多新的测序技术，其中最引人注目的是Element Biosciences的Avidity（亲和力）测序技术。与SBS不同，亲和力测序的关键创新在于，它将检测掺入的核苷酸与延伸DNA模板分离开来。分离步骤可使每个过程独立优化，使得基于亲和力测序技术的Element AVITI系统成为成本更低、精度更高的DNA测序系统。多年以来，大家使用的测序仪基本的数据质量停留在Q30的标准，即碱基解读的准确性为99.9%，而亲和力测序可将测序质量提升到Q40（99.99%）标准，错误率降低近10倍！这无疑为测序行业带来了新的可能，有望重新塑造行业精度的标准。简单介绍下它的工作原理：PCR-Free的Polony生成亲和力测序可以兼容目前市场上的大部分建库试剂盒，可直接用线性文库加载到流动槽上，在流动槽表面捕获它们之后，仪器将自动将线性文库环化，然后模板的克隆拷贝通过环状循环扩增（RCA）来生成polonies，其中模板的多个拷贝存在于单个DNA多联体模版中。仅从原始模板复制还具有额外的好处，可以消除DNA测序中的一个重要错误来源——PCR。两份工作，两个步骤任何基于聚合酶的DNA测序方法都必须完成两项工作：• 检测核苷酸结合事件• 将DNA模版延伸到下一个位置SBS测序将这两个步骤锁定在一起。当一个染料标记的、带有阻断基团的核苷酸被添加到生长中的互补链中时，也同时完成了延伸步骤。共价结合为成像步骤产生持久的信号，但需要微摩尔试剂浓度来驱动反应在合理的时间范围内完成。通过亲和力测序，Element科学家发明了一种方法，通过分离这两个步骤，仅使用纳摩尔试剂浓度就可以创建稳定的复合物进行成像。亲和子(Avidites)：低试剂成本和高数据准确性的关键亲和力是指多个非共价结合相互作用的相加强度，当多价配体与底物内的多个位点结合时，可以实现这种强度。亲和子分子重新构想了核苷酸是如何传递到聚合酶复合物中的，并利用了这一特性。它们是带有多个相同核苷酸的染料标记聚合物。在DNA聚合酶的存在下，亲和子分子在每个polony内与模板的多个拷贝形成高度稳定的复合物。亲和子分子与DNA聚合酶复合物的结合率与染料标记的单价核苷酸的结合率相似，但与单价核苷酸不同，即使在纳摩尔浓度下，在足够成像所需的1分钟时间尺度上也没有观察到解离。成像后，亲和子被移去，然后使用工程聚合酶和带有阻断基团、未标记的核苷酸延伸模版。图1显示了完整的亲和力测序周期。图1：Avidity（亲和力）测序除了能够降低试剂浓度（从而降低运行成本）外，亲和力测序比SBS更准确，在均聚物区域尤其具有优势（图2）。较高的准确性可能是几个因素的结果：• 使用工程高保真聚合酶• 多个核苷酸在单个亲和子上的协同结合，以确保只有正确的同源亲和子与polony结合• Polony内的非同期延伸的DNA拷贝由于缺乏其他非同期延伸的邻体作为亲合力底物，从而在结合上处于劣势图2：AVITI和NovaSeq在长度为12或更高的同源聚合物之前和之后读取的错配百分比。详细阐述亲和力测序原理和性能的文章发表在《Nature Biotechnology》上，可以参考原文，了解具体细节： https://www.nature.com/articles/s41587-023-01750-7 一项具有待开发潜力的新技术不同于已经发展了20多年且逐渐达到技术边界的SBS技术，亲和力测序是一项新技术，亲和子的模块化设计创造了多个独立的改进空间，使得这项技术具有更加广阔的潜力。聚合物核心、染料的数量和选择以及核苷酸连接体的长度和结构都可以并行优化，以增强信号、减少循环时间、降低试剂浓度，或调整测序反应的其他参数，以更好地适应不同的应用。根据其目前数据结果，相对SBS技术，它已经可以带来以下技术层面的提升：• 数据精度更高，可将数据质量从SBS测序的Q30（99.9%准确性）提升至Q40（99.99%），从而减少后续false candidates验证的压力• 显著降低SBS过程中PCR步骤所引入的duplication的比例，有效提升有效数据量，减少浪费• 大幅提升的2x300 bp读长的测序精度• 对于低diversity文库，比如甲基化测序，可以不添加平衡文库或仅需很少量的平衡文库即可进行测序• 兼具低成本和灵活通量两个特性，有多种可选flowcell以适应不同应用，无需凑样即可轻松开机，同时享受和外送工厂级测序服务接近的价格• 可兼容long-insert文库，从而提升变异recall比率• 对于基因组困难区域进行测序的能力，比如极大提升了重复连续碱基区域测序的精度，克服了SBS存在的问题Google AI DeepVariant的Andrew Carroll及其团队近期分享了使用Element Biosciences最新CloudBreak化学试剂的数据分析结果。具体信息可以参考原文：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.11.553043v1 Element AVITI测序仪的出现，不仅将测序质量带到了Q40的新标准，同时还解决了以往测序工作中存在的众多困难。同时，它可以台式平台的仪器，提供可以和高通量测序仪接近的测序成本，更是解决了目前困扰众多研究者的台式测序仪测序成本高昂的问题。测序性能的全面提升，由测序原理决定的试剂量节省而带来的测序成本的降低，这些都使得Element Biosciences成为有望颠覆目前测试市场格局的新品牌。今年9月，自AVITI推出后一年左右的时间，Element Biosciences宣布全球已经获得了超过100台订单，相信后续会看到越来越多提升测序性能为研究所带来的改变和新可能。

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)?/span/pp　　一句话说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "基因测序/span/a(Single Cell Sequencing)，认为该技术将改变a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "生物界和医学界/span/a的许多领域。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "我们为什么要进行单细胞基因测序?/span/pp　　传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。/pp　　在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。/pp　　关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将详细解读单细胞基因测序，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。/pp　　strong一、单细胞基因测序行业：刚启程，面临引爆点/strong/pp　　BCC Research的一项分析报告指出，2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，复合增长率达21%。根据GENReports的报告，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。/pp style="text-align: center "　　图2：单细胞分析的文章发表数量/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/006c9fd7-a2cd-46b2-a028-18b51b5ea3cd.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：GEN，民生证券研究院/pp　　其中，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。/pp　　和qPCR在90年代的发展一样，目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，单细胞基因测序行业正面临引爆点。/pp　strong　二、单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析/strong/pp　　单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。/pp style="text-align: center "　　图3：单细胞测序的步骤/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/782ee757-3c06-4a1b-9103-4c7336ac2929.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Recent advances and current issues in single-cell/pp style="text-align: center "sequencing of tumors，民生证券研究院/pp　　2.1 单细胞的捕捉和分离/pp　　单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。/pp style="text-align: center "　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/ea66e087-c9b2-4930-a4d3-50025543fe8b.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生证券研究院/pp　　1)流式细胞术 (Flow Cytometry)/pp　　是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。在各种流式细胞仪中，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后，加入样品管中，经过测量区，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析 分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。/pp　　2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM)/pp　　LCM技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。/pp　　3)微流控技术(Microfluidics)/pp　　微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。微流控芯片是实施该技术的平台，通常通过细微的管道对液体实施操控，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。/pp　　2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，WTA)：单细胞测序的难点/pp　　2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势/pp　　由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA) 和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。/pp　　1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)/pp　　DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3& #8242 -ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5& #8242 ；主要 利用3& #8242 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。/pp　　2)多重置换扩增(MDA)/pp　　MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。/pp style="text-align: center "　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介/pp style="text-align: center "img title="4.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/d9b0aef0-e3b1-4c63-8313-c20796064bb3.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell genome sequencing: current state/pp style="text-align: center "of the science，民生证券研究院/pp　　3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环/pp　　通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。/pp style="text-align: center "　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图/pp style="text-align: center "img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/83e2f828-d990-4b9c-afd6-bd692fc52888.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生证券研究院/pp　　表1：三种类型的全基因组扩增方式比较/pp style="text-align: center "img width="600" height="302" title="QQ截图20160302115018.jpg" style="width: 600px height: 302px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/297e4e6e-a134-4101-a297-456cd703c3af.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future，/pp style="text-align: center "民生证券研究院/pp　　Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al., (2015)更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。/pp　　2.2.2 全转录组扩增/pp　　一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。/pp　　单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，改进的PCR，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。/pp　　三. 单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域/pp　　当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。/pp　　3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗/pp　　首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。/pp style="text-align: center "　　图7：肿瘤的异质性/pp style="text-align: center "img title="6.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/88b49609-3a47-4577-ad2a-7e9b36b6a4dc.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Illumina，民生证券研究院/pp　　实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。/pp　　而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。/pp　　例如，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，覆盖度大约6%，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。/pp　　除了肿瘤细胞，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。/pp　　3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖/pp　　PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常 PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，关于PGS/PGD的介绍，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。/pp　　PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体 2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞) 3)培养第5天左右的囊胚细胞。/pp　　例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。/pp style="text-align: center "　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程/pp style="text-align: center "img title="7.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/a1c2724b-0f2c-4b27-9eca-d304dccd613c.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生证券研究院/pp style="text-align: center "　　(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体)/pp　　3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门/pp　　用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。/pp　　图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。TCR & #945 和& #946 mRNA经过逆转录，扩增，重叠延伸，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。/pp style="text-align: center "　　图9：TCR Sequencing过程/pp style="text-align: center "img title="8.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/04e7c357-80bd-4709-89dc-92ee07a28fa9.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，/pp style="text-align: center "Illumina，民生证券研究院/pp　　四. 单细胞基因测序未来的发展之路/pp　　在目前来看，单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。Illumina也通过和Clontech合作，推出了单细胞RNA测序服务。/pp　　我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。/pp　　背景案例：/pp　　2016年1月，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor & #945 和& #946 链的基因的复杂性。/pp　　图：Juno收购AbVitro之后的布局/pp style="text-align: center "img title="9.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/6ef1eca1-dc46-4600-9c6d-d95f77a85f9e.jpg"//p

p style="LINE-HEIGHT: 1.75em" DNA测序能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，同时可以帮助患者精准治疗。但目前的DNA测序技术，昂贵的价格让普通大众望其项背。寻找低成本、快速的DNA测序技术，成为科学家们研究的热点，生物纳米孔单分子分析技术因其低成本、快速和无需荧光标记等优点被视为最具前景的DNA测序技术之一。/pp style="LINE-HEIGHT: 1.75em"　　近期，华东理工大学化学与分子工程学院的龙亿涛科研团队在生物纳米孔超灵敏单核苷酸分辨领域取得独创性突破，该研究成果以华东理工大学作为独立研究单位，于4月25日在《Nature Nanotechnology》(自然-纳米技术)发表了题为“Discrimination of oligonucleotides of different lengths with a wild-type aerolysin nanopore”的研究论文。/pp style="LINE-HEIGHT: 1.75em"　　生物纳米孔单分子分析技术的原理是通过电场力驱动单链DNA穿过纳米尺寸的孔道，由于不同的脱氧核苷酸通过纳米孔道时产生了不同阻断程度和阻断时间的电流信号，由此可根据电流信号读出每条DNA序列上的碱基信息。但在实际实验过程中，单链DNA穿过纳米孔的速度极快(约1微秒/碱基)，造成了的电流阻断信号极小(皮安级)，阻碍了纳米孔测序技术发展。/pp style="LINE-HEIGHT: 1.75em"　　基于自主研制的超低电流检测装置，龙亿涛课题组首次使用野生型且无任何修饰的Aerolysin(气单胞菌溶素)生物孔，将单链DNA的过孔速度降低了三个数量级(2.0毫秒/碱基)，从而极大地提高了电流检测的灵敏度，完成了对仅有单个碱基差异DNA分子的超灵敏识别，并实现了混合复杂体系的超灵敏检测和核酸外切酶“分步降解”单链DNA过程的实时观测。此外，该研究还通过改变检测体系的酸碱度，调节了气单胞菌溶素孔道内腔的电荷分布，同时结合单链DNA在孔内有效电荷数的计算，获得了纳米孔表/界面上电荷的分布信息，促进了对DNA与气单胞菌溶素孔道内腔表面氨基酸残基相互作用的深入理解。/pp style="LINE-HEIGHT: 1.75em"　　据介绍，气单胞菌溶素来源于嗜水气单胞菌，主要存在于水生环境包括海水、湖泊、蓄水池和供水系统中，是一种天然的纳米蛋白孔，具有成本低、简单易得的特点。早在2006年，龙亿涛教授就发现气单胞菌溶素能够作为一种纳米蛋白孔，并具有实现高灵敏单分子检测的潜力。该论文的第一作者曹婵，于2011年进入龙亿涛课题组以来一直从事生物纳米孔的相关研究，通过大量的实验尝试和经验积累，实现了气单胞菌溶素纳米通道的成功制备和单分子信号的获取。/pp style="LINE-HEIGHT: 1.75em"　　“这一独创性研究成果不仅进一步降低纳米孔单碱基分辨的成本，同时也将大大提高纳米孔DNA测序的精确度。”据龙亿涛介绍，未来，结合高带宽低噪音的电流检测仪器，气单胞菌溶素纳米孔有望实现单碱基直接分辨以及对DNA损伤的检测，这将大大推动DNA测序技术以及个性化医疗的发展。/ppbr//p

p style="text-align: center "　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/aab48e25-87ad-48f7-bf9a-b2ebac0fa992.jpg" title="蛋白.jpg" alt="蛋白.jpg" style="text-align: center width: 522px height: 348px " width="522" height="348"//pp style="text-indent: 2em "蛋白质是生物功能的主要载体。许多无法从基因层面解释的疾病，蛋白质可以给出我们想要的答案，为此，蛋白质组学应运而生。科学家们预测，随着人类基因组测序工作的完成，21世纪生命科学的研究重心或将从基因组学转移到蛋白质组学。蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的核心内容，想要深入了解蛋白质，进一步认识生命活动和疾病发生的分子机制，首先要有合适的蛋白质测序技术做支撑。为完善蛋白质测序技术科学家做出了许多尝试，如Edman降解，荧光染色、质谱测序等。然而已有的测序方法都存在各种技术不足与应用局限性，不利于蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用推广。br//pp　　近日，strong瑞士苏黎世联邦理工学院分子生物学研究所的Ben C Collins博士和Ruedi Aebersold博士在Nature Biotechnology发表了蛋白组学平行测序的评论文章“Proteomics goes parallel”/strong，小编将文章进行了翻译整理分享给大家。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/29198ff0-12dc-4a8b-9f43-a535e065d874.jpg" title="1.png" alt="1.png"//pp style="text-indent: 2em "目前，蛋白质组测序技术尚不如基因组学和转录组学那么强大。核酸测序技术的表现之所以令人印象深刻，是因为它能利用荧光作为读数进行短寡核苷酸的大规模平行测序。在这个问题上，strongSwaminathan等证明了肽类也可以进行平行荧光测序/strong。他们的创新方法将经典的蛋白质测序技术与核酸光学测序系统进行了整合。虽然该方法仍需进一步优化，但这让我们看到了一种普遍可行、可靠和真正通用的蛋白组学测序技术的发展前景。/pp　　蛋白质对于生命系统来说是必不可少的，它们可以作为化学催化剂、结构成分以及生理过程的媒介，能够准确识别和量化蛋白质的研究技术可极大地促进人们对生物学的理解。如今，蛋白质组已经可以由转录组被预测或推断出来。有充分的研究证据表明，蛋白质与mRNA水平之间的联系是复杂的，通过一种组学来预测另一种是不精确、不可靠的。那么，strong为什么在许多情况下，人们会优先选择通过mRNA预测蛋白，而不是直接进行蛋白质测序呢/strong?答案在于两种组学测序技术的发展和物质本身的可检测性。目前，生物学家可以通过已有的核心技术和商业公司获得基本完整的转录组信息及分析结果，而蛋白组分析仍只限于专业实验室研究使用，在通量、稳定性和重现性方面还不能达到转录组分析水平。/pp　　第一代DNA测序仪绘制了具有突破性意义的基因组图谱，其原理是对分离DNA片段进行连续测序。尽管该仪器采用了自动化技术，但整个测序过程也是缓慢而昂贵的。只有开发可平行测序数百万个核酸片段，能够高通量、高覆盖率、低成本生成完整基因组图谱的方法，才能进行广泛的基因组分析。这些具有商业价值的测序技术已经改变了生物医学研究，并成为实验生物学研究的中流砥柱。/pp　　虽然“自上而下”的蛋白质组学研究方法正在逐步发展，但传统的蛋白质定量和测序仍是采用“自下而上”的方法进行。正如基因测序原理一样，这些方法是通过检测酶促反应切割蛋白质产生的肽链，以分析蛋白组成。在20世纪50年代，Pehr Edman发明了一种通过循环化学反应测定肽链氨基酸序列的方法，被称为Edman降解。该方法通过异硫氰酸苯酯与可接近的氨基偶联，然后从肽链的N-末端释放氨基酸并生成新N端，不断重复这一过程，对释放的氨基酸进行鉴定就可以得到肽链的氨基酸序列。strongEdman降解过程缓慢，需要大量的高纯度肽/strong，尽管如此，直到20世纪90年代早期，所有已知的蛋白质序列都是使用该方法确定的。/pp　　20世纪90年代，随着质谱(MS)技术逐渐成为蛋白质测序的首选方法，Edman降解在该领域退居二线。质谱是通过检测质荷比和肽段的断裂模式来推断蛋白质组成和定量。因具有先进、强大和多样化特点，MS已经被广泛应用。仿效基因组学技术的发展路径，MS已经从特定寡聚体的人工测序发展到高通量的肽链自动测序，并发展到通过独立数据分析进行多肽的平行测序，如SWATH-MS。虽然这些方法的通量、准确性和重现性都很出色，但想要与基因组分析一样，实现相似的大样本队列常规、完整的蛋白质组量化目标仍难以实现。/pp　　随着当前数据独立采集MS检测系统的不断发展，最终取得与基因组学研究技术相似性能的蛋白测序技术也有可能实现。此外，要深入了解蛋白质组的复杂性，也需要颠覆性的新技术。虽然蛋白质的纳米孔测序技术显示了很好的发展前景，但StimaaNet等研发的肽荧光测序方法有着明确的常规应用途径，可以看作是这类颠覆性技术最先进的一个例子。strong肽荧光测序方法堪称跨越时代的结合，它将几乎被遗忘的Edman降解，与为下一代DNA测序开发的大规模平行荧光成像技术进行了整合/strong(图1)。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/462c7540-6c36-4ddd-8cd7-7b62240980c2.jpg" title="2.jpg" alt="2.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "图1. Swaminathan等人所描述的肽荧光测序/span/pp style="text-indent: 2em "复合肽混合物，最有可能来源于酶或化学切割的蛋白质提取物，每种氨基酸残基都有不同的荧光标记(左)。在这种情况下，我们描述了一种双色方案，其中赖氨酸和半胱氨酸残基用不同的荧光标记。利用氨基硅烷的的酰胺键将标记肽的C末端固定在玻璃板。然后通过Edman降解和荧光成像(中)对肽进行N-末端氨基酸残基切割的迭代循环。在每个位置(即肽)的荧光强度被跟踪为Edman循环的函数。荧光强度下降模式为肽的部分序列提供了注释，得到的荧光信号可以与蛋白质序列数据库进行匹配和评分，推断样本中最有可能存在的一组蛋白质(右)。/pp　　肽荧光测序的第一步是在特定的氨基酸侧链上进行荧光标记，并将其C端固定在测序系统的流通槽中，以生成测序底物阵列。然后将固定化肽平行地进行Edman降解，在每一步降解后对固定化底物的集合进行成像。与经典的Edman降解不同，该方法在每个步骤对消除的苯硫代内酰脲-氨基酸结合物进行了鉴定，降解步骤仅用于测定由消除标记氨基酸引起的荧光强度下降。基于该原理开发的软件工具，可以将观察到的荧光信号与蛋白序列数据库结合起来，进而推导出每种固定化底物的序列，也就是肽链的序列。/pp　　strong该研究已经证明肽荧光测序的可行性/strong。具体而言，作者(i)描述了在严格条件下，与Edman降解兼容的成像系统 (ii)测定了模型肽中荧光标记的赖氨酸或半胱氨酸残基的精确位置 (iii)描述了该系统中误差和低效的来源 (iv)研究了从更复杂蛋白质组鉴别蛋白质的潜力，并提供了一种从观察到的荧光信号推断肽序列的计算框架 (v)从含有多个丝氨酸残基的肽中定位特定的磷酸化丝氨酸残基。/pp　　Swaminathan等人开发的肽荧光测序方法是令人兴奋的，因为它开辟了一条通向肽的新研究路径，strong并使高通量、高重现性和潜在低成本的蛋白质组测序成为可能/strong。strong该方法的一个显著优点是，它整合了其他研究方法的优势，如Edman降解、大规模DNA平行测序和基于MS的蛋白序列数据库检索计算框架/strong。这种策略或有助于加快相关研究方法从证明概念到常规适用的转化速度。此外，该方法产生的数据与基因组学和转录组学的大规模平行先导数据有相似之处。MS蛋白组学技术在技术和计算方面仍存在较大的门槛，应用较为缓慢，与基于MS的蛋白组学技术相比，该方法有助于加速更多的生物体使用肽荧光测序技术。/pp　　正如Swaminathan等人所指出的，strong在新方法发挥其全部潜力之前，还必须克服一些技术和概念上的挑战/strong。这些问题主要源于Edman降解的性质和人类蛋白质组的复杂性，包括以下内容：(i)尽管在研究中每个降解步骤的产率为91-97%，但可检测的肽链长度也是有限的 (ii)由于测序产率与蛋白序列本身有关，具有挑战性的序列，如富含脯氨酸的蛋白序列，可能会影响荧光信号的清晰度 (iii)可被荧光标记的功能基团仅限于肽链中可产生化学反应的基团，主要是氨基、羧基和巯基，因此荧光信号代表的信息量也会受限制 (iv)经修饰的残基通常不能被识别，除非经过特异荧光标记，这种特殊标记仅对氨基酸进行小部分修饰 (v)人类细胞蛋白质组的动态范围较大(~107)，每种蛋白质也会通过酶消化产生大量的肽(~102)，每个细胞会表达大量的开放阅读框(~104)，在不考虑蛋白质多样性的前提下，这已经构成了巨大的分析挑战。对于肽荧光测序来说，满足这些挑战需要提高底物复用(substrate multiplexing)的水平，但目前尚未实现。/pp　　虽然作者开发的系统目前仅限于分析相对简单的混合物样本，但发展前景很好，是一种值得尝试的蛋白质测序方法。/p

瀚海基因董事长兼CEO贺建奎和GenoCare测序仪。图中绿色和黄色点代表核酸单色荧光标签，每个点代表一个单分子。（图片来源：Nature Biotechnology, Volume 34, Page 123-124, 2016)　　去年10月，位于深圳的瀚海基因发布了一款应用于临床检测的高性价比测序仪原理样机GenoCare，完全无需扩增，可在单分子水平上直接读取未经修饰的原始DNA片段，具有广泛的临床应用前景。近日，Nature Biotechnology就此撰文进行报道，文章如下：　　纵观整个基因测序产业链，处于上游的测序仪研发制造环节一直被Illumina、Thermo Fisher等测序巨头们所占据，然而，一家位于中国深圳的测序公司——瀚海基因，其研发的应用于临床检测的高性价比测序仪将给这些国外的测序巨头们带来潜在的威胁。去年10月，该公司发布了一款针对临床应用的单分子基因测序原理样机——GenoCare。此后，基因测序领域竞争持续升温。　　在2016年1月旧金山举行的第34届JP摩根健康大会上，Illumina推出了主要针对临床的台式测序系统MiniSeq，并将于2016年第一季度开始销售。同时，由J.Craig Venter联合创办的位于圣地亚哥的测序公司Human Longevity也发布了他们的肿瘤测序项目，该项目包括正在研发的一系列产品，例如全生殖细胞系、肿瘤基因组及肿瘤全外显子组分析。　　目前，瀚海基因着眼于中国市场。该公司继承并发展了美国加州理工学院的专利技术。该技术最初由位于美国马萨诸塞州剑桥市的Helicos Biosciences公司推向市场。Helicos测序公司由单分子测序领域泰斗级人物斯蒂芬?奎克(Stephen Quake)教授于2004年创办，并于2012年最终破产。贺建奎是南方科技大学生物物理学及基因组学科学家，他的另一个身份是瀚海基因的CEO。在奎克实验室完成博士后工作后，贺建奎回到中国创办了这家致力于临床诊断的基因测序公司。奎克现在担任这家公司的首席科学顾问。　　瀚海基因的测序仪主要针对临床应用。GenoCare测序仪可在单分子水平上直接读取未经修饰的原始DNA片段。然而传统的测序仪则需要利用PCR技术对DNA进行扩增，同时还需要其他一些样品制备步骤，与之相比GenoCare测序仪是一个完全无需扩增的测序技术。该技术将光汇聚到DNA分子上，防止背景噪声对测序结果产生影响，进而实现了对单链DNA上微小信号的检测。尽管在全基因组测序通量上还不及Illumina和Thermo Fisher的测序平台，但是这项技术对患者特定病灶位点的基因测序而言，具有快速且价格低廉的特点，可使医生能够根据特定的突变来为患者制定和调整治疗策略。　　“我真的很喜欢它。它与罗氏454、Ion和Illumina一样利用了传统的边合成边测序技术，但做到了单分子检测”，来自AxioMx公司的测序专家及生物技术企业家Michael Weiner对GenoCare测序仪这样称赞道。　　随着整个人类基因组测序费用已经降到了1000美元，瀚海基因计划提供100美元的临床测序服务，并将其纳入中国的医保范围内。贺建奎说：“一旦我们降低了成本，并使其达到100美元，那么13亿中国人将能够把临床测序作为常规检验，从抽血到检测报告整个过程不到20个小时”。　　该公司已经开展了与广东省内三家医院的早期合作。其试点项目有唐氏综合征和其它染色体三体的无创产前测试(染色体21、13和18三体) 以及包括50个癌症基因的panel和100种遗传疾病检测。目前，这些检测在市场上需要花费500美元甚至更多。2016年1月份，瀚海基因签约了第一个无创产前检测的客户——香港和美医疗，这是一家拥有30家妇幼医院的上市公司。　　目前，测序服务商以及潜在的客户都处在等待和观望中。在国内拥有Illumina HiSeq X Ten全基因组测序平台的北京诺禾致源公司CEO李瑞强说：“无需PCR扩增，单分子测序可以避免测序偏差，但错误率高已被证明是一个挑战。省去PCR扩增的麻烦是非常重要的进步。但我们看到，Helicos失败了，PacBio和OxfordNanopore两个公司的产品测序错误率都很高。不过，我们还是很有兴趣，并希望看到瀚海基因的仪器走向市场。”　　贺建奎强调目前他们正努力解决这些问题。他说：“我们通过1000X的测序来弥补单次错误率高的不足。从测序癌症基因与乙型肝炎病毒结果来看，我们的错误率已经接近Illumina和Thermo Fisher的水平。其中5X的测序准确性达到了100%。”中国正准备发布精准医疗计划。据说在未来15年预算在600亿元人民币(91亿美元)。该计划预计在今年春天正式启动，目前全国各大医院正在加紧建设精准医学中心。　　贺建奎估计，中国的临床基因检测市场每年将有2000万的无创产前诊断，300万癌症panel基因检测，2000万遗传病检测，3000万癌症早期筛查，以及1000万乙肝病毒检测。他希望GenoCare能承担一半的检测任务。自2013成立以来，瀚海基因通过三轮融资和政府拨款已经获得了1.2亿元(约1830万美元)资金。他希望在2017年GenoCare可以经由绿色通道申报，通过中国食品和药品管理局的审批。　　Weiner说：“我不确定他们是否比Illumina更便宜。但是它可以降低劳动力成本，因而能填补偌大的基因测序市场中的一片空白。”贺建奎认为自己的公司是一个三代测序仪提供商，其竞争者主要来自纳米孔测序技术相关企业，如罗氏公司和Oxford Nanopore。”　　李瑞强说：“有更多的选择对测序服务商来说是一件让人高兴的事情。这是一个很热的领域，Thermo/Life Tech、Illumina、PacBio和Qiagen公司都推出了新的测序仪器。我们希望看到更多的技术，这样可以让用户针对特定的临床应用选择最适合他们的技术。”　　原文作者：David Cyranoski　　翻译：田新杰，李改玲，赵陆洋　　原文来源：Nature Biotechnology, Volume 34, Page 123-124, 2016