黄曲霉衍生原理

柱后衍生的福音——黄曲霉毒素光化学衍生器黄曲霉毒素（AFT）B1和G1显示天然荧光性，因此B1和G1在检测之前必须进行衍生。传统的电化学衍生费时费力，应用的化学药品不仅会腐蚀色谱仪而且对操作人员有毒副作用，黄曲霉毒素光化学衍生器（Pribolab® MDU）是一款新型的柱后衍生器，尤其适用于当前较为流行的UPLC。该方法结果与电化学方法一致但其不使用任何腐蚀性试剂，HPLC的使用寿命将会增加，且不需要额外的清理工作，更加省时省力省心。黄曲霉毒素光化学衍生器实现了对黄曲霉毒素在线衍生和检测，有效提高检测效率，准确性，检测灵敏度以及重复性，此方法已被AOAC认可。

黄曲霉毒素光化学器柱後衍生法的B1及G1会因为紫外线254nm照射而结构改变

用PICKERING柱后衍生系统检测黄曲霉毒素，用0.05%碘液（甲醇水2：8），衍生泵压力偏高，超过2000，用甲醇冲洗的时候压力正常1000。想请教下各位大神，衍生泵压力偏高，是否跟碘液的溶剂比例有关，调高甲醇水的甲醇比例是否能够降低衍生泵压力。 在反相液相色谱中，调整溶剂比例是否能够影响系统压力，原理是什么，求各位大神解惑。

食用油中黄曲霉毒素B1的柱前衍生法怎么也做不好，回收只有20%，找不到原因，有做过的吗？具体方法：称取油样5g，加入84+16乙腈-水20毫升浸泡过夜，次日超声20min，离心5min，取上清液过黄曲霉专用柱，取净化液2毫升，氮吹，吹干后，加入正己烷0.6毫升，三氟乙酸0.3毫升，混匀，40度烘箱衍生15min，取出氮吹，吹干后1毫升15+85乙腈+水定容，上机测定。

最近在检测黄曲霉毒素时，为何要衍生，好多文献只是提到水可以猝灭，但是对于原因却不清楚，所以产生了疑问，B1、G1为何在水中会猝灭，衍生的机理是什么，请教下各位老师，有没有相关的文献或者出处。

大家工作中作黄曲霉毒素B1时，测定用的衍生装置是哪种的：柱后衍生泵？光化学衍生装置？还是电化学衍生装置？它们的哪种衍生方式性价比更高？

各位大佬麻烦问一下，我走的黄曲霉为什么会这样，用的方法是5009.27-2016的柱前衍生（第二法），条件是12:12:76(乙腈:甲醇:水) 柱温是40 检测波长是 360nm到440nm 除了没用方法规定的15cm柱子其余都是一样，为什么会走成这样[img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/05/202305311535415716_9092_5517077_3.png[/img]

我用GB/T5009.23-2006《食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》试着做了几次，但结果很不理想。有峰的时候同一标准峰高峰面积差别太大，而且有时候很不规则，但更多是根本没峰，做不出来。问了很多人都说柱前衍生很难做，有条件用柱后衍生的好。但是既然连国标都有柱前衍生的方法，就应该有他存在的道理。我做不出来，请各位大大指点下柱前衍生到底怎么做能提高成功率。 柱前衍生化步骤如下（一段）：从多功能净化柱的收集池内转移2ml净化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下60摄氏度吹干（或在60摄氏度水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓吹、飞溅）。加入200ul正己烷和100ul三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40摄氏度烘干箱中衍生15min。室温真空吹干机吹干（或室温水浴下氮气吹干），以200ul水---乙腈（85+15）溶解，混匀30s，1000r/min离心15min，取上清液至液相色谱仪的样品瓶中，供测定用。还有我想问下做柱后衍生的，柱后衍生化系统，什么型号的，推荐下，可能要买个。。。。。

1、仪器及方法：黄曲霉毒素检测，waters柱后衍生系统，衍生液为0.05%碘溶液，反应温度70℃，流速0.2ml/min2、现象：衍生液不输液（上机检测过程中，几个小时之后会出现不输液或者是输液量降低，压力为0或者是降低为100psi（正常压力1100psi左右））3、故障排查：将衍生液（0.05%碘溶液)更换为屈臣氏水（超声10min)。 a、滤芯拆掉，做prime，仍然不出液。不是滤芯的问题， b、拆卸4个单向阀，超声，之后做prime，正常输液。、 c、单独断开衍生泵走0.2ml/min的流速，按时间计时，出液量正常。压力稳定950-1000psi d、将屈臣氏水更换为衍生液（0.05%碘溶液)，按照abc三个步骤做。出液量正常。0.2ml/min流速压力正常1000-1150psi e、上机检测黄曲霉毒素，运行20h，正常。正常关机。大约3h之后，断开衍生泵。将衍生液更换为屈臣氏水，做prime，直至出液正常。更换为衍生液（0.05% 碘溶液)，用0.2ml/min流速直至出液正常，压力正常1000-1150psi f、二次上机检测黄曲霉毒素，晚上运行，第二天上班（已经运行15h），经看样品曲线，运行6h之后，基线不稳，可以看出是输液量不正常，压力显示为150psi。做prime不出液。经和waters工程师沟通，可以再超声单向阀。超声之后按照abcd四个步骤操作，更换新开封的碘配置的碘液。0.2ml/min的流速压力2h内从950上升到1150psi。4、[b]疑问[/b]：上机检测前半时间衍生泵还是正常输液，后半段时间输液就不正常，是什么原因导致的？仅仅是单向阀的问题还是有别的地方存在故障。请大神解答。

[color=#444444]我们用碘衍生方法，按照药典中样品前处理的方法配制样品溶液，加样做回收率，其中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1的回收率均在70%以上，而黄曲霉毒素G2的回收率总是在40%左右，换了另一个品牌新色谱柱结果一样，想问一下这个跟四种毒素的结构有关系吗，或者跟免疫亲和柱有关吗？[/color][img=,absmiddle]http://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/rolleyes.gif[/img]

各位大神，我单位拟采购一台光化学衍生器用于测定黄曲霉毒素，现看了两家的产品，LC-TECH和ROMER，很难抉择，请各位大神给点意见，哪个品牌的哪个型号好，感激不尽！

各位大神，我们单位准备开发黄曲霉毒素B1，用的是柱前衍生法，有没有哪位大神做过这个的，标准曲线上样前是否需要衍生，还是直接配置好上机的？还有柱前衍生好做吗？

PriboFast®KRC 光化学柱后衍生反应器广泛应用于液相色谱检测分析, 使用时置于色谱柱和检测器之间，进行柱后连续光化学衍生反应提高荧光、紫外、电化学检测和化学发光检测器的灵敏度和响应的选择性。技术特点：1. 在线对黄曲霉毒素B1、G1进行衍生，重现性好；不需要任何化学衍生试剂，减少了液相系统的清洗工作，延长了其使用寿命。2．黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的最低检测限在0.5ppb以下。可以同时进样，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，M1, M2同时进行检测。3．安装、操作简单（5分钟即可投入使用），使用寿命长。4．符合AOAC 2005.08, AOAC 2008.02,AOCS Aa 11-05，中国台湾标准（食字第0981800370 号公告）和欧盟药典 2.8.18标准分析方法5．型号： PriboFast® KRC, 厂家：新加坡 Pribolab Pte. Ltd.【较传统的电化学衍生相比具有如下优点】 无需使用化学物质（省钱的同时，也避免操作人员接触有毒化学物质）； 增加 HPLC 仪器的寿命（没有腐蚀性酸流经毛细管）； 无需冲洗步骤； 结果与电化学方法（溴衍生）一致。光化学柱后衍生光化学反应装置除应用于黄曲霉毒素检测外, 还可以应用于大量的巴比妥酸盐、氨基酸、多肽、黄曲霉毒素、维生素及磺胺类药物等分析。HPLC 法检测磺胺类药物时, 还能够增强磺胺类药物的荧光强度：磺胺嘧啶（Sulfadiazine），磺胺吡啶（Sulfapyridine），磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine），磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine），磺胺对甲氧嘧（Sulfamethoxydiazine），磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline），灵敏度达到10ppb 左右

黄曲霉B1柱后衍生检测，液相出峰时间漂移允许误差是多少？领导要求2.5%以下，我们做的4%左右，可以吗

液相色谱 荧光检测器做黄曲霉毒素B1为什么衍生时候要用正己烷标准上说：加200μL正已烷和50μL三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液（1+1）定容至1.0mL，超声1min，用0.5μm滤膜过滤，滤液供液相色谱。不知道为什么这个步骤要加入正己烷 作用是什么 能不能用其他代替？

食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法，TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA法重现性差，易受样品基质干扰假阳性率高，仅能作为筛选方法。近年来，由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点，现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响，正相色谱中，B1和B2的荧光强度仅稍低一点，不需衍生化；而在常用的反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类， 柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来，很多标准方法利用免疫亲合柱净化，HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析，方法检出限能够达到1 μg/kg以下。Q1。免疫亲和柱的填料是什么，它是怎样工作的，为什么要用它？ 免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点，不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶（黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体），基于抗原抗体反应进行工作，专一性很强，再加上另一种原理（反相或正相液相色谱）的分离，即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净，直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定，也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱（不是免疫柱）要便宜一些，能做的霉菌毒素品种也多，但是专一性就差些。Q2。Kobra cell可以在线产生溴，这对分析有什么作用？是可以提高灵敏度吗？如果是，溴是如何与黄曲霉素反应的？络合？氧化？还是别的什么？ 由欧以上的论述，应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究，可能和柱后衍生类似（氧化？），考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍，是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施？这个阿胖讲得差不多了，方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿，当然最好不要自己称固体标样，那东东有静电，很容易飞出来，买溶液就行了。要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕，对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证，每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少，有的HPLC筛选方法，提取后不净化就直接进样了，也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关，如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干，肯定是要用HPLC法；如果就骗骗中国的官僚和老百姓，那就像啊胖说的，酶免法又省钱有省事，嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法，净化方法很差，UV灯下看上去是一条亮带，满足国标20PPB的限量都很勉强，这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。1、AOAC方法简述25g均匀样品，加入氯化钠5 g和125 mL甲醇：水（7+3），均质2min，过滤。取15 mL滤液加30 mL水，再次过滤后，取10 mL过免疫亲和柱，2×10 mL水洗柱，最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容至2 mL，供HPLC测定。HPLC条件：色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：甲醇-乙腈-水（1+1+3）；流速：1.0 mL/min； 柱后衍生试剂：100 mg碘溶于2 mL甲醇，加水至200 mL。流速0.3 mL/min；衍生化温度：70 ℃；衍生化时间：55 s；激发波长：360 nm；发射波长： 420 nm；进样量：50 μL。3. 方法技术指标：免疫亲和柱净化，HPLC柱后衍生化的方法回收率(1) 2000年AOAC协同试验结果B1: 82- 109 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)B2: 77- 123 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)G1: 58- 93 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)G2: 62- 105 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)(2) 1991年AOAC协同试验结果B1: 77- 90 %(添加水平：5.8- 17.5 ng/g)B2: 55- 70 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)G1: 76- 98 %(添加水平：2.5- 7.5 ng/g)G2: 36- 55 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)碘衍生化方法的反应温度要70 ℃，需要单独的柱温箱，还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生（1）过溴化吡啶溴（PBPB）衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3）；流速：1.00 mL/min；衍生化溶液：25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水，室温下避光可保存5天；衍生化溶液流速：0.30 mL/min；衍生化反应管：55 cm × 0.5 mm id. 衍生化反应温度：室温。（2）电化学反应池衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3），每升加350 μL HNO3 (5 mol/L)，同时溶解120 mg KBr；衍生化反应池：Kobra cell Rhone Diagnostics Technologies Ltd.，衍生化操作电流：100 μA。

各位大侠，我在用柱前衍生，高效液相做黄曲霉检测时，回收率只有百分之七十多，这样子能接受么？请问有用液相，柱前衍生做黄曲霉的前辈，你们的回收率是多少呀？我是用免疫亲和柱净化后再衍生的，能指点一下检测黄曲霉有那些地方是比较关键的控制点么？帮忙提高一下回收率，谢谢

食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法，TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA法重现性差，易受样品基质干扰假阳性率高，仅能作为筛选方法。近年来，由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点，现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响，正相色谱中，B1和B2的荧光强度仅稍低一点，不需衍生化；而在常用的反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类， 柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来，很多标准方法利用免疫亲合柱净化，HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析，方法检出限能够达到1 μg/kg以下。Q1。免疫亲和柱的填料是什么，它是怎样工作的，为什么要用它？ 免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点，不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶（黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体），基于抗原抗体反应进行工作，专一性很强，再加上另一种原理（反相或正相液相色谱）的分离，即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净，直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定，也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱（不是免疫柱）要便宜一些，能做的霉菌毒素品种也多，但是专一性就差些。Q2。Kobra cell可以在线产生溴，这对分析有什么作用？是可以提高灵敏度吗？如果是，溴是如何与黄曲霉素反应的？络合？氧化？还是别的什么？ 由欧以上的论述，应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究，可能和柱后衍生类似（氧化？），考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍，是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施？这个阿胖讲得差不多了，方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿，当然最好不要自己称固体标样，那东东有静电，很容易飞出来，买溶液就行了。要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕，对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证，每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少，有的HPLC筛选方法，提取后不净化就直接进样了，也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关，如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干，肯定是要用HPLC法；如果就骗骗中国的官僚和老百姓，那就像啊胖说的，酶免法又省钱有省事，嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法，净化方法很差，UV灯下看上去是一条亮带，满足国标20PPB的限量都很勉强，这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。1、AOAC方法简述25g均匀样品，加入氯化钠5 g和125 mL甲醇：水（7+3），均质2min，过滤。取15 mL滤液加30 mL水，再次过滤后，取10 mL过免疫亲和柱，2×10 mL水洗柱，最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容至2 mL，供HPLC测定。HPLC条件：色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：甲醇-乙腈-水（1+1+3）；流速：1.0 mL/min； 柱后衍生试剂：100 mg碘溶于2 mL甲醇，加水至200 mL。流速0.3 mL/min；衍生化温度：70 ℃；衍生化时间：55 s；激发波长：360 nm；发射波长： 420 nm；进样量：50 μL。3. 方法技术指标：免疫亲和柱净化，HPLC柱后衍生化的方法回收率(1) 2000年AOAC协同试验结果B1: 82- 109 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)B2: 77- 123 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)G1: 58- 93 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)G2: 62- 105 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)(2) 1991年AOAC协同试验结果B1: 77- 90 %(添加水平：5.8- 17.5 ng/g)B2: 55- 70 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)G1: 76- 98 %(添加水平：2.5- 7.5 ng/g)G2: 36- 55 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)碘衍生化方法的反应温度要70 ℃，需要单独的柱温箱，还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生（1）过溴化吡啶溴（PBPB）衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3）；流速：1.00 mL/min；衍生化溶液：25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水，室温下避光可保存5天；衍生化溶液流速：0.30 mL/min；衍生化反应管：55 cm × 0.5 mm id. 衍生化反应温度：室温。（2）电化学反应池衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3），每升加350 μL HNO3 (5 mol/L)，同时溶解120 mg KBr；衍生化反应池：Kobra cell Rhone Diagnostics Technologies Ltd.，衍生化操作电流：100 μA。

柱后衍生的福音——黄曲霉毒素光化学衍生器黄曲霉毒素（AFT）B1和G1显示天然荧光性，因此B1和G1在检测之前必须进行衍生。传统的电化学衍生费时费力，应用的化学药品不仅会腐蚀色谱仪而且对操作人员有毒副作用，黄曲霉毒素光化学衍生器（Pribolab® MDU）是一款新型的柱后衍生器，尤其适用于当前较为流行的UPLC。该方法结果与电化学方法一致但其不使用任何腐蚀性试剂，HPLC的使用寿命将会增加，且不需要额外的清理工作，更加省时省力省心。黄曲霉毒素光化学衍生器实现了对黄曲霉毒素在线衍生和检测，有效提高检测效率，准确性，检测灵敏度以及重复性，此方法已被AOAC认可。

比如说做阿维菌素的时候，我就是先衍生好样品还有标准品什么的，然后在液相色谱上用荧光检测器检测——这样可以理解为柱前衍生；反之，如确证或者在做黄曲霉素的时候，我要在进荧光检测器之后接一个衍生池来完成衍生目的，这样可以理解为柱后衍生吧？？？请指教，并谢谢！

什么是黄曲霉毒素　　黄曲霉毒素（Aflatoxins）是生长在食物及饲料中的黄曲霉和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少，目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有17种，主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及由B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2等。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本毒性结构，后者与致癌性有关。B1的毒性（其毒性比氰化钾毒性高）及致癌性极强且耐热（B1的分解温度为268℃左右，一般烹调加工破坏很少），在天然污染的食品中以B1最为多见。　黄曲霉毒素分布　　黄曲霉毒素主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米等食物中；在水中的溶解范围为10毫克/升~20毫克/升， 可大量溶解于氯仿、甲醇、二甲基亚砜等中等极性的有机溶剂中，不溶于己烷、石油醚和乙醚；易被碱或强氧化剂破坏；进入人体后主要经消化道吸收，大部分分布 在肝脏、肾脏，少部分分布在血液、肌肉、脂肪组织中，其在体内的代谢过程主要为羟基化作用、去甲基作用和环氧化作用。

转自色谱网，作者：Mass 食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法，TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA法重现性差，易受样品基质干扰假阳性率高，仅能作为筛选方法。近年来，由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点，现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响，正相色谱中，B1和B2的荧光强度仅稍低一点，不需衍生化；而在常用的反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类， 柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来，很多标准方法利用免疫亲合柱净化，HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析，方法检出限能够达到1 μg/kg以下。Q1。免疫亲和柱的填料是什么，它是怎样工作的，为什么要用它？ 免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点，不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶（黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体），基于抗原抗体反应进行工作，专一性很强，再加上另一种原理（反相或正相液相色谱）的分离，即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净，直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定，也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱（不是免疫柱）要便宜一些，能做的霉菌毒素品种也多，但是专一性就差些。Q2。Kobra cell可以在线产生溴，这对分析有什么作用？是可以提高灵敏度吗？如果是，溴是如何与黄曲霉素反应的？络合？氧化？还是别的什么？ 由欧以上的论述，应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究，可能和柱后衍生类似（氧化？），考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍，是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施？这个阿胖讲得差不多了，方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿，当然最好不要自己称固体标样，那东东有静电，很容易飞出来，买溶液就行了。要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕，对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证，每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少，有的HPLC筛选方法，提取后不净化就直接进样了，也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关，如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干，肯定是要用HPLC法；如果就骗骗中国的官僚和老百姓，那就像啊胖说的，酶免法又省钱有省事，嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法，净化方法很差，UV灯下看上去是一条亮带，满足国标20PPB的限量都很勉强，这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。1、AOAC方法简述25g均匀样品，加入氯化钠5 g和125 mL甲醇：水（7+3），均质2min，过滤。取15 mL滤液加30 mL水，再次过滤后，取10 mL过免疫亲和柱，2×10 mL水洗柱，最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容至2 mL，供HPLC测定。HPLC条件：色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：甲醇-乙腈-水（1+1+3）；流速：1.0 mL/min； 柱后衍生试剂：100 mg碘溶于2 mL甲醇，加水至200 mL。流速0.3 mL/min；衍生化温度：70 ℃；衍生化时间：55 s；激发波长：360 nm；发射波长： 420 nm；进样量：50 μL。3. 方法技术指标：免疫亲和柱净化，HPLC柱后衍生化的方法回收率(1) 2000年AOAC协同试验结果B1: 82- 109 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)B2: 77- 123 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)G1: 58- 93 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)G2: 62- 105 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)(2) 1991年AOAC协同试验结果B1: 77- 90 %(添加水平：5.8- 17.5 ng/g)B2: 55- 70 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)G1: 76- 98 %(添加水平：2.5- 7.5 ng/g)G2: 36- 55 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)碘衍生化方法的反应温度要70 ℃，需要单独的柱温箱，还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生（1）过溴化吡啶溴（PBPB）衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3）；流速：1.00 mL/min；衍生化溶液：25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水，室温下避光可保存5天；衍生化溶液流速：0.30 mL/min；衍生化反应管：55 cm × 0.5 mm id. 衍生化反应温度：室温。（2）电化学反应池衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3），每升加350 μL HNO3 (5 mol/L)，同时溶解120 mg KBr；衍生化反应池：Kobra cell Rhone Diagnostics Technologies Ltd.，衍生化操作电流：100 μA。

中药材黄曲霉毒素检测技术方案一、 中药材质量安全现状 中药材是中医防病治病的重要基础。中药材在田间生长、采收加工、储藏运输等各个环节都会因污染霉菌而发生霉变。这些霉菌分泌的有毒代谢产物使中药材发霉变质，直接威胁到群众的用药安全。中药中的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏马毒素等。中药材的种类是影响真菌毒素污染的主要因素,易污染的中药材,在不同的温、湿度条件下均可产生真菌毒素。温度和湿度条件也可以影响真菌毒素的增长,如：黄曲霉毒素在不同的温、湿度条件下均可以产生；赭曲霉毒素需要在湿度较高的条件下才能产生。 近年来,随着中药材在国际市场上的持续升温,其安全性越来越引起人们的关注。真菌毒素残留作为中药材微量外源性有毒有害物质,一般不表现出急性毒性,但通常有较强的蓄积性,致癌、致畸、致突变作用明显,严重影响中药材的安全性。二、 中药材真菌毒素控制相关国家法规 近年来，各级食品药品监管部门不断加大中药监管力度，努力保持中药质量总体稳定。国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知（国食药监安187号文件）中 ，要求加强对黄曲霉毒素、重金属及有害元素、农药残留量等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。 《国家药品安全“十二五”规划》，规划中明确指出“开展药品快速检验技术研究，搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”，“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。三、 中药材真菌毒素检测项目及限量标准 国家食品药品监督管理局对柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、薏苡仁、大枣、地龙、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为“黄曲霉毒素B1不得过5 μg/kg；黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得过10 μg/kg”。2010 版《药典》附录IX V 黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加光化学柱后衍生法。四、 检测方案介绍（一） HPLC仪器分析法 免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合2010版《药典》附录IX V中黄曲霉毒素测定高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。1. 设备和耗材配置序号品名规格及参数数量用途1高效液相色谱仪配备荧光检测器一台分析检测2真菌毒素色谱柱150/250mm一支 3黄曲霉毒素总量免疫亲和柱1ml，25支/盒：若干高特异性，纯化样本4KRC光化学柱后衍生反应装置货号：PHRED-KRC-KRC一台适用于黄曲霉毒素检测5高速均质器达到22000rpm以上，一台耐腐蚀，高速6玻璃纤维滤纸100P,110mm，1.5μm一盒霉菌毒素专用过滤7八位泵流操作架货号：EQ-PUMP-8一台用于控制免疫亲和柱过柱流速8黄曲霉毒素混标黄曲霉毒素B1, G1; B2;G2(4/1/4/1),1ml用于定量分析标准品的配制2. 样品前处理:普瑞邦为中药材提供不同的处理方案(详细方案请联系普瑞邦，普瑞邦开发了针对多种中药材基质提供优化的处理方案)3. 免疫亲和柱净化:富集--洗涤--洗脱--收集全部洗脱液供化学衍生检测用。4. 化学衍生为什么使用光化学衍生器？ 由于黄曲霉具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，因此可以进行HPLC-紫外或荧光检测，但是同时黄曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流动相中容易产生荧光淬灭，因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在线的，由于在线的柱后光化学衍生有明显的优势，所以现在被增补为药典的检测方法，优势主要在于无需任何化学试剂、对人员无伤害；无需人员直接操作、避免误差; 无需担心衍生液腐蚀检测器。5. 高效液相色谱分析（HPLC）（二）酶联免疫法优点缺点灵敏度高、耗时较短、样本处理比较简单、对技术人员要求不高、检测成本低、可同时检测大批量样本。适用于大量样本快速定量筛查。可能存在一定假阳性率（交叉反应率）。 黄曲霉毒素总量试剂盒具有较高的灵敏度和准确度，适用于大量样本的定量分析。1. 方法原理采用直接竞争酶联免疫法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本（或黄曲霉毒素标准品溶液）及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素特异抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合酶标抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素总量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素总量的含量。2. 设备和试剂配置：序号品名规格及参数数量用途1黄曲霉毒素总量试剂盒96T，灵敏度：0.1ppb货号：EKT-011一盒定量分析检测2离心小柱25T一盒净化样本3酶标仪（酶联免疫检测仪）滤光片：450nm一台测定结果3. 样本前处理：中药材：粉碎、溶解、离心，取上清液加入PriboSpin离心小柱进行净化。 为什么要用PriboSpin离心小柱？中药材的基质复杂，提取时样本液颜色较深，而且不容易去除。有机试剂提取净化方法繁琐，试剂挥发对环境及人体造成危害，且净化效果不稳定。用PriboSpin离心小柱，则只需提取液离心过柱，即可去除提取液中的杂质，方便快捷，净化效果好，且回收率可以达到85%以上。4. 检测步骤免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酶标仪读OD值。5. 分析结果的表述 用酶标仪判读结果。五、 温馨TIPS1. 中药中真菌生长繁殖的有利条件主要是适宜的温度与水分。如能将中药贮存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。2. 从事真菌毒素科研及检测的人员，必须注意防护，如穿戴隔离衣帽，在进行真菌分离培养工作时，应戴口罩，并尽量防止孢子飞扬。3

黄曲霉毒素B1柱后衍生法，标曲不出峰什么情况

黄曲霉毒素（AFT）B1和G1显示天然荧光性，因此B1和G1在检测之前必须进行衍生。以前用我们实验室用的电化学衍生。费时费力，应用的化学药还腐蚀色谱仪而且对我们这些操作人员有毒副作用，现在我们实验室用的黄曲霉毒素光化学衍生器（Pribolab® MDU）是一款新型的柱后衍生器，换适用于当前较为流行的UPLC。我们这个方法得出的结果与电化学方法一致但其不使用任何腐蚀性试剂，HPLC的使用寿命将会增加，且不需要额外的清理工作，更加省时省力省心。 黄曲霉毒素光化学衍生器实现了对黄曲霉毒素在线衍生和检测，有效提高检测效率，准确性，检测灵敏度以及重复性，此方法已被AOAC认可。1.衍生时间缩短(大致5分钟即可完成)2.无需使用化学物质3.增加HPLC仪器的寿命4.无需冲洗步骤。5.结果与电化学方法（溴衍生）一致6.适用于超高效液相色谱仪(UPLC)

各位老师：刚开始做液相。黄曲霉实验后，相关实验器具，说是要用10%的次氯酸钠溶液泡。基本是配标液的器具处理。如果泡的话，要用烧杯，也要泡一定的时间。同一个实验室的同事意见很大。想让我直接扔了。请问各位老师是怎么处理的呢？我们黄曲霉是用的waters的UPLC仪器，用的是无衍生法。标准曲线最低点能做出来。做之前用金标法快检试剂盒筛查。想请教下各位老师，这样做应该没问题吧？