冷冻产品检测

Iglo提供方便、高质量的冷冻食品，包括鱼类、海产品、蔬菜和鸡肉，是欧洲的一个冷冻食品公司。 Iglo面临的挑战Iglo为欧洲西部、中部和东部的不同区域提供品牌冷冻食品。面向如此多不同类型的市场，其目标不仅只是满足健康、方便的需求，而且要符合欧洲食品安全局和全球食品安全倡议 (GFSI) 等国际食品安全标准和组织的规定。 然而Iglo采用的是传统的金属检测机，在非金属污染物方面的检测能力有限。 测试&调研 Iglo决定对X射线检测系统进行评估，以便提高其污染物检测能力。 评估的一个关键参数是设备经受恶劣环境和极端温度的能力。在检测过程中，鱼类和蔬菜温度保持在-18°C，并非所有的检测系统都能在这样低的温度下运行。此外，冷冻产品水分含量高，会影响金属检测机等传统检测技术的灵敏度，从而降低检测的准确性。 Iglo对八家供应商的异物检测设备进行测试，并选择了Eagle的X射线检测系统。 解决方案&业务价值 Eagle Pack 430满足并且超出了他们的预期，能够在寒冷、高湿度的环境中运行，且检测性能不受温度和水分含量的影响。 该系统采用了双能材料甄别(MDX)技术，检测出了测试包装中的玻璃碎片和各种非金属污染物。 MDX按照化学成分（原子数）甄别材料，能够检测并剔除难以检测到的无机污染物，例如玻璃、石头等。此外，Eagle提供现场支持和定制系统，可轻松地集成至现有产线。 目前，Iglo的德国工厂安装了四套 Eagle Pack 430系统以检测不同产品。使用Eagle X射线检测系统后，Iglo不仅可以检测多种污染物，更好地控制生产，而且提高了供应链的可追溯性和品牌总体竞争力。 “可根据不同产品轻松、快速地转换检测参数，提高了效率，使我们满足食品安全标准。” “Eagle的现场服务给我们留下了非常深刻的印象，帮助我们调试设备，能够完全满足我们的需求。”Reken工厂项目经理Arno Strotmann 更高的可追溯性欧洲食品安全局 (EFSA)规定：生产商必须能够对食品的生产、加工和配送阶段进行追踪，以免不安全的食品到达消费者手中。 Eagle TraceServer™ 软件可同时连接32台Eagle x射线设备，保存检测过程中产生的所有数据和图像，将其存储在中央数据库中，并可从数据库导出所需数据，轻松实现产品的可追溯性，为Iglo提供了尽职调查的能力。 想要了解更多Eagle鹰光™ 的产品，请进入网站https://www.instrument.com.cn/netshow/SH101016/Search.htm?sType=0&Keywords=Eagle，留下您的信息，我们的专业工程师将竭诚为您服务。

冷冻机油广泛应用于各行各业，用于去除设备中的热量。典型的应用包括酿造厂，使酿造厂的温度保持在零摄氏度左右，以及需要稳定的冷冻水供应的化学工艺中。制冷机通常通过制冷循环或蒸汽压缩来运行。近年来，吸收式制冷循环在工业上并没有得到广泛的应用，因此我们将把注意力集中在采用蒸汽压缩技术的制冷机上。在这种方法中，热量被制冷液吸收，制冷液沸腾后由液体变为气体。热量被去除之后，气体再被压缩回液体。就像家用空调一样，热量通常被转移到设备外部去除，所以从冷却介质到环境之间是净热传递。这些系统通常是密封的，因此制冷剂不会逸出。那么密封系统为什么需要进行油液分析？系统中的需要通过泵和卷轴进行移动和压缩。我们需要监控的是系统组件中轴承和其他运动部件的状况。具体而言，我们要监测的是轴承，卷轴，油品质量和污染。.压缩机的一个独特之处在于润滑剂必须与驱动系统的制冷剂混溶。通常，制造商会推荐与其系统和所选制冷剂兼容的润滑油。现代的臭氧友好型制冷剂通常需要合成油。多元醇酯润滑剂在冷却器系统中变也得非常普遍。为什么要进行监测?油的质量 - 润滑油的状态会影响其混溶性。我们应该检查确保用的是正确的机油，而且油的状况良好。机油污染 - 如果油被污染了，会对制冷机的效率产生负面影响。特别是水污染会降低制冷机的效率。磨损 - 正如我们所说，监控的关键部件是轴承和卷轴。过度的污染或磨损碎片可能导致轴承失效。早期检测可以在系统故障前进行修复。早期修复通常成本较低，并且可以防止停机。推荐的测试参数有哪些?水分- 水污染会降低制冷机的效率，也会导致腐蚀和冷冻问题。确保油是干燥的可以省去很多麻烦。酸值/碱值 - 对于氟利昂或R-22等氯化制冷剂，建议对总酸值(TAN)进行测试。对于氨基系统，建议对总碱值(TBN)进行测试。总碱值会影响制冷剂中润滑剂的混溶性。真空粘度 (40 ℃) -运动粘度是流体在重力作用下的阻力。这是润滑剂最重要的物理特性。如果制冷系统中润滑油粘度下降，则表明分离器不能正常工作。冷却系统中粘度的测量有时很难测量，因为制冷剂溶解在润滑剂中，在测量粘度之前，制冷剂通常必须先排气。这可能需要几个小时。幸运的是，如果你使用的是斯派超MiniVisc 3000，就不需要此步骤。MiniVisc的毛细管设计允许润滑油在测量时排出气体。磨损金属 - 金属元素分析可以确定污染源，使问题根源诊断变得更加容易。铁磁颗粒浓度 - 铁磁材料磨损的急剧增加或磨损颗粒尺寸的急剧增加通常表明磨损状况的异常或正在恶化。监测磨损金属颗粒可以让维修人员在故障发生之前进行维护。.

全国第三次土壤普查的通知国务院印发《关于开展第三次全国土壤普查的通知》（以下简称《通知》），决定自2022年起开展第三次全国土壤普查，利用4年时间全面查清农用地土壤质量家底。《通知》明确了普查总体要求、对象与内容、时间安排、组织实施、经费保障和工作要求。普查时间为2022—2025年。2022年完成普查技术、规范、物资等准备，开展全国性试点；2023—2024年全面铺开普查，并形成阶段性成果；2025年开展普查数据审核、成果汇总、验收与总结，全面完成普查任务。普查的对象和内容普查对象为全国耕地、园地、林地、草地等农用地和部分未利用地的土壤。其中，林地、草地重点调查与食物生产相关的土地，未利用地重点调查与可开垦耕地资源相关的土地，如盐碱地等。普查内容为土壤性状、类型、立地条件、利用状况等。其中，性状普查包括野外土壤表层样品采集、理化和生物性状指标分析化验等；类型普查包括对主要土壤类型的剖面挖掘观测、采样化验等；立地条件普查包括地形地貌、水文地质等；利用状况普查包括基础设施条件、植被类型等。冻干技术成为土壤检测方法之一在对土壤检测分析的过程中，真空冷冻干燥技术可以发挥很大的优势。因为冷冻干燥是在低温，真空的环境中进行，不会改变土壤的结构，成分，性质，外形，微生物，沉积物等，只是移除土壤中的水分，可以长时间存储，易运输。在后续检测过程中，可以正确的检测出土壤理化和生物性状。富睿捷冻干机助力土壤检测富睿捷科技专注冻干机研发生产，SOIL系列专为土壤冻干设计。直立式的内置式冷阱盘管，有效捕捉溶剂；冷阱温度最低可达到-55℃，捕水能力强；更大、更多的样品隔板托盘，最多可到0.4㎡。

目前，拉曼光谱技术已经在食品、医药、化工、材料等多个领域获得了广泛的应用。其应用在肉品品质检测中时多会受到多种信号干扰，部分指标检测需要联合SERS技术，本文邀请到了中国肉类食品综合研究中心白京老师向大家介绍拉曼光谱在冷冻肉中的应用。1、 简介冷冻肉品是当前最常见的原料肉贮藏品类，其一般是指畜肉宰杀后，经预冷、排酸、速冻（-28℃至-40℃ ），继而在-18℃以下储存，深层肉温达-6℃以下的肉品。冷冻猪肉在贮藏过程中，蛋白氧化、脂肪氧化和微生物及冰晶的传热传质等会大大降低其感官品质、食用品质及加工性能。目前，在冷冻肉贮藏流通过程中对其品质的评判主要是通过感官评定或相关理化指标检测，但是这些评判方法需要耗费大量人力物力，易受主观影响，准确度较低，不适合大宗贮藏批量交易的检验要求，亟需开发冷冻肉品质的无损快速检测方法。拉曼光谱技术具有快速、原位、无损伤检测等优点，在食品领域的应用研究受到了广泛关注。2、 拉曼光谱无损快速技术研究理论基础当激发光的光子与物质分子相碰撞，可产生弹性碰撞和非弹性碰撞。在弹性碰撞中二者未发生能量交换，光子频率不变，这种散射现象称为瑞利散射。在非弹射碰撞过程中，光子与分子有能量交换，光子转移一部分能量给散射分子，或从散射分子中吸收一部分能量，从而使其频率改变，这种分子对光子的非弹射散射效应即是拉曼散射。由于不同的化学键或基团有不同的能量改变，并产生相应的光子频率变化，故根据光子频率变化即可判断分子中所含的化学键或基团，此为拉曼光谱技术。散射光频率与入射光频率差值即为拉曼位移。图1拉曼散射原理3、 拉曼光谱技术在肉中的应用基础及现状肉品的物质组成、含量及其在贮存加工过程中蛋白质二级结构的变化能通过拉曼位移直接反应，主要体现在酰胺Ⅰ带：1645cm-1~1685cm-1（结构：α-螺旋： 1650cm-1~1658cm-1；β-折叠： 1665cm-1~1680cm-1；β-转角： 1680cm-1；无规则卷曲： 1660cm-1~1665cm-1）和酰胺Ⅲ带：1200cm-1~1235cm-1，其分子结构来自色氨酸等多种氨基酸、C=CN等基团、C=C基团和C-H相关基团等。另外，肉品脂质饱和程度在1260、1264、1290、1438、1445、1656、1658、1745 cm-1等拉曼位移处有直接体现，分子结构来自C=H形变、C=H扭转振动、=CH2剪振、=CH2形变、C=C拉伸和C=O等。目前拉曼光谱技术作为一种指纹识别图谱，在肉品领域应用主要集中在加工品质（pH值、嫩度、肉色、保水性）、营养品质（脂肪含量、脂肪酸含量）、安全品质（食源性致病菌、兽药残留（结合表面增强拉曼光谱））和掺假分析（牛肉中掺假马肉、鸭肉等）中。但因为肉品组成成分复杂，肉品拉曼光谱数据量较大且复杂，因此多需要结合化学计量学方法提取相关特征信息4、 拉曼光谱无损快速检测技术在冷冻肉中的应用-以酸价、过氧化值检测为例冷冻肉蛋白氧化可以直接引发肉质变色，脂肪氧化使其营养、味道、质构和外观发生改变，蛋白氧化程度和脂肪氧化程度是评价冷冻肉贮藏期内品质变化的重要指标。酸价是评价猪肉脂质水解的指标，可以综合反映脂质水解氧化程度，过氧化值是反映油脂和脂质氧化状态的最常见指标之一。本研究实例基于拉曼光谱技术和化学计量学技术研究冷冻猪肉在冷冻贮藏过程中的酸价和过氧化值的变化，从脂肪氧化角度研究冷冻猪肉在贮藏过程中的变化规律，建立拉曼光谱快速预测冷冻猪肉酸价和过氧化值的快速无损检测方法，为快速预测判断冷冻猪肉品质和贮藏时间提供一定技术支撑。具体地，对宰后冷却成熟胴体分割取下猪IV号肉，并将其分成750±100g的样品，用保鲜膜进行密封包装，在-30℃环境下进行快速冻结，并立即在相对湿度90%~95%、温度-18℃以下的冷藏库中储存，冷藏库温度一昼夜升降幅度不超过1℃。选取冷冻猪IV号肉贮藏过程中的不同时间点进行检测，以冻结后入冷藏库前作为0d，分别选取0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 d 13个时间点进行酸价、过氧化值检测和拉曼光谱检测。如下图为样品表面脂质拉曼光谱预处理后的平均值和最大值、最小值光谱曲线。样品表面脂肪的拉曼特征峰集中在1000-1800cm-1和2800cm-1附近，其中1064和1124cm-1为C-C键伸缩振动，1300cm-1为CH2弯曲振动，1443cm-1为CH2剪切振动，1658cm-1为C=C伸缩振动，1745cm-1为C=O伸缩振动，2725、2834和2860cm-1为CH3的对称振动，这些均为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的特征峰，可以表征脂肪的饱和程度，在一定程度上反映脂肪的氧化程度可以看出在特征峰位置上，拉曼强度在特征峰位置上与酸价和过氧化值大小呈现一定相关性。本研究中，酸价和过氧化值最大值和最小值分别对应同一个样品。经比较原始光谱、经过airPLS、SG-5点平滑、SNV、SG-5点平滑+airPLS、SNV+airPLS预处理后光谱经PLSR建模分析发现，经过SNV+airPLS预处理后的酸价、过氧化值PLSR预测模型效果最好。对经过SNV和airPLS预处理的拉曼光谱数据应用CARS算法，选取特征拉曼位移，建立CARS-PLSR的特征拉曼位移处的拉曼强度预测酸价和过氧化值模型。随着样品运行次数的增加，单个酸价值和过氧化值的PLSR模型保留的样品拉曼位移变量数逐渐减少，且减少的速度由高到低，表明变量筛选过程是粗筛到细筛的。当运行次数达到一定值时（酸价值运行38次，过氧化值运行35次），与预测酸价值和过氧化值的大量无关拉曼位移变量被剔除，交叉验证均方根误差（RMSECV）值最小，表明PLSR模型的预测能力最强，最终选取出变量子集和酸价值、过氧化值预测相关的特征拉曼位移变量，分别为53和58个拉曼位移变量，分别为总变量数的2.93%和3.21%。可以看出，预测酸价和过氧化值的特征变量分别集中在495、1064、1124、1300、1443、1658、2834、2860 cm-1和1064、1124、1300、1443、2834、2860 cm-1拉曼位移附近，表明1064、1124、1300、1443、2834、2860cm-1拉曼位移处代表的信息（C-C键伸缩振动、CH2弯曲振动、CH2剪切振动和CH3的对称振动）均对预测酸价和过氧化值变化贡献较大，但495 cm-1和1658cm-1处代表的COC的对称变形和C=C伸缩振动仅对酸价的预测贡献较大。CARS筛选拉曼特征变量CARS-PLSR预测酸价和过氧化值结果5、 小结拉曼光谱作为一种分子散射光谱，在肉品品质检测方面具有无损、快速、指纹性、半定量的优势，但其应用环境较为复杂，需要应用多种分析方法，有效提取特征信息，以便提高拉曼光谱检测肉品品质指标的准确性，扩大应用范围。作者简介中国肉类食品综合研究中心动物源性食品研究部工程师，长期致力于生鲜肉品快速无损检测研究，参与多项“十三五”、“十四五”国家重点研发计划项目，发表相关论文10余篇，申请发明专利10余件，登记软件著作版权3项，参与制订国家标准《GB/T 41366-2022畜禽肉品质检测 水分、蛋白质、脂肪含量的测定 近红外法》等多项标准。

1月21日，内蒙古包头市稀土高新区新冠肺炎防控工作指挥部发布最新消息。1月20日，根据包头市进口冷链产品“一批一检、随到随检、不检不售”机制要求，在例行售前检测中发现，包头稀土高新区润恒物流城和昆区包钢冷库一批进口冷冻猪前肘中部分检测呈阳性，该批次进口冷冻猪前肘全部货物已封存，未流入市场，企业已暂停营业，相关人员和企业全体员工核酸检测均为阴性。包头市立即启动疫情防控应急响应，第一时间封闭涉疫冷库，对货物进行封存，外围场地环境进行彻底消杀，对该冷库管理人员、司机、搬运工及相关接触人员进行集中隔离医学观察，对上述人员和涉事冷库所在市场全体从业人员开展核酸检测，检测结果均为阴性。自从全国多地先后出现从冷链食品外包装，或冷链环境中检测出新冠病毒阳性后，冷链食品还能不能放心吃，特别是进口冷链食品敢不敢买，就成了很多消费者关心的问题。在这里提醒市民朋友，尽量避免网购、代购进口商品，减少传播风险。如需购买，一定要去正规超市，因为正规的进口冷链食品，一般都要经方舱实验室24小时检测，保证食品安全。同时要增强自我防护意识，勤洗手、戴口罩，在外做到不扎堆、少聚会、保持安全社交距离。

冷冻干燥（也称为冻干）行业对生产力和盈利能力的需求正在增加。这种增加促使业内从业者考虑冷冻干燥与喷雾干燥相比的优势。因此，在本文中，我们在考虑两者的优势，以帮助您选择最适合您的项目和产品的干燥技术。冷冻干 燥or喷雾干燥如何抉择？ 干燥在生物制药行业被广泛认为是保存各种药物制剂和生物制品的首选方法。当液态稳定性不足、储存要求过于严格或需要固体形式的产品以延长保质期或实现不同气候和环境之间的运输时，就需要使用合适的干燥技术。 冷冻干燥无疑是各种材料和应用中公认的“首选”干燥工艺。然而，由于成本、API的可用性以及有时加工和生产量，对替代方法进行评估以确保使用最适合产品和/或项目的干燥方法。 *的冷冻干燥替代方法是喷雾干燥。喷雾干燥具有多种优势。尽管与冷冻干燥相比，它是行业中的新手，但它展示了在可扩展级别（连续而不是逐批处理）处理更高吞吐量的能力。因此，喷雾干燥也可被视为产品干燥的可行选择，具体取决于相关加工要求和产品应用。两者的干燥过程冷冻干燥冷冻干燥的原理涉及以受控方式对产品进行初始冷冻，以控制冰晶结构。 然后将其置于真空中，在真空中进行升华（或初步干燥）以去除未结合的水。接下来是二次干燥以升华结合水，将材料降至用户定义的残留水分水平。此阶段的目标是结合水而不是未结合/游离水，因此需要更多的能量来通过将搁板温度提高到+20°C或更高来驱动该过程。当加上低气压时，它会导致冰直接变成水蒸气（通过液相），这个过程叫做升华。 根据在给定冻干周期中干燥的样品的性质，温度和真空之间的微妙平衡对于确保在干燥后生产成功的批次而不影响产品功效和活力至关重要。为实现这一点，不同类型的产品及其体积可能需要根据其固有的样品特性进行12小时到5天的冷冻干燥。喷雾干燥喷雾干燥通常被认为是一个更简单（和更快）的过程，涉及在一个步骤中将液体制剂转化为干粉。溶液被雾化成细小的液滴，然后在一个大室中使用热气体快速干燥。然后用旋风分离器收集所得干燥颗粒。尽管根据经验，喷雾干燥比冷冻干燥更快且更便宜，但其中一个显着缺点是它需要高加工温度和剪切力。当然，在受到严格控制的制药和生物技术行业中，这些是许多客户力图避免的，在这些行业中，有效性的可行性和工艺参数与敏感的 API 和配方相关；因此，喷雾干燥更适合用于相当耐寒的产品。冷冻干燥中的产品温度在初级干燥中通常低于0°C，在二级干燥中通常为20-30°C，而喷雾干燥中的产品温度通常高于 80°C。在这些较高 (80°C) 温度下工作的直接影响可能是干燥后样品质量在固有产品特性方面的整体损失，例如：1.功效/生存力；2.味道/气味/颜色；3.一致性；4.营养价值，即食品相关产品中的营养素；5.生物产量—更高水平的细胞（即细菌）对数减少；6.蛋白质降解。 行业中的应用这两种工艺都可用于广泛的应用。例如，冷冻干燥通常用于保存不同类型的细胞、精细化学品、实验室试剂和注射疫苗，以及食品工业和乳制品。因为它通常是用直接装在小瓶或其他容器中的产品进行的，所以这种加工方法最适合干燥后不需要进一步加工的配方；此外，小瓶可以在冷冻干燥机的原位密封，从而避免循环完成时的潜在污染。另一方面，喷雾干燥更常与批量加工相关，而不是基于小瓶的加工。 然而，一个普遍的误解是喷雾干燥仅适用于食品和稳定的原料药，而当代研究表明它可能是用于某些复杂产品（例如微囊化细菌和纳米颗粒）的有效方法。 效率、质量与成本人们普遍认为与喷雾干燥相关的成本低于冷冻干燥的成本，这使得该技术成为某些市场感兴趣的技术之一。与冷冻干燥相关的分批形式不同，喷雾干燥对更大的吞吐量潜力更开放，可以被视为“连续过程”。此外，冷冻干燥的优势在于产品的稳健质量。 精确控制低加工温度可*限度地降低产品固有特性的任何风险，例如塌陷、共晶熔化或超过玻璃化转变温度，从而使冻干产品加工成最高质量。生物制药在喷雾干燥过程中可能会受到剪切应力，再加上所需的高加工温度会使蛋白质等化合物不稳定并损害产品性能，*降低产品功效。总结总之，两种产品干燥工艺方法在正确使用且适用于合适的产品时都是有效的。为了在包括干燥阶段的产品加工中获得*结果，*决定哪种方法最适合项目或持续加工需求的因素将是*产品的质量及其如何到达*用户 。

苏州市莱顿科学仪器有限公司 www.sepu17.cn www.laidun17.com www.labhc.cn 电话：0512-66325740 传真：0512-68027230 TGL-16台式高速冷冻离心机（带NO.1角转子） 惊爆价：RMB10500.00促销，数量有限，欲购从速。。。。。。 原价：RMB21800.00 TGL-16台式高速冷冻离心机产品的特点： · 体积小巧，节约实验室空间。 · 采用全钢结构，不锈钢离心腔。 · 直流无刷电机驱动，运行平稳，宁静。 · 触摸面板、大屏幕液晶屏显示。 · 运行中可随时更改参数，无需停机。 · 自动计算并同步显示离心力RCF值。 · 设有短时离心专用点动键。 · 10档加减速控制，最快升速25秒。 · 15组程序存储空间，用户可自由编程，调用。 · 电子门锁。 · 采用进口制冷压缩机组，确保最高转速下温度保持在4℃以下。 · 故障自诊断系统，运行中检测到超速、转速丢失、超温、门盖异常开启等故障，立即减速停机，提高仪器安全性能。 TGL-16台式高速冷冻离心机 技术参数 型号 TGL-16 支持电源 AC 220± 22V 50Hz 10A 温度精度 ± 2℃ 最高转速 16000r/min 总功率 600W 最短加/减速时间 30s/25s 最大相对离心力 17800xg 整机噪声 进口高性能压缩机组、无氟制冷剂 转子参数 转子号 转子订货号 名称 容量 最高转速 最大相对离心力 挂杯、挂架、吊篮订货号 名称 规格 适配器订货号 名称 规格 NO.1 809100 角转子 12x1.5ml 16000r/min 17800× g / / / 805005 适配器 0.2ml 805004 适配器 0.5ml TGL-16台式高速冷冻离心机

目前冷冻固定是固化细胞成分而不导致显著结构变化的唯一途径，而高压冷冻仪能够捕捉精细结构和细胞动力学的错综变化。高压冷冻结合光刺激是您发现奥妙的平台：同步到毫秒的冻结和刺激能够冻结您最感兴趣的那一刻 以纳米尺度和毫秒时间精度冻结和解析高动态过程在高压下冷冻固定您的含水样品，并发现世界的秘密为什么采用光刺激？同步光刺激和高压冷冻让您能够以纳米级的分辨率和毫秒级的精度来查看高动态过程或光敏样本的结构变化。这将为生命科学和工业领域的研究人员带来新的可能性。将光刺激施加在任何光敏化合物上，例如洗剂、化妆品或食品以及光活化的样本（如蛋白质或各种生物样本）推动我们对高动态过程（如突触神经传递）的理解。左： 冻结的防晒乳液，奥地利维也纳自然资源和生命科学大学 d. pum 教授和奥地利维也纳徕卡显微系统 c. tomova, s. mimietz-oeckler | 右：对称突触，德国柏林夏丽忒大学医学院 shuwen chang 医生为什么采用徕卡 em ice？因为它是唯一能够以毫秒尺度冻结动态现象的工具因为它是唯一完全集成了光刺激的高压冷冻仪因为它的功能为生命科学和工业领域的研究人员带来新的可能性因为它是唯一一款允许冷冻 9 个后续样本的高压冷冻仪因为它是唯一一款能够为您提供最舒适操作的高压冷冻仪选择徕卡 em ice；因为它是您在您的领域找到颠覆性发现的平台。新工具，新视角。五种颜色蓝光、紫外光、绿光、红光和琥珀光：您可以使用不同波长的 5 种 led 模块来激发您的样本。光刺激的完全整合造就了光脉冲之间的精确关系（即从刺激到冻结时间）只需一次点击即可将 led 模块连接到仪器。每个模块都具有不同的波长，并自动由软件识别，记录在日志文件中专注于您的样本您只需一步操作即可在徕卡 em ice 中加载样本。当您关上装载台的盖子时，就会触发完美对齐的卡盒组件和冷冻过程不需要额外的操作：加样和冷冻过程完全自动化在实际冻结前一秒钟您都可以观察和处理样本提高效率使用徕卡您可以快速、高效地工作。从冷冻循环中恢复只需要一分钟 - 无需等待样本储存杜瓦以 ln自动重新填充 无需维护 使用 3 个可容纳多达 3 个不同样本的位置执行多达 9 次连续冷冻循 选择每个位置的样本数量，可编程旋转并区分样本和条件ln杜瓦瓶自动排干无需操作灵活并可随时升级徕卡 em ice 为您带来您所需要的研究灵活性。定义您的显微镜配置徕卡 s6 e或徕卡 m80和环境控制（装载站、工作台和室内温度控制）随时升级仪器成光刺激模式可随时在您需要的时候升级环境设置（工作台加热和/或环境室）所有的升级（光刺激模块和环境设置）可以直接由徕卡服务团队在您实验室完成。您并不需要将仪器返回工厂。环境责任我们的电子显微镜样品制备系统不仅符合最高的技术和人体工学的需求，而且其设计对环境影响最小。每天的 ln消耗量（包括设备冷却）仅为 30 升，这比以前的机型大约少了 65%冷却过程中 ln 的消耗量比之前的机型减少了大约 70%压力和冷却同步不需要使用酒精或其它液体徕卡 em ice 采用可持续包装：多次使用包装箱，内含在工厂中运输以及送货给客户的过程中使用的斜坡道。该包装于 2014 年 11 月被授予“智能包装”奥地利国家奖。我们采取负责任的行动，并在 2015 年获得了 din en iso 14001 环境管理认证。开发徕卡 em ice 的团队在 em 样本制备方面拥有合计 145 年的经验他们团结合作，共享一个愿景为您的工作提供完美的仪器！

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网

2022年，我国全面启动土壤“三普”工作，对全国所有土壤进行普查建库。根据《HJ 834-2017土壤和沉积物半挥发性有机物的测定气相色谱-质谱法》和《HJ 1021-2019 土壤和沉积物 石油烃(C10-C40)的测定 气相色谱法》标准相关要求，土壤样品需采用冻干法进行样品干燥。单次分析测试过程中，半挥发性有机物测定往往需要至少20g冻干后土壤样品、石油烃测定往往需要至少10g冻干后土壤样品，并且根据相关质控等要求，需留出复验样品量，因此一般单个土壤样品至少需要冻干60g。　　在土壤样品的干燥过程中，如若土壤样品水分大于30wt.%则需要进行离心处理除去大量水分。样品在进入冻干前，需要进行预处理，其处理过程中所需工具主要有铲子、搪瓷盘、尼龙筛、玻璃培养皿、塑料薄膜、空气压缩机等。　　在搪瓷盘铺上塑料薄膜，将样品瓶中的土壤样品平铺在搪瓷盘中混匀后，以四分法取对角土壤样品。　　　　然后将土壤样品装入培养皿(d=90mm)中，每个培养皿盖上塑料薄膜，防止交叉污染。在薄膜上扎小孔避免影响样品干燥过程中的水分升华。冻干后样品经过筛分后分别获得20目、60目的土壤样品，每个样品筛分结束后用空气压缩机冲洗筛子。　　采用新芝的SCIENTZ-50YG，土壤样品经12小时冻干后，干物质含量≥99%，单机处理样品数量最多可达64个。　　　　钟罩款/原位款冷冻干燥机的土壤样品处理应用场景　　土壤样品经预处理后，在下班前放入冻干机，第二天上班即可过筛、分袋进行后续分析，提高时间利用率及样品处理效率。　　Advantage　　土壤样品冻干优势　　留存率高：干燥过程中可保留易挥发物质，保持土壤性状，使检测结果更精确。　　含水率低：冻干后样品含水率低，样品酥脆，便于研磨。　　简单高效：是真空干燥、模拟自然风干燥、晾干及烘干效率的几倍。　　上样量大：一台专业型设备一天可制备上百个土壤样本，一台设备即可满足样本前处理的需要。　　避免交叉污染：可完全避免不同批次及同批次的交叉污染。　　方便快捷：对于半挥发性有机物检测，专用的土壤冻干瓶即可用于采用，也可用于冻干，还可以用来封存样本。　　　　部分应用场景　　What　　什么是土壤|“三普”　　土壤普查是对土壤形成条件、土壤类型、土壤质量、土壤利用及其潜力的调查，包括立地条件调查、土壤性状调查和土壤利用方式、强度、产能调查。普查结果可为土壤的科学分类、规划利用、改良培肥、保护管理等提供科学支撑，也可为经济社会生态建设重大政策的制定提供决策依据。　　第三次全国土壤普查是一次重要的国情国力调查，对全面真实准确掌握土壤质量、性状和利用状况等基础数据，提升土壤资源保护和利用水平，落实最严格耕地保护制度和最严格节约用地制度，保障国家粮食安全，推进生态文明建设，促进经济社会全面协调可持续发展具有重要意义。　　2022年，启动土壤三普工作，完成技术规程制订、工作平台构建、外业采样点规划布设及培训宣传等工作，在31个省(自治区、直辖市)选择若干个县开展全面试点。对重点区域开展盐碱地调查，完成全面盐碱地普查。　　2023-2024年，各省(自治区、直辖市)全面开展普查，2024年底前完成全部外业采样和内业化验等工作，初步建成省级土壤普查数据库与样品库。　　2025年，完成省级普查成果汇总、验收，初步建成国家级数据库、样品库，形成全国耕地质量报告和土壤利用适宜性评价报告等，汇总形成全国土壤普查各类成果。　　Brief Introduction　　土壤样品分析流程　　土壤样品需要经过“样本采集与保存-试样制备-样本分析”三个过程进行土壤性状分析，依据不同的土壤类型及应用方面选择不同的土壤检测标准，例如：环保方面主要遵循《HJ/T 166-2004 土壤环境监测技术规范》、农用地重金属含量检测遵循《GB-15618-2018 土壤环境质量-农用地土壤污染风险管控标准(试行)》、企业用地依据建筑用地标准《GB36600-2018建设用地土壤》标准等。　　　　样品制备过程主要有如下图所示，有“脱水-提取-净化-浓缩”四个过程。在具体样品制备过程中，需针对不同的样品检测要求，以不影响目标污染物分析为选用原则将不同的制备过程相结合。　　　　新芝冻干系列全家福　　　　新芝土壤全家桶*　　▼End

图中展示的就是构成酵母线粒体大核糖体亚单位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各个组成蛋白质。Amunts等人根据利用低温冷冻电镜技术获得的酵母线粒体大核糖体亚单位及完整核糖体的结构图谱，一个个地合成出了上述这些组分蛋白。这个经过不断完善的结果与根据X线晶体成像技术获得的原子模型非常吻合。 　　先进的低温冷冻电镜(cryo&ndash electron microscopy)技术让我们获得了大量高分辨率的蛋白质结构图。 　　结构生物学(structural biology)研究的主要目的就是获得用于构成活体细胞的各种各样大分子(macro-molecules)生物组件的高分辨率图像信息。该研究主要依赖的技术手段就是X线晶体照相术(x-ray crystallography)以及核磁共振光谱分析检测技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不过这两种技术都有各自的局限性，比如X线晶体照相术只能够对生长得极为有序的三维结晶进行观察，而核磁共振光谱分析检测技术则要求被检测样品的纯度非常高，不能够有重叠峰出现。有很多生物大分子相互结合、组装之后形成的都是非常大的，或者非常不稳定、比较罕见的结构，都不太适合用上述这两种技术进行分析和检测。单粒子电子显微镜技术(Single-particle electron microscopy, EM)则能够观察少量非结晶样品，获得高分辨率的结构图谱。 　　使用单粒子电子显微镜技术可以获得任意排列方向的分子复合体( molecular complexes)的结构图像。该技术会从每一幅图像中选出单个的复合体(粒子)，然后借助计算机来判断它们的排列方向。最后将各个不同视角的图像组合在一起，得到该分子的三维立体图像。不过由于高能电子束会对生物大分子起到破坏作用，打断分子内的共价键(covalent bonds)，并且诱发一系列级联式的有害化学反应，所以这种放射性损伤效应给单粒子电子显微镜技术带来了极大的局限性，在实验时用来记录影像的电子束的能量受到了非常大的约束。 　　20世纪80年代，Dubochet等人报道了一种单粒子电子显微镜技术革新成果，将该技术引向了高分辨率成像之路。他们在低温条件(cryogenic conditions)下将待检样品放在一层薄薄的、透明的冰上用单粒子电子显微镜进行成像观察。这种方法就是所谓的&ldquo 低温冷冻电镜技术(cryo&ndash electron microscopy, cryo-EM)&rdquo ，他能够对含水的粒子(hydrated particles)进行直接成像。低温除了具有这些优势之外，还能够减少电子束对样品产生的放射性损害。不过电子束的照射量还是不能够太大，只有这样才能够清晰地反映出分子结构的细节，获得高质量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三维结构图像。由于将每个分子的多张图像信息组合在一起能够更进一步地降低图像的信噪比，所以，对数万、乃至数百万个蛋白质复合体进行分析就会产生数十万张图像。 　　不过依靠低温冷冻电镜图像来判断生物大分子的结构给计算机处理分析工作带来了一大挑战。在借助多图像组合平均手段来改善信噪比时，必须知道每一颗粒子的方向，但是由于信噪比太低，我们对这些粒子方向的判断又明显感觉准确性不够，这就形成了一个矛盾。要解决这个问题，最成功的方法就是&ldquo 重复(iterative)&rdquo ，质量高的图像能够给出更准确的方向信息，而这些方向信息又可以帮助我们获得更高质量的图像。 　　直到最近这一段时间，绝大部分单粒子低温冷冻电镜图片的分辨率都非常低，连10埃都达不到，所以很多人都将这种技术嘲笑为 &ldquo 一团浆糊学(blob-ology)&rdquo 。蛋白质二级结构中的&alpha 螺旋(&alpha helices)结构只有在分辨率达到9~10埃，甚至更高分辨率的情况下才能够看清 而另外一种二级结构，&beta 折叠(&beta strands)结构则只有在分辨率达到4.8埃以上时才能够看清。达到3.5埃的分辨率，就可以为蛋白质或核酸等生物大分子构建原子模型(atomic models)，将各种目前已知的核酸结构或氨基酸结构填入其中了。如果要了解蛋白质复合体形成时发生的各种化学变化，就必须获得原子级别分辨率的细节信息。低分辨率的结构信息也不是一无是处，当在与高分辨率结晶图像相互配合、印证，用来判断组成复合体的各种不同组分时更加有意义。因此，即便分辨率较低，低温冷冻电镜技术也还是帮助科学家们解决了很多生物学难题，比如解析出了与其他辅因子共同结合的核糖体的结构问题，以及构象只能够维持片刻时间的核糖体瞬时结构等问题。 　　在过去的三十年，低温冷冻电镜设备取得了长足的进展，在样品制备、成像、计算机处理等实验技术方面有了一定的提升，这些使低温冷冻电镜成像技术的分辨率有了极大的提高。高度连贯的场发射电子枪(Highly coherent feld-emission electron guns)也使保留焦点以外的图像的高分辨率信息成为可能，这对于单粒子低温冷冻电镜非常有帮助。这种技术创新帮助科研人员获得了20面体病毒粒子(icosahedral virus particles)的图像，而且清楚地看到了其中的&alpha 螺旋结构。由于这种病毒是高度对称的，所以比较容易生成高质量的、最佳分辨率的低温冷冻电镜图像。 　　随着研究人员不断地开发出更稳定的载物台、更好的显微镜抽真空技术，以及自动化的数据采集系统，这一切的技术进步都让我们能够获得更多、质量更好的电镜图像，因此才能够得到高质量的、能够对其中的氨基酸侧链进行解析的二十面体病毒粒子三维结构图像，以及分辨率达到5埃的核糖体结构图像。不过在对更小一点的非对称粒子的解析工作中还是很难解析到&alpha 螺旋结构。 　　最近在低温冷冻电镜设备领域取得的最大进展就是引入了直接检测设备(direct detector device, DDD)照相机。这种DDD设备能够直接在传感器上记录图像，从而绕过了传统的、需要闪烁设备和光纤的电荷耦合装置(charge-coupled device, CCD)探测器，以及其他一些在用摄影胶片(photographic film)记录图像时必须要经过的繁杂的处理过程。因此，图像的信噪比也得到了极大的提升。在分辨率方面的提升也与之前的一些革新手段相当。在使用了DDD设备之后，还有可能在电镜图像中直接构建原子模型，甚至能够在最具挑战性的检测工作中进行&alpha 螺旋和&beta 折叠的解析工作。 　　DDD设备的引入还在另外一个方面对低温冷冻电镜的图像起到了改善作用，凭借的就是该设备极快的读出速度(readout rate)，该读出速度能够发现被冰包裹的被观测粒子在电子束中的运动情况。使用DDD设备不仅能够发现这种问题，还能够解决这种问题，因为现在的电镜就好像是一台摄像机，可以拍摄一段录影，记录整个过程，而不再像以前那样，只是一台照相机，只能够拍摄出一张张固定的图像。 　　有了高质量的图像，又有可以借助计算机对因为电子束而移位的粒子进行矫正的工具，我们就可以获得大量高质量的低温冷冻电镜图像，比如本文开头展示的那张分辨率高达3.2埃的线粒体核糖体亚单位图像，以及下图那张分辨率达到3.3埃的20S蛋白酶体图像和哺乳动物感受器通道TRPV1的图像。 TRPV1的图像尤其值得一提，因为TRPV1蛋白是一种膜蛋白，只有四级对称性(four-fold symmetry)，比核糖体要小一个数量级。所以之前大家一直都认为很难用低温冷冻电镜对该蛋白进行结构解析的研究工作。有了 DDD成像技术、更好的计算机辅助和生物化学技术之后，Liao等人终于在某些区域获得了分辨率高达3.4埃的图像，从而有机会开展原子建模工作，在整个结构生物学(structural biology)发展历史上写下了重重的一笔。 　　单粒子低温冷冻电镜结构解析图。左图展示的是随机排列的蛋白质粒子在电镜下的图像，这些图像经过计算机处理之后可以用来计算大分子复合物的三维立体结构图像。由于有了DDD技术，左边的这些图像信息就可以构建出右图中展示的原子模型。图中展示的就是20S蛋白酶体的结构图。 　　乍一看上去，这些成果都好像是特例。比如核糖体里由于含有大量的RNA，所以是一幅高度紧缩的图像，非常紧密，不太容易受到辐射的损失。而20S蛋白酶体拥有14级对称性，所以也非常适于进行低温冷冻电镜成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都拥有一定的内部对称性。但是最近刚刚成功获得的一幅电镜图像就完全不具备上述这些&ldquo 先天优势&rdquo ，这就是分辨率达到4.5埃的人&gamma 分泌酶复合物(&gamma -secretase)的结构图。人&gamma 分泌酶复合物是一种更小的膜蛋白复合体，完全没有对称性。该成果说明，只要待测样品能够准备得恰当，尽可能减少其在结构上的异质性，我们就完全有可能利用低温冷冻电镜技术获得各种蛋白质的三维立体结构图。 　　这些科研新进展恰好出现在低温冷冻电镜技术的低谷期。最近刚刚获得的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型就引起了极大的争议，因为多位电镜专家都坚持认为，这个结构模型不仅在结构上不准确，就连用来进行分析的原始图像也都没有真实地反映该三聚体的真实信息。这场争论也让我们意识到，我们目前的确没有太多的手段对低温冷冻电镜图像的质量进行验证，虽然有一些手段，但是都没有得到广泛的推广和应用，另外也缺乏一套规范，图像的信号非常差，所以也很难判断最终得出的结构图是否就是被测样品的结构。这是一个非常值得关注的问题，不仅仅是因为这次的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型具有重大的科研价值，比如在HIV疫苗的开发工作中会起到非常重要的指导作用等。 　　在结构解析方面还有大量的工作需要我们去完善：方便使用的显微镜相板(phase plates)有助于更好地聚焦，获得高对比度的图像，就好像相衬光学显微镜(phasecontrast light microscopy)那样，这能够让对图像进行信息采集的工作更加简便，而且质量更高。另外在探测器方面也可以进一步提高图像的质量。即便是最先进的探测器也达不到符合理论要求的表现。各种用来进行图像分析的计算机软件，比如用来矫正电子束相关移位的软件，或者对各种粒子进行分类、解读的软件也将会变得越来越强大。新型的样品承载系统会进一步减少电子束对样品的位移作用。更加可靠的、更加强大的验证工具可以让我们更有信心，保证不会纳入质量不高的原始图片素材。虽然现在还不知道低温冷冻电镜技术未来会走向何方，但是有一点是可以肯定的，那就是低温冷冻电镜图像绝对不再是一团浆糊了。 　　原文检索： 　　Martin T. J. Smith, John L. Rubinstein. Beyond blob-ology. Science 8 August 2014 DOI: 10.1126/science.1256358

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)是设计和优化创新药的必要方法。本篇综述将深入探讨冷冻电镜(cryo-EM)在SBDD领域中的快速崛起及它的主要作用，以及阐释它如何为高价值药理学靶点提供丰富的全新结构信息。冷冻电镜技术相比X射线晶体学的主要优势在于，它可以跳过繁琐的结晶步骤，从而直接对玻璃化的生物大分子进行成像；冷冻电镜也可以提供更多维度的信息，包括异质性和动态性。此外，本综述还将讨论冷冻电镜近期和未来的发展，并探讨该技术将在SBDD的管线中产生何种广泛的影响。冷冻电镜时代的SBDDSBDD是一种基于靶点的原子级结构基础信息，针对该靶点进行理性药物设计的研发方法。20世纪80年代，随着Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向药物获批上市，SBDD方法初露锋芒。这一批由FDA批准的药物结合了晶体结构模型与计算机辅助分子建模这两大新兴技术，并成功解决了传统湿实验室的高通量筛选方法(HTS)所面临的昂贵、耗时及低回报率等问题。此后，随着计算技术的不断革新，大量药物靶点的晶体结构得以解析，SBDD方法进入了飞速发展阶段。从1999年到2013年，在113个获批的first-in-class药物中，有78个是基于SBDD方法发现的。尽管SBDD的发展足够迅速，但学界及制药行业内对它的期望显然更高。SBDD方法往往能另辟蹊径，对过往认为不可成药的靶点进行验证，并进一步开发新药。如K-Ras(G12C)靶点，它利用晶体学结构确定了一个以前未知的结合口袋，以避免与皮摩尔亲和力的GDP/GTP竞争。由于靶点验证是发现和开发工作中的主要难题之一，first-in-class药物分子可以为靶点的有效性和疾病应用提供新的见解，例如bromodomain溴结构域抑制剂(+)-JQ-1和I-BET762，这些化合物被成功用于表征和验证溴结构域在各种疾病中的重要性，并催生了大量的临床候选药物。即使是FDA批准的已知药物靶点，临床上也常常需要进一步的SBDD，比如有些药物需要进行更好的选择性的优化设计。厄菲替尼(erdafitinib)在经过针对性的设计改造后，表现出了相对于原先药物对成纤维生长因子受体更高的选择。此外，有一些药物可能需要优化效力或疗效，或提供特定受体亚型的选择性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制剂西波尼莫德(siponimod)对S1P1而非对S1P3的选择性，是提高其在疗效和安全性上优于非选择性S1P抑制剂的关键。该药物靶向S1P1，而非S1P3，此外，许多抗病毒、抗菌和抗癌药物正面临着抗药性问题，SBDD方法能够基于产生耐药性的靶点结构，对药物进行持续改进。SBDD工作的瓶颈在于获取高分辨率的生物靶点结构信息。虽然一些小而有序的生物分子满足X射线晶体学的研究范畴，但大部分已知靶点中的蛋白质，例如跨膜受体或动态复合物，都难以结晶，导致这些靶点蛋白无法利用晶体手段进行高分辨率结构解析。此外，X射线晶体学往往会对靶点蛋白进行改造，如进行截短体设计、引入热稳定性突变或插入一段外源的结构域，从而影响后续的SBDD结构信息分析。还需要考虑的一个关键因素是，大量的靶点蛋白性质上达不到结晶的条件要求。不过，上述的这些难点正被冷冻电镜技术逐一攻克。冷冻电镜技术的分辨率已足够高，其产生的大量数据也可用于计算辅助药物设计(CADD)方法，这也是本综述的核心议题。与X射线晶体学不同的是，冷冻电镜无需对目标靶点进行结晶：纯化过的靶点生物大分子会被瞬间冻结在一层薄薄的非结晶玻璃体冰中，再经由透射电镜成像以记录下几十万到几百万个冷冻电镜颗粒数据，用于重构三维静电势图并对大分子进行精确建模。因此，这种技术很适合于蛋白质复合物、热稳定性较低和动态运动较高的蛋白质以及脂质胶束中的跨膜蛋白质的结构测定。随着分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为药物设计的强大工具。冷冻电镜与药物发现在2014年之前，冷冻电镜几乎无法解析出优于4.0Å分辨率的结构，这直接导致它无法对SBDD工作提供有效的数据支持。然而，在过去的几年里，冷冻电镜方法的爆炸性突破产出了大量高分辨率的结构数据，这在以前是无法实现的。这一质的飞跃要归功于许多技术革新，如用于记录图像的直接电子探测器、改进的计算方法和处理大型数据集的硬件集群，这些技术的飞跃在其他文献内有详细回顾。此外，作为一种直接可视化的技术，冷冻电镜能够快速判断样品的聚集性和稳定性等问题，从而通过遗传和生物化学手段，用互作因子稳定蛋白、或通过优化去垢剂从细胞膜环境中提取膜蛋白等方法来快速改善样品质量。综合以上，在PDB中的分辨率为4.0Å或更高的冷冻电镜结构的数量已经从2014年之前的合计16个增长到仅2020年一年提交1753个新结构的规模(图1, A)。在新上传的结构中，分辨率高于4.0和3.5 Å的比例分别从2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奋人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0Å和2.5Å的冷冻电镜结构比例，分别达到了18%和3%，实现了冷冻电镜结构解析前所未来的突破(图1, B)。为了系统评估冷冻电镜对SBDD领域的影响，我们(作者)调查了2018年美国200种最常用处方药的靶点相关结构数据。72%的靶点在PDB数据库中含有结构信息。细分而言，这些结构信息是通过X射线晶体学技术(42%)、冷冻电镜技术(15%)或两者结合(15%)而确定的(图1, C)。通过冷冻电镜技术解析的靶点涵盖了许多跨膜蛋白，如离子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活态的G蛋白偶联受体(GPCRs)和转运体蛋白(5-羟色胺转运体、NaCl转运体)。图1.冷冻电镜分辨率的提高及其对蛋白质药物结构表征的贡献。(A) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的绝对数量；(B) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的百分比的。(C)2018年200个热门处方药的靶点图，按靶点的结构特征分类；(D)44个热门GPCRs处方药的靶点图，按结构特征分类；(E)2018年200个销量最高的药物的靶点图(作为新药的代表)，按靶点的结构特征分类。2020年的数据是由Njardarson实验室公示的2018年200种最受欢迎的处方药和200种销量最高的药物的蛋白质靶点(如果适用)，然后在PDB中确定相关结构，进行人工筛选。在200多种最常见的处方药中，GPCRs占据了44种，这些药物包括靶向GPCRs的激动剂、拮抗剂和反向激动剂(图1, D；注意，拮抗剂和反激动剂在药理学上不同，但在这里我们(作者)把它们统一归为拮抗剂)。这些GPCRs中的32个(73%)已经进行了某种形式的结构解析，包括与拮抗剂(44%)或激动剂(7%)结合的晶体结构，与激动剂(9%)结合的冷冻电镜结构，或由X射线晶体学和冷冻电镜手段共同进行的结构解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度动态结构使其难以获得高质量的晶体，因此大多数的GPCR晶体结构都是与拮抗剂结合后才得以进行结构解析的。综上所述，冷冻电镜技术在针对市场上已经存在多年的处方药中中具有深刻影响。为了更加深入了解冷冻电镜技术在未来药物发现中的作用，我们(作者)还调查了2018年取得最高利润的200种药物，以代表那些市面上新进发现的药物(图1, E)，我们简称新药。这批新药和之前提到的那些最常用的药物之间存在明显的差异。相当一部分新药已经用晶体学进行了表征，反映了结构数据在当今药物研发工作中的重要性：即便不是由结构驱动的，也很少有不追求结构的情况，因为结构信息可以为先导化合物的优化和进一步发现提供关键数据。此外，考虑到漫长的药物开发时间，冷冻电镜这一最近几年才崛起的新技术在这份名单中的占比虽小，但贡献仍相当可观。这些药物和靶点包括生物制药、离子通道和GPCRs，以及其他不适合结晶的高活性大分子。冷冻电镜对SBDD的贡献解析新型结构虽然有许多FDA批准的药物靶点结构可被X射线晶体学解析，冷冻电镜正在为越来越多的难结晶、甚至不可结晶的靶点打开大门，如分子量更大、更动态的蛋白质和蛋白质复合物。冷冻电镜也显著降低了对细胞内复合体的研究难度，如病原体的核糖体、染色质修饰复合体和转录机器。例如冷冻电镜技术近期解析了一种与线粒体体RNA聚合酶复合体相关的first-in-class 抑制剂的结构。值得注意的是，在膜蛋白领域，冷冻电镜的贡献无可比拟。不管是传统的药物，还是新型处方药，很多药物靶向针对GPCRs、离子通道和转运体蛋白。然而，利用X射线晶体学手段来解析膜蛋白的结构非常困难。尽管脂质立方结晶在GPCR领域取得了一些进展，但在结晶过程中，GPCR蛋白通常需要进行热稳定突变，或融合其他蛋白进行改造，以促进晶体的形成。并且，为了获取某种改造后的稳定的构象，还需要对克隆构建、实验方法及条件进行大量繁琐复杂的筛选。相比之下，冷冻电镜结构可以直接用来解析经过去污剂或纳米盘处理后的在生化上性质稳定的膜蛋白，并获得处于或者接近生理状态的蛋白的结构。冷冻电镜的在解析庞杂的膜蛋白的结构中能力势不可挡，并且已有大量的高分辨率结构被成功解析。长久以来膜蛋白一直都是获批药物的热门靶点，它们的结构也只是近期才被冷冻电镜揭示(图2)。图2. G蛋白偶联受体、转运体(上排)和离子通道(下排)，每个受体有相应的FDA批准的配体分子(蓝框)。利用冷冻电镜解析膜蛋白结构的突出进展，部分原因受益于新试剂的设计和使用。这些试剂可以在体外纯化过程中维持跨膜蛋白的结构，在冷冻制样过程中保护蛋白，并为高分辨率的结构解析提供均质样品。去垢剂如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地从细胞膜上溶解跨膜蛋白，并维持蛋白质的生理状态构象。去垢剂的使用也会产生一些问题，如去垢剂形成的空胶束和与包裹蛋白质的去垢剂同时存在存在会引起样品的不均一，对后期的数据处理处理产生影响；也可能会导致冷冻样品制备时的气液界面收到破坏，产生一些不好的结果。脂质纳米盘是去垢剂的一种替代品，原则上可以为结构和生物物理研究提供接近胜利状态的脂质双分子层。脂质纳米盘在膜蛋白药物靶点上的应用已经非常关键和广泛。举例而言，将纳米盘与冷冻电镜技术相结合，成功阐明了TRPV1和TRPV5离子通道(在TRPV1的情况下，脂质对抑制剂的结合至关重要)、GABAA配体门控离子通道、人类P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin复合物的高分辨率结构和机制。关于纳米盘的进一步介绍可查阅。冷冻电镜还可以用来解析嵌入脂质体中的蛋白质的结构，允许在更接近生理状态的的电化学梯度中对离子通道以及孔蛋白进行可视化研究。在过去的几年中，冷冻电镜也在生物制药领域产生了巨大影响。在较新的药物中，生物制药的占比正越来越高。如果仅将目光聚焦于药物靶点识别这一领域，生物制药的结晶技术确实称得上有所改善。然而，冷冻电镜已经为一些关键的生药物研发提供了基于全长蛋白的结构信细节息胰岛素受体一种二聚化的酪氨酸激酶受体蛋白，在调节人体的葡萄糖平衡方面起着关键作用。胰岛素受体信号通路的失调会引起一些疾病，如II型糖尿病，全球约有9.3%(4.63亿人)受到影响两个独立的研究小组利用冷冻电镜在胰岛素受体结构解析方面取得了突破进展；第一个小组以4.3Å和7.2Å的分辨率分别解析了与一个或两个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构，第二个小组以3.1Å的分辨率获得了与四个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构(图3, A)。这些结构解释了胰岛素受体结合胰岛素的不同结合位点，以及激活这一关键药物靶点所进行的构象变化。类似的例子比比皆是：从HER2-trastuzamab-pertuzumab复合物到SARS-CoV-2和中和抗体的结构解析，冷冻电镜为生物治疗的新老靶点提供了新的视点，为进一步发现和开发仿制药和first-in-class药物铺平了道路。另一个值得注意的例子是B淋巴细胞抗原CD20，它是治疗白血病和自身免疫性疾病的一个重要的治疗靶点，尽管其功能作用仍不清楚。尽管CD20的分子量较小，只要35kDa左右，但分别与单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法图单抗(ofatumumab)和奥比努单抗(obinutuzumab)的Fab结合形成复合物后，都解析获得分辨率较高的CD20复合物结构(图3, B)。负染结果显示，利妥昔单抗与CD20结合后，可诱导形成高度有序的高级结构，这一发现对激活先天免疫的补体系统提供了全新见解。由于复合物中的高度动态和跨膜结构域的存在，利用结晶手段结构解析几乎不可能实现，冷冻电镜技术的应用实现了这一可能。图3.冷冻电镜(cryo-EM)在小分子和生物制药发现方面的效用。(A)与胰岛素结合的胰岛素受体(PDB ID 6PXV)和(B)CD20与利妥昔单抗复合物(PDB ID 6VJA)冷冻电镜密度图。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)将小分子PETG精确地建模到β-半乳糖苷酶的冷冻电镜图像中。(D)基于片段的PKM2的发现，冷冻电镜密度允许正确识别和放置发现片段(PDB ID：6TTF)尽管冷冻电镜在膜蛋白结构测定领域已经迈出了一大步，但短板仍然存在。其中一个短板是解析小于50-70kDa的没有明显的胞内或胞外结构域的单体膜蛋白，由于几乎没有胞外结构域特征，因此难以对去垢剂胶束或脂质纳米盘进行降噪处理，以这种方式收集到的数据难以产出高分辨率结构，比如解析没有上下游偶联蛋白的处于非活性状态的的GPCR结构。然而，大量的蛋白质属于这一类型，解析这一类型的的膜蛋白因此也成为了一个重要的研究领域。目前，有一些解决方案正处于研究阶段，且已经取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。随着利用增加融合蛋白、抗体片段、纳米抗体、纳米抗体衍生物或其他支架蛋白以增加靶点蛋白的分子量等方法的应用，预计冷冻电镜在膜蛋白结构测定方面会有更多进展。计算赋能冷冻电镜冷冻电镜单颗粒技术利用数百万个颗粒的可视化投影来重建静电势图，这通常涉及数十万亿字节的原始数据。因此，该方法从计算方法的快速发展中获益匪浅，这些计算方法同时满足了对更高的分辨率的需求并加深了对粒子动力学的理解。然而，与X射线晶体学相比，冷冻电镜在获取配体-靶点复合物的高可信度模型时仍然面临着一些难题。其中一个难题是冷冻电镜难以解析得到高于2.5Å的蛋白结构，而这通常是建模人员能够精确放置配体并解析出结合位点处水分子的最低分辨率。此外，冷冻电镜的结构建模流程与晶体学完全不同：在晶体学中，模型和密度图之间有一套严格而完善的统计测量方法，该方法能够提供和模型精度相关的关键信息。而在冷冻电镜方法中，基于密度图的建模是一个完全独立的过程，仅适用收集的电镜投影来进行密度图重构，然后基于密度图进行结构建模和实空间下的微调。该过程的独立性使得模型的精度被降低了。这一问题在最近已得到改善。此外，两种方法之间还存在一些物理上的差异，如晶体学依赖电子密度图，而冷冻电镜依赖静电势图。这些差异加在一起，使得晶体学的模型验证工具无法应用于冷冻电镜模型。因此，我们可能需要为精确性开发一些新的指标。一种解决方案是使用强大的计算技术和精确的分子力场对大分子及其配体在冷冻电镜结构中的相互作用进行模拟。比如PHENIX软件包结合实空间和傅里叶空间微调和OPLS3e力场的分子动力学模型，从而生成生物分子和小分子的几何统计精修模型。OPLS3e微调工具已经被整合进到我们(作者)的自研软件GemSpot，它将各种计算方法整合为一个工作流程，从而提高冷冻电镜密度图中配体位置的准确性(图3C)。新的计算工具也推动冷冻电镜在基于片段的药物发现(Fragment-based drug discovery)中发挥作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多个不同结构的化合物组成的生物分子靶点中。解析复合体的结构可以解释配体与结合口袋之间关键位点的相互作用，然后可以将其组合成一个先导化合物。然而，这种方法要求配体密度质量高、分辨率高，才能正确区分配体的姿态和原子类型，目前对于冷冻电镜来说还是一个难题。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和颇具治疗意义和挑战性的激酶PKM2的场景中成功地将冷冻电镜用于FBDD。尽管他们为了将配体置放于密度图中，而不得不将干法和湿法实验结合，但他们成功地建立了一个与β-半乳糖苷酶结合的大约150kDa的精准片段模型。更令人印象深刻的是，他们能够从四种化合物的鸡尾酒中确定哪些片段与PKM2结合(图3, D)。因此，不断发展的计算方法为冷冻电镜密度图的构建提供了一个强大的平台，可以在高分辨率下对大分子复合物进行建模。冷冻电镜的快速发展可及性与通量的提升冷冻电镜是极为精密且昂贵的仪器，需要大量的费用和人力成本来搭建、维护与操作。这一特性在很大程度上限制了冷冻电镜的发展，并将冷冻电镜的机时资源集中在了那些受政府资金扶持的大型机构上。因此，在科研界中，冷冻电镜资源的获取门槛极高。然而，这一门槛正在被逐渐降低：许多国家级设施都启动了冷冻电镜人才培养计划，以降低冷冻电镜运维的人力成本。一些大型制药公司也开始进行内部投资，设立最先进的冷冻电镜设施。此外，冷冻电镜设施的可复制性远超晶体学极其昂贵的同步加速器和线性加速器，使得该技术更有发展前景。随着100kV电子束技术的发展，未来可能会出现性价比极高的冷冻电镜，增加其在药物发现领域中的应用场景。鉴于2018年FDA批准的药物中有49%来源于中小型公司，降低冷冻电镜的成本将使冷冻电镜技术得到更广泛的应用。最近对SARS-CoV-2相关蛋白的结构表征证明了冷冻电镜的无限潜力。在病毒爆发后的几个月内，科学家们利用冷冻电镜，以极快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的几种构象，以及它与人源血管紧张素转换酶或许多中和人源抗体片段的复合物的结构。最近获得FDA批准的用于治疗COVID-19的再利用药物瑞德西韦(Remdesivir)与SARS-CoV-2 RNA聚合酶结合的结构也已被冷冻电镜解析。鉴于X射线晶体学一直是病毒RNA聚合酶结构测定的传统方法，对新冠病毒的冷冻电镜结构解析是一个颠覆性的创新，凸显了冷冻电镜的高时效性特点在快速反应研究中的应用。此外，冷冻电镜的分辨率仍在大幅提高，最近的一份报告指出，作为冷冻电镜的代表性复合物结构，去铁蛋白apoferritin的分辨率达到了1.25Å，该分辨率足以对单个原子进行精准定位，在某些情况下甚至可以解析氢原子和质子化态。毋庸置疑，在样品制备良好的情况下，冷冻电镜的不断改进将持续打破结构解析的分辨率记录。冷冻电镜在药物发现和开发方面的应用将进一步受益于该技术的全面自动化。在载网准备方面，一些自动化工具正在出现，以解决不可重复性和样品浪费的难题。这些技术的改进不仅会提高自动化的程度和可及性，还可能解决冷冻电镜载网制备中的其他难题，如减少颗粒在空气及水中的暴露程度。此外，机器学习方法和深度神经网络也是提高颗粒筛选速度和准确性的关键。这些自动化方法甚至有望在未来成为冷冻电镜的核心技术，从而推动冷冻电镜在药物发现领域的发展。主流硬件和软件的改进也有望提高冷冻电镜在SBDD领域的可及性。例如，更高效的检测设备能显著提高冷冻电镜的产能。在一个标准的数据收集过程中，老式的检测器相机可以每次收集1个影像，每小时产生50个影像，而较新的检测器可以每次收集9-16个影像，每小时可以产生超过200个影像，进而转化为每24小时收集的数百万颗粒投影数据。此外，虽然今天许多最高分辨率的结构是用300kV冷冻电镜获得的，但这些机器非常庞大，且前期和维护成本昂贵。在许多情况下，对于单颗粒分析中使用的薄样品，200kV的显微镜可能就足够了，甚至100kV的显微镜也可以用来获得分辨率高达3.4 Å的结构。分子动力学的新窗口结合硬件和数据处理方面的改进，冷冻电镜的潜力将进一步被释放。当X射线晶体学受限于结晶条件而无法解析时，冷冻电镜的低样品需求大幅降低了数据收集的门槛，使我们得以看到样品的构象连续体或一系列不同的能量最低状态，为大分子动力学提供了新的窗口。图4.单一的冷冻电镜数据集，投影的三维分类显示了两种不同的构象，代表了两种不同的G蛋白偶联受体-G蛋白相互作用的状态，代表了两种热力学上可比较的构象。在典型状态下(左边，PDB ID 6OS9)，受体以典型的方式与G蛋白结合，其中核苷酸结合口袋为GTP结合做准备。在非经典状态下(右图，PDB ID 6OSA)，G蛋白异源三聚体与经典状态相比旋转了45°，代表了沿G蛋白偶联途径的中间配体结合受体状态。缩写：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷冻电镜；TM=跨膜螺旋。一些计算工具，例如二维和三维分类以及子区域的重点细化，能够利用数据集内颗粒的异质性来模拟大分子活性成分的运动。在我们(作者)小组最近的一个例子中，对神经紧张素1受体的冷冻电镜单颗粒分析结果揭示了先前识别的G蛋白、激动剂结合状态和G蛋白偶联通路上的一个新的中间状态(图4)。最近，我们(作者)还将AI深度学习网络应用于冷冻电镜数据集，揭示了26S蛋白酶体的构象动态，使解析出的结构细节达到了前所未有的原子级水平。随着分辨率和分类工具的不断改进，我们将获得更精细的构象变化。有了以上这些技术，再加上分子动力学模拟和机器学习方法等计算技术，我们将得以对配体结合的复杂过程进行更精确的建模，从而揭示全新的、可成药的中间状态。结语尽管冷冻电镜已经在SBDD领域取得了飞跃性的进展，但它的潜力远不止于此。在三维分析重构及深度学习算法等领域，若能将计算工具与更大、更高质量的数据集结合并进行训练，我们将能够描述蛋白质甚至其配体的更小幅度、更高分辨率的动态运动。我们还期望冷冻电镜在时间维度上的结构解析方法将使人们对大分子复合物的结合和解离过程有更深了解，为靶向药物的研发提供更多思路和机会。目前晶体学和大多数冷冻电镜结构所提供的只是能量最小值的瞬间结构，但对于开发新的药物作用模式而言，对机制和中间状态的理解至关重要，所以我们若能获取构象的动态信息，则对理性药物设计具有突破性意义。在综合了冷冻电镜的软硬件及方法的快速发展之后，我们可以得出结论：冷冻电镜有望为药物发现和人类健康做出巨大贡献。词表：1. 激动剂一种通过增加受体活性以产生生物反应的物质。2. 拮抗剂(也称中性拮抗剂)一种能阻断激动剂或反向激动剂的物质，在不存在激动剂或反向激动剂的情况下便没有活性

点击此处可了解更多产品详情：生物病理冷冻切片机　　生物病理冷冻切片机 ，是对人体及动植物组织作快速病理切片分析的设备。 它广泛应用于医院、 医学院、法医、动植物科研单位作病理诊断、分析、研究之用。　　　　生物病理冷冻切片机的性能特点：　　1、彩色液晶触摸显示屏，可分别显示切片总数量和切片总厚度、切片厚度、标本回缩值、温度控制及日期、 时间、温度、定时休眠开关机、手动及自动除霜等功能。　　2、人性化休眠功能:在选择休眠状态后，冷冻室温度可自动控制在-5 至-15℃之间，取消休眠后，可以在 15 分钟内达到切片温度。　　3、温度传感器自检功能 ，可自动检测传感器工作状态。　　4、双压缩机为冷冻箱、冷冻台、刀架及样本夹头、组织压平器五点分别制冷。　　5、刀架配彩色刀片推进器及护刀杆覆盖刀片全长 ，安全保护使用者。　　6、配置：X 轴 360° .Y 轴 12°万向旋转卡扣式组织夹头 ，安装组织更加快捷。　　7、防粘组织压平器加入制冷 ，温度可达-50° ，方便急冻组织 ，节省操作时间。　　8、单层加热玻璃视窗 ，有效防止水雾凝结。　　9、手轮定位 360°任意点锁紧功能。　　10、消毒方式： UV 紫外线消毒。　　　　生物病理冷冻切片机的主要组成部分：　　1. 该机上部分为微机控制部分及面板操作 ，温度显示 ，工作状态显示部分。　　2. 中间部分为低温冷冻室 ，为活检组织速冻 ，切片操作部分。　　3. 下半部分为压缩机组制冷部分。　　4. 中后部分为机械传动、 电机驱动部分。【莱恩德新品】生物病理冷冻切片机的性能特点

童艳丽今年的华东电镜会比以往时候来得更晚一些，经历了漫长的等待，终于10月23日在美丽的宜兴市东氿湖畔举行。会上徕卡纳米技术产品经理童艳丽以《连接即未来 徕卡真空冷冻传输系统》为题做了一个专题报告。报告结束后，老师们对此显示出浓厚的兴趣，纷纷前往展台咨询。徕卡真空冷冻传输系统之核心部分EM VCT500设计理念及其在冷冻扫描电镜，冷冻FIB，真空传输等三个应用方向的相关制样流程及应用实例。徕卡EM VCT500样品传输杆是真空冷冻传输系统的核心，它可以与徕卡各种电镜制样设备相连接，依据样品应用需求实现各种方式样品制备；另一方面，它可以与各种外部设备/分析仪器相连接，依据样品应用需求实现各种方式分析检测。 徕卡EM VCT500样品传输杆是一款货真价实的真空冷冻传输系统，可以长时间保持高真空和低温，并且通过一系列紧密的内部硬件设计及图形化操作界面，实现用户直觉化操作，轻松实现真空冷冻传输。 Cryo-SEM应用方向一个经典制样流程： 如需了解更多详情，可咨询徕卡客户服务热线：400-630-7761.

每天关注Cell、Nature、Science(合称CNS)等顶级期刊是小编的日常工作之一。近两年，小编发现，除了“魔剪”CRISPR，冷冻电镜也是这些期刊的“常客”。中国科学家在这一领域取得的成果是有目共睹的，而清华大学无疑是这一领域的“领军者”之一。“冷冻电镜+清华大学=CNS”这个公式虽有点夸张，但也不是毫无根据。　　施一公　　该校的施一公院士、颜宁教授是这一领域的知名科学家。最近，两位学者都有新成果发表在CNS上。7月22日，施一公教授研究组在Science杂志就剪接体的结构与机理研究发表两篇长文，题目分别为“Structure of a Yeast Activated Spliceosome at 3.5 A Resolution”和“Structure of a Yeast Catalytic Step I Spliceosome at 3.4 A Resolution”。研究报道了酿酒酵母剪接体激活和剪接反应催化过程中两个重要状态的剪接体复合物近原子分辨率的三维结构，阐明了剪接体的激活和催化机制，从而进一步揭示了前体信使RNA剪接反应的分子机理。　　颜宁　　颜宁教授在5月、8月和9月相继在Cell、Nature和Science杂志上发表了3篇论文。发表于Cell杂志上的论文(题目：Structural insights into the Niemann-Pick C1 (NPC1)-mediated cholesterol transfer and Ebola infection)中，颜宁研究组与中国疾控中心、中科院微生物所高福院士研究组合作，首次报道了人源胆固醇转运蛋白NPC1的4.4埃分辨率冷冻电镜结构，并探讨了NPC1和NPC2介导细胞内胆固醇转运的分子机制 同时还报道了NPC1与埃博拉病毒GPcl蛋白复合体6.6埃分辨率的冷冻电镜结构，为理解NPC1介导埃博拉病毒入侵的分子机制提供了分子基础。　　8月31日，在线发表于Nature杂志上的研究(题目：Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 A resolution)中，颜宁研究组报道了首个真核电压门控钙离子通道的近原子分辨率三维结构，为理解具有重要生理和病理功能的电压门控钙离子和钠离子通道的工作机理奠定了基础。　　9月22日，颜宁研究组与加拿大卡尔加里大学陈穗荣研究组合作在Science杂志上在线发表标题为 “Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodinereceptor RyR2”的研究长文，揭示了目前已知分子量最大的离子通道Ryanodine受体RyR2亚型处于关闭和开放两种状态的三维电镜结构，探讨了RyR2的门控机制。关闭及开放构象的RyR2(图片来源：清华大学医学院)　　高宁& 杨茂君　　除了上述成果外，清华大学近期还发表了另外两篇基于冷冻电镜的Nature论文。5月25日，该校高宁研究组与合作者在Nature杂志在线发表了题为“Diverse roles of assembly factors revealed by structures of late nuclear pre-60S particles”的研究论文。文章报道了位于酵母细胞核内的一系列组成上和结构上不同的核糖体60S亚基前体复合物的冷冻电镜结构，确定了近20种装配因子在核糖体上的结合位置及其原子结构。该校生命科学学院高宁研究员和美国卡内基梅隆大学John L. Woolford Jr教授是这一研究的共同通讯作者。　　9月21日，清华大学研究小组在Nature杂志上发表了最新论文，首次报道了迄今为止分辨率最高的线粒体呼吸链超级复合物—呼吸体的冷冻电镜三维结构。清华大学杨茂君教授和高宁研究员是该研究的共同通讯作者。图注：a，不同侧面呼吸体结构模型及密度。b，复合物I结构模型及密度。(引用自清华大学生命科学学院)　　据清华大学生命科学学院报道，呼吸体蛋白分布于线粒体内膜上，是执行呼吸作用的超大分子机器。哺乳动物呼吸体I1III2IV1是由81个蛋白亚基(70种不同蛋白分子)所构成的分子量高达1.7兆道尔顿的膜蛋白超级复合物。该研究中，科学家小组拿到了结构稳定、均一性好的呼吸体超级复合物，同时验证了一系列小分子化合物对呼吸体超级复合物的特异调节作用，为进一步的药物开发奠定了良好的基础。　　借助冷冻电镜技术，并利用单颗粒三维重构的方法，研究小组最终获得了整体5.4埃的近原子分辨率结构，其中复合物I和复合物III的分辨率达到3.97埃(图a)。这一目前为止世界上所解析的最大也是最复杂的膜蛋白超级复合物结构为深入理解哺乳动物呼吸链复合物的组织形式、分子机理以及治疗细胞呼吸相关的疾病提供了重要的结构基础。　　小编还注意到，在一年前的同一天(2015年9月21日)，杨茂君教授、高宁研究员和该校医学院肖百龙研究员研究组合作在Nature杂志上发表了题为“Architecture of the Mammalian Mechanosensitive Piezo1 Channel”的研究论文，首次报道了哺乳动物机械力敏感离子通道Piezo蛋白的高分辨率冷冻电镜结构。　　中国内地科学家近年冷冻电镜成果一览　　那么，除了清华大学，冷冻电镜在中国其它机构的应用状况如何?它在中国的发展历史是怎样的?有哪些其他科学家发表了代表性的论文?这些问题的答案可以从施一公院士近期发表的题为《Biological cryo-electron microscopy in China》的综述中找到。清华大学王宏伟(Hong-Wei Wang)教授(现任生命科学学院院长)、雷建林(Jianlin Lei)研究员(冷冻电镜平台主管)以及施一公院士是这一综述的共同通讯作者。　　点击以下链接可以查看完整综述：　　http：//onlinelibrary.wiley.com/wol1/doi/10.1002/pro.3018/full　　文章表示，冷冻电子显微镜(cryo-EM)在结构生物学的发展中越来越重要。目前，中国的生物学冷冻电镜(biological cryo-EM)已进入快速发展阶段。这一综述具体回顾了生物学冷冻电镜在中国的发展历史，汇总了目前的使用情况，讨论了这一技术对生物学研究的影响，并展望了它未来的前景。　　该综述列举了近年来(2008-2016)中国内地科研人员发表的多项代表性成果，共计53篇(如下图)，解析了冷冻电镜在染色质组织、免疫反应、离子通道、光合作用、核糖体生物起源、RNA代谢和病毒结构等研究中的应用。在结论部分，作者们表示，尽管冷冻电镜在其它国家也在快速、健康的发展，但是中国的增长速度远超过世界平均水平 并且，这一趋势预计会再持续5-10年。　　特别备注：本文研究成果具体介绍参考自清华大学生命科学学院、医学院官网多篇报道，综述内容编译自原文。　　参考资料：　　施一公研究组在《科学》发表背靠背两篇论文 捕获酵母剪接体两个关键工作状态高分辨率电镜结构　　清华大学颜宁研究组在《细胞》发表论文报道人源NPC1蛋白结构， 并揭示其介导胆固醇转运和埃博拉病毒入侵的分子机制　　高宁研究组《自然》在线发表论文报道酵母核糖体组装前体的高分辨冷冻电镜结构　　杨茂君研究组在《自然》发表论文首次报道了线粒体呼吸链超级复合物结构　　清华大学医学院颜宁研究组等在《科学》发文揭示心肌钙离子通道RyR2长程门控机制的结构基础　　PROTEIN SCIENCE：A family tree of the Chinese electron microscopists　　原始出处：　　Wei Peng1，2，*， Huaizong Shen1，2，3，*， Jianping Wu1，2，3，*， Wenting Guo4， Xiaojing Pan1，2， Ruiwu Wang4， S. R. Wayne Chen4，?， Nieng Yan1，2，3，Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.Science 22 Sep 2016　　Jinke Gu，Meng Wu，Runyu Guo，Kaige Yan，Jianlin Lei，Ning Gao & Maojun Yang The architecture of the mammalian respirasome.21 September 2016

近日，国家质检总局公布了2009年第2批产品质量国家监督抽查质量公告，被抽查的7类食品包括：啤酒、豆制品、碳酸饮料、果蔬汁饮料、婴幼儿米粉、冷冻饮品、膨化食品。其中，冷淡饮品合格率较低，仅83.6%。 　　此次对北京、天津、河北、山西等25个省、自治区、直辖市224家企业生产的318种冷冻饮品进行了监督抽查，有52种产品不合格，其中有42种冷冻饮品微生物指标超标。此次抽查中发现武汉市东西湖常欣冷饮厂生产的老冰棒纯冰糖口味棒冰的菌落总数实测值为160000cfu/g,超标52倍，大肠菌群实测值为2400MPN/100g，超标23倍。含乳蛋白的冷冻饮品的菌落总数应≤25000cfu/g,大肠菌群应≤450MPN/100g，本次抽查中发现长治市郊区雪山冷饮厂生产的小脆筒雪糕的菌落总数实测值为1600000cfu/g,超标63倍，大肠菌群实测值为24000MPN/100g，超标52倍。 　　超范围或超量使用食品添加剂也是造成产品的不合格主要原因。此次抽查发现有19种产品超范围或超量使用甜味剂糖精钠、甜蜜素、安赛蜜。不合格原因主要是用低成本高甜度的甜味剂(糖精钠、甜蜜素或安赛蜜)代替成本较高的白砂糖提高产品甜度。 　　抽查还发现个别产品重金属铅含量超标，蛋白质含量均未达到0.5%。 冷冻饮品产品质量国家监督抽查产品及其企业名单(不合格) 企业名称 产品名称 商标 规格型号 生产日期（批号） 抽查结果 主要不合格项目 廊坊市永盈食品有限公司 雪乐果味冰 　 88g/袋 2009-04-01 不合格 糖精钠,甜蜜素 河北格林新大陆食品有限公司 小神童蛋奶味雪泥 　 75g/支 2009-04-19 不合格 菌落总数,大肠菌群 唐山市利民冷食厂 奶油双棒雪糕 伟艳美 90g/支 2009-04-17 不合格 大肠菌群 深州市得利成冷饮有限公司 冰奶糕牛奶味冰棍 　 90g/支 2009-03-15 不合格 大肠菌群 长治市郊区雪山冷饮厂 小脆筒雪糕 　 35g/支 2009-05-03 不合格 菌落总数,大肠菌群 运城市煜丰食品有限公司夏县分公司 老冰棍（棒冰） 煜丰及图形 80g/支 2009-04-03 不合格 菌落总数,大肠菌群 运城市煜丰食品有限公司夏县分公司 香芋派雪糕 煜丰及图形 75g/支 2009-05-05 不合格 菌落总数,大肠菌群 晋城市博凯冷饮厂 青苹果棒冰 　 80g/支 2009-04-12 不合格 菌落总数,大肠菌群 科尔沁左翼中旗广鑫食品有限公司 大白糖冰棍 　 90g/支 2009-05-09 不合格 菌落总数,大肠菌群,金黄色葡萄球菌 包头市昆区银河冷饮厂 彩球（奶果） 　 130g/袋 2009-04-21 不合格 铅,糖精钠 科左中旗保康杜氏雪糕厂 大白糖冰棍 　 90g±5g/支 2009-04-12 不合格 甜蜜素 通辽市科尔沁区金三牛冷冻食品加工厂 大白糖冰棍 　 90g±5g/支 2009-04-03 不合格 糖精钠 营口市老边区惠凯冷饮厂 南韩布丁(冰棍) 　 50g×5/袋 2009-04-15 不合格 菌落总数,大肠菌群 台安县桑林镇新兴冷饮厂 乡村奶吧冰棍 　 55g/支 2009-04-05 不合格 大肠菌群 海城市大屯镇北雪冷饮厂 冰凉一夏冰棍 　 80g/支 2009-04-16 不合格 甜蜜素 四平绿泽食品有限公司 新大玉米雪糕 　 50g/支 2009-04-12 不合格 大肠菌群 安达市红星食品厂 多味果冰棍 　 90g×4/袋 2009-04-28 不合格 菌落总数,大肠菌群 肇东市鑫北冷冻饮品制造有限责任公司 拔拔冰棒冰 鑫北 90g/支 2009-04-21 不合格 大肠菌群 齐齐哈尔市牛奶公司冷饮厂 魔力鲜橙味雪条 　 70g/支 2009-04-27 不合格 甜蜜素 芜湖市恒丰冷食有限责任公司 真菠萝果汁冰(混合型冰棍) 鸿丰 100g/支 2009-04-19 不合格 甜蜜素 南昌泰康美冷饮食品厂 圈圈脆雪糕 泰康美 70g/支 2009-04-19 不合格 大肠菌群 江西新天地制冰有限公司 奶葡萄雪糕 　 80g/支 2009-03-25 不合格 甜蜜素 淄川区磁村蓝鸽冷食加工厂 老冰棍（含乳蛋白10%以下） 蓝鸽 80g/支 2009-04-20 不合格 菌落总数 潍坊兴旺食品有限公司 鲜奶味雪糕 兴旺狗 70g/支 2009-03-30 不合格 大肠菌群 淄川松龄晨阳食品加工厂 大奶块雪糕 　 80g/支 2009-03-31 不合格 大肠菌群 青岛凯瑞乳业食品有限公司 奶棒雪糕 凯瑞 80g/支 2009-03-15 不合格 菌落总数 洛阳雪达食品有限公司 可乐杯冰淇淋 雪嘉 70g/杯 2009-04-06 不合格 蛋白质,甜蜜素,菌落总数,大肠菌群 禹州市冰世界冷饮食品厂 小脆桶雪糕 冰世界 35g/支 2009-04-11 不合格 菌落总数,大肠菌群 许昌市傻子实业有限公司 苹果棒冰 傻子 80g/支 2009-04-12 不合格 甜蜜素 许昌市魏都区凯利食品厂 香芋葡萄雪糕 凯利 75g/支 2009-04-11 不合格 甜蜜素,菌落总数,大肠菌群 驻马店市冰峰食品有限公司 蚂蚁上树雪糕 天中冰峰 75g/支 2009-04-17 不合格 甜蜜素,菌落总数,大肠菌群 许昌市傻子实业有限公司 雪泥 傻子 80g/支 2009-04-12 不合格 甜蜜素 郑州天雪食品有限公司 黑米糕棒冰 天雪食品 65g/支 2009-04-16 不合格 菌落总数,大肠菌群 禹州市三德合冷冻食品厂 雪糕 三德合 80g/支 2009-03-22 不合格 菌落总数,大肠菌群 武汉市东西湖常欣冷饮厂 老冰棒纯冰糖口味棒冰 　 85g/支 2009-04-13 不合格 甜蜜素,菌落总数,大肠菌群 长沙皇冠冷食有限公司 牛奶多多冰淇淋 湘冠 70g/杯 2009-05-13 不合格 蛋白质,菌落总数,大肠菌群 邵阳宝庆肉类联合加工有限公司 营养快线棒冰 雪妮璐 95g/支 2009-05-02 不合格 糖精钠,菌落总数 湖南立达食品饮料有限公司 香草味蛋筒雪糕 道道 70g/支 2009-05-10 不合格 菌落总数,大肠菌群 湖南省常德天美乐冷冻食品有限公司 纯冰糖棒冰 天美乐 90g/支 2009-05-06 不合格 菌落总数,大肠菌群 邵东县两市镇新华冷饮食品厂 相思红豆冰棒 　 85g/支 2009-05-05 不合格 菌落总数 东莞市鸿昌食品有限公司 芋满天下雪糕 冰之岛 60g/支 2009-04-17 不合格 糖精钠,菌落总数,大肠菌群 东莞市鸿昌食品有限公司 绿豆孖棒 冰之岛 90g/支 2009-04-23 不合格 糖精钠 重庆绿好食品有限公司 脆瓜子雪糕 绿好 53g/支 2009-02-23 不合格 大肠菌群 重庆吉喜达食品有限公司 九岁芝麻官棒冰 　 82g/支 2009-03-20 不合格 大肠菌群 重庆吉喜达食品有限公司 脆筒雪糕 　 70g/支 2009-03-11 不合格大肠菌群 重庆市东星食品厂 七小福星棒冰 帅乐 160g/支 2009-04-08 不合格 菌落总数 成都绿好食品有限公司 红枣牛奶口味雪糕 绿好 65g/支 2009-04-08 不合格 菌落总数 贵阳金糯米冷饮厂 脆皮雪糕 金糯咪 45g/支 2009-04-08 不合格 菌落总数,大肠菌群 宝鸡市渭河冷饮食品厂 玉米香雪糕 渭河 70g/支 2009-04-01 不合格 甜蜜素,菌落总数,大肠菌群 西安锦龙工贸有限责任公司 扒皮乐雪糕 夏君乐 75g/支 2009-04-16 不合格 大肠菌群 宝鸡市金台区雪元冷饮食品厂 阿拉雪果味冰品 雪元 100g/袋 2009-04-10 不合格 甜蜜素,菌落总数 　　　　注：按行政区域排序。

由军事医学科学院卫生学环境医学研究所、实验仪器厂以及北京四环科学仪器厂有限公司共同完成的&ldquo 智能型冷冻干燥机系列产品的研制与应用&rdquo ，获天津市科技进步二等奖。该项目立足于冷冻干燥技术的学科前沿，将高效与绿色环保制冷系统相结合，完成了多项自主创新技术，拓展了应用领域和推广范围。 　　冷冻干燥过程是一个复杂的传热传质过程，涉及制冷、真空、电子、化学、低温医学等多个学科，技术含量高、冻干工艺复杂。随着冷冻干燥技术日益广泛应用于医药生产、档案去湿、标本保鲜、食品生产、文物考古等诸多领域，人们对其技术参数、智能化水平的要求也越来越高。我国中小型冷冻干燥机的产品研发始于上世纪80年代，目前生产厂家已有10多家，均处于仅仅满足最基本的冷冻干燥需求状态，整体技术水平始终在低水平徘徊。国外产品虽然技术性能良好，但价格昂贵，无法满足更大范围的用户选择意愿。因此，研制技术上达到国际领先的智能型冷冻干燥机十分迫切。 　　在军事医学科学院30日举行的媒体座谈会上，项目负责人江建华高级工程师介绍说，该项目组成员历时25年，研发了多功能监控软件，实现了对冻干数据的远程实时采集、跟踪以及对冻干进程的实时监控，研制了高效、绿色、环保的单机混合制冷系统。首次在国内建立以物料阻抗值和阻抗变化率相结合的方式，在线判断物料共晶点；建立以渗气法精确控制真空度，冻干效率提高约30%；建立以真空度、搁板温度及物料温度相结合的冻干终点在线判定方法；建立复杂环境条件下多层搁板温度的精确控制技术；实现了16种冻干工艺流程的全程自动控制；改善了冻干物料的沸腾、玻璃化现象，提高了冻干产品的效率与质量。 　　项目获得授权专利8项，发表论文10篇，2008年获得国家科技部重点新产品计划项目资助，2009年获得国际科学仪器及实验室设备展自主创新银奖，2012年获得国际发明展金奖。目前，该成果已经进入大批量生产阶段，被广泛应用于教学科研、医学、制药、食品、环保、监测、质检、考古、航天等诸多领域，取得了显著的经济和社会效益。

（1）生物制品的冷冻真空干燥我们做过生物制品冷冻真空干燥的品种有皮肤、角膜、海参、螺旋藻等；从文献中看到其他人做过的冻干产品有心瓣膜、活菌、活毒、骨骼、各种疫苗、血液制品等。生物制品的冻干要求保持产品的活性，活菌、活毒等微生物真空干燥后的存活率要求80%以上，以便于应用。因此，对冻干机工艺要求严格，预冻温度、速度、时间的控制很不容易，保护剂配方、剂量、加入时间和加入方法非常关键，不同的人可能采用不同的配方，达到的效果可能相同。一般各种保护剂的配方都是互相保密的。（2）药材和药品的冷冻真空干燥我们做过的品种有人参、山药、纳豆激酶、北冬虫夏草、林硅油、鹿茸等；从文献中看到其他人做过的品种有各种粉针制剂、中草药制剂、抗生素、布洛芬、脂质体和其他纳米颗粒等。药材和药品需要长期保存，真机需要速溶，放置氧化，避免污染杂菌，保持药效的长久稳定。这些要求都需要通过冷冻真空干燥技术来实现。药材和药品的冷冻真空干燥工艺要求也很严格，寻找合适的冻干保护剂、添加剂、赋形剂都很困难，生化干燥阶段的温度控制、加热速率控制都很关键，严格防止塌陷。（3）食品的冷冻真空干燥我们做的食品有菠菜、苹果、香蕉、库尔勒香梨等；从文献上查到其他人做过的品种有咖啡、茶叶、大蒜、鱼肉、调料等。食品种类繁多，形状、性质相差较大，冻干工艺需要在实验中确定。冻干食品时间较长、耗能较多、价格较高，应该合理选择冻干参数，优化冻干过程，降低冻干昂成本，根据市场需要，选择性价比较高的食品做冷冻真空干燥。（4）冷冻真空干燥在其它领域的应用冷冻真空干燥除了在生物制品、药品、食品和纳米材料制备方面的应用之外，还可以干燥超市的木质文物、古画等，冻干发出来的这些产品能恢复物品的原样；还可以干燥动植物标本，使标本长期保存，栩栩如生；医疗事业做实验用的、具有毒害物质的动物尸体采用冻干干燥法的处理，可以实现环保等。

仪器信息网讯 2015年5月29日-6月2日，&ldquo 2015全国生物医学农林电镜技术研讨会暨生物电镜前沿技术培训班&rdquo 在浙江大学举行。本次会议特别邀请了国内外知名专家教授和电镜工作者讲授生物电子显微镜技术的最新发展，交流生物样品制备和应用方面的技术经验，并安排部分学员参加实验操作及演示。 　　上海同济大学生命科学学院祝建教授作了题为&ldquo 关于原位冷冻电镜技术的一点想法&rdquo 的报告。 祝建教授 　　祝建介绍说：&ldquo 冷冻电镜技术可以分为单颗粒冷冻电镜技术和原位冷冻电镜技术。其中单颗粒冷冻电镜技术目前国际上做了许多工作，近来也比较火。近年来，我国为了开展这方面工作，购置了许多相关的高端仪器设备。该技术需要将细胞内的活性蛋白分子提纯后在体外分析，但是在体外做的不错的结构最终还需要到体内去验证，如在体内蛋白质是否也是按照相应的结构来执行功能。所以这方面的工作还需要进一步深入。&rdquo 　　祝建表示，原位冷冻电镜的最终目的是研究大分子的结构、功能和机制统一的问题，从而解释生命现象。原位冷冻电镜技术包括冷冻固定、超薄切片，再加上电镜分析、数据采集、三维重构等。冷冻固定可以分为快速冷冻和高压冷冻。高压冷冻技术就是为了使组织的冷冻成为可能而问世，可以冷冻200&mu m厚的样品。而快速冷冻技术只能冷冻30&mu m厚的单细胞层。从冷冻速度来看，快速冷冻的速度稍快一些。 　　祝建说：&ldquo 目前，国内购买了多台高压冷冻仪。其实并不是所有的样品都适合高压冷冻，大组织块、一定厚度的样品用高压冷冻最好，其他的单细胞样品用快速冷冻一样能达到很好的效果，而且快速冷冻技术更简便。&rdquo 　　&ldquo 冷冻固定之后，如果在冷冻电镜下分析需要与冷冻超薄切片技术相结合。如果在常温电镜下分析，则还需要冷冻置换、包埋、切片等步骤，现在买高压冷冻仪的单位基本都是要和冷冻置换结合起来。冷冻置换是冷冻固定之后非常必要的低温脱水技术，脱水过程中脱水剂中所含有的固定成分还将在合适的低温温度下对样品进行二次固定。如果要减少样品收缩，则需要快速冷冻固定，慢慢脱水。&rdquo 祝建说道。 　　另外，祝建还谈道：&ldquo 原位分析的另外一种途径是标记，通过标记实现定位、定性、定量分析。因为我们无法看到一些结构细节和大分子，所以用抗体来标记连接我们能看到的荧光分子或金颗粒来实现间接原位分析。&rdquo 　　最后，祝建总结说，在实际应用中，要根据样品的特点，从快速冷冻、高压冷冻、冷冻置换、超薄切片、冷冻超薄切片、离子束切片等制样技术中选择合适的组合方法来制样。还有我们要考虑将原位冷冻电镜与单颗粒冷冻电镜结合起来获取有效的分析结果。 撰稿：秦丽娟

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “It is very easy to answer many fundamental biological questions you just look at the thing!”——1965年诺贝尔物理学奖得主理查德· 费曼教授 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 正如费曼教授所言，结构生物学的核心正在于“看清事物”。只要分辨率足够高，能看清诸多生物分子在原子层面上的细节，它们的工作方式也就不言自明了。也正是由于这个原因，从历史上看，结构生物学领域做出的发现，带来了许多生物学突破，也推动了不少创新疗法的开发。 br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/627d0364-d802-4ff4-aedb-9ab7041c7ce9.jpg" title=" 1.png" alt=" 1.png" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 在诸多让人类“高清看世界”的技术里，X射线晶体学是生物学家们使用最多的技术之一，也让人类获得了大量生物大分子的结构。但这种方法需要事先获取这种大分子的晶体。尽管许多蛋白质和一些稳定的复合体能产生质量足够高的晶体，但对于膜蛋白或动态的复合体来说，获取晶体就不是那么容易。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 我们能不依赖于晶体获取，直接“观察”这些大分子吗？自上世纪70年代起，许多先驱尝试使用基于电子显微镜的方法来解决这个问题。最初，它的分辨率并不尽如人意。但经历了40年的发展，冷冻电镜技术取得了突破，一跃成为了结构生物学的主流工具之一，与X射线晶体学形成了完美的互补。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 单粒子冷冻电镜的诞生 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 事实上，想通过电子显微镜来看清生物大分子，并不是一件容易的事。首先，和通常的照片一样，电子显微镜获取的图像是二维的，而生物大分子的结构是三维的。这一问题通过一个巧妙的方法得到了解决：对于同一个生物大分子，我们可以从不同的角度获取它的二维图片。将这些图片整合到一起，就可以重建出三维的结构。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 而电子显微镜遇到的另一个问题，曾一度被认为是它的致命硬伤——为了达到最佳效果，电子束必须处于真空环境之中。于是，这些样本也必须位于同样的真空里。对于生物大分子来说，这就造成了严重问题：真空导致的脱水会对样本的结构完整性带来破坏性的影响。从机制上看，用电子显微镜来观察生物大分子就好像是个不可能完成的任务。 br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/6c051d14-a901-4d11-af98-b62ce330a6df.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " ▲将样品“冻起来”，可以保留生物大分子的完整性（图片来源：By Vossman [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)], from Wikimedia Commons） /span br/ /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 1974年发表在《科学》杂志上的一项研究彰显了人类的智慧。在加州大学伯克利分校，还是在读研究生的Kenneth Taylor与其导师Robert Glaeser教授表明，生物大分子的结构完整性，可以通过将它们“冻起来”而得到保留。这一发现在上世纪80年代被Jacques Dubochet教授及其同事们发扬光大，基于这一发现开发的样本制备技术时至今日都没有出现很大的改动。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 研究人员们也指出了电子显微镜的第三个问题——高能电子束带来的辐射可能会对生物学样本造成破坏，从而限制了电子束的强度。而电子束较弱的结果，便是过低的信噪比。Richard Henderson教授等人提出的一个解决方案，将晶体学中的技术应用到电子显微镜成像过程中。利用电子晶体学（electron crystallography）技术，人们取得了一系列进展，解析出的结构分辨率最高达1.9 埃。 /p p br/ /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/6ff80f52-36a4-48ec-8bdf-d85e7527975f.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " ▲三位在冷冻电镜领域做出开拓性贡献的科学家共享了2017年的诺贝尔化学奖 br/ （图片来源：The Nobel Prize in Chemistry 2017. NobelPrize.org. Nobel Media AB 2018. Wed. 12 Sep 2018. https: ） br/ /https: /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 而Joachim Frank教授则希望能够规避结晶这一手段来确认蛋白质的结构。他提出，通过对同一种蛋白粒子进行大量的独立拍摄，再通过计算机来整合这些图片，有望能获得高清的结构。这一创新的想法与样本的冷冻制备相结合，成为了如今我们熟悉的“单粒子冷冻电镜”（single-particle cryo-EM）。Frank教授、Dubochet教授、以及Henderson教授三人也共享了2017年的诺贝尔化学奖。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " strong 结构生物学的新纪元 /strong /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 单粒子冷冻电镜技术为结构生物学带来了新的突破，使其迈入了新纪元。原本难以结晶的目标，其结构也能展现在人类面前，膜蛋白就是这样的例子。在这篇综述中，加州大学旧金山分校的程亦凡教授介绍了冷冻电镜如何协助我们获得了瞬态受体电位（TRP）离子通道的结构。 br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/b4af6e2b-a106-47b7-bc95-779b43e3ee4a.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " ▲本篇《科学》综述的作者程亦凡教授（图片来源：程亦凡教授实验室官网） /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " TRP通道超家族分为7大类，在人类中总共有27个成员，每一个通道都有着特定的生理功能，其中一些也有望成为治疗人类疾病的靶点。但除了这些通道里的少数小型结构域外，人们对这些通道的结晶尝试往往以失败而告终，这也限制了对这些靶点的进一步开发。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 2013年，这一困境迎来了终结。当年，《自然》上的两篇论文利用单粒子冷冻电镜技术，获取了TRPV1离子通道位于三种不同状态下的结构，让我们更好地理解了其“感受热量，激活疼痛通路”的作用。TRPV1结构的获得再次强调了冷冻电镜的巨大潜力——当“获取晶体”这一限速步骤被移除后，我们能够以极快的速度获得膜蛋白的原子结构。据统计，在不到5年的时间里，每一类TRP通道，均有至少1个成员的结构得到了解析。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 对于大型的动态复合体来说，冷冻电镜更是让原本无法通过结晶获取的结构呈现在了人类面前，剪接体就是极佳的例子。过去，人们要么只能获得其中片段的原子结构，要么只能获得分辨率较低的整体结构。而在单粒子冷冻电镜的协助下，在几年里，我们就获得了剪接体在不同工作状态下的结构，从而拼接出了它工作的完整画面。这在过去是难以想象的。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 冷冻电镜领域前所未有的发展速度，也吸引了诸多医药企业的关注。它们期望能够应用这一技术，优化药物的发现过程。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " strong 医药企业的尝试 /strong /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 在去年11月的一篇《Nature Reviews Drug Discovery》综述中，作者Mark Peplow博士为我们盘点了药企在冷冻电镜领域的布局与尝试。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 对于大型药企来说，在公司内部的建立冷冻电镜能力是其布局的主要方向——基因泰克在组建内部的冷冻电镜团队；辉瑞斥资500万英镑使用新款的冷冻电镜；诺华通过与Friedrich Miescher研究所的合作也构建了自己的冷冻电镜中心。诺华生物医药研究所（NIBR）的蛋白质科学负责人Christian Wiesmann说，他们的冷冻电镜中心已经初见成效。利用冷冻电镜技术，他们获得了一款蛋白与一种小分子结合时的结构，这能指导药物化学的开发。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 对于另一些药企或生物技术公司来说，他们决定组成联盟，共同使用冷冻电镜工具。这一方面是出于成本的考量，但更重要的是，这种联盟能够促进经验的交流。在英国，剑桥医药冷冻电镜联盟（Cambridge Pharmaceutical Cryo-EM Consortium）就是这样的例子——在5家药企的合作下，这一联盟获得了超过300万英镑的资金，于2016年正式启动。 br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/5e19607c-c0eb-4bf4-98ae-c487fb8216b8.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 去年5月，该联盟的成员之一阿斯利康发表了一篇论文，揭示了人类突变ATM蛋白的结构。ATM蛋白是一类大型激酶，与DNA的修复有关，在癌症发病中有潜在的作用。而研究人员们获得的结构，其分辨率为4.4埃，足以看清其两个构象，其中一个处于“打开”状态，可以结合底物；另一个则处于“关闭”状态。这些发现带来了该蛋白的首个高清结构，也表明它作为分子开关的重要作用。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 该联盟的另一个成员Heptares则在探索GPCR的结构。作为一类膜蛋白，它们通常会因为分离过程而失去正常的结构与活性，因此难以通过常规的结晶手段制备样本。但冷冻电镜技术则没有这样的困扰。目前，我们获得的GPCR结构已能让我们看清它们与大型多肽相结合时的结构。它们与小分子结合时的高清结构，会是研究人员们未来的研究方向。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " strong 冷冻电镜的未来 /strong /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 冷冻电镜领域在过去40年里发生了重大的改变，而这一技术还有不少可以提高的空间。其中的一大关键在于进一步提高分辨率，达到2埃左右，另一大关键在于提高使用的效率。如果我们能够快速获得大批样品的高清结构，无疑将加速这项革命性技术在医药领域的应用。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 此外，硬件与软件的升级，也将提升冷冻电镜的能力。更好的光学系统、更好的检测器、更好的算法软件，都能让冷冻电镜在现有的基础上如虎添翼。正如一些业内资深人士指出的那样，要实现这样的功能迭代，让冷冻电镜成为新药发现的常规工具，或许还需要5到10年的时间。但对于诸多医药与生物技术公司而言，目前或许是将这一工具整合至研发系统中的最佳时机。 /p p br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p

北京松源华兴是国内首批从事真空冷冻干燥技术、北京市工业企业安全生产标准化企业，总部位于北京，在上海、广东、武汉、西安、成都等地设有分支机构和特约维修站。同时，北京松源华兴以卓越的技术实力，产品远销美国、俄罗斯、韩国、日本、新加坡、马来西亚、加拿大等国家。 北京松源华兴以开放和融和的态度与众多国内外知名冷冻干燥技术厂商和知名院校结为深度技术合作伙伴，兼容并蓄，不断向真空冷冻干燥技术应用领域纵深化发展。 北京松源华兴科技发展有限公司（Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.）创立于2000年，专注于真空冷冻干燥技术产品的研发、生产、销售，以“真空冷冻干燥机”为核心产品，形成了针对科研实验、医用、食品行业，不同规模、不同应用的三大系列产品和针对性解决方案，是国内颇具影响力的真空冷冻干燥设备和针对性解决方案的供应商。 前来工厂考察的各国友人节选

在过去的二十年中，冷冻显微镜方法已经成为生命科学家、制药研究人员等广泛使用的有效工具，用于检查接近其原生状态的生物结构1。冷冻显微镜能够可视化蛋白质和蛋白质复合物等物质的生物分子结构，是对现有的方法如x射线晶体学和核磁共振(NMR)等的有价值的补充。确定蛋白质和蛋白质复合物的结构是药物发现的一个重要部分，这对研究药物靶点非常有意义，也是深入了解疾病机制的重要课题。在这篇文章中，我们将阐述冷冻显微镜技术的使用，包括冷冻光学电子显微镜(cryo-CLEM)，冷冻干燥显微镜(FDM)，药物研究中的低温保存，以及温度控制显微镜如何使研究人员能够在低温下推进药物发现和开发研究。冷冻光学电子显微镜（Cryo-CLEM）电子显微镜(EM)使用微量材料，具备接近原子的分辨率，可以研究不同功能状态下的分子。冷冻电镜（Cryo-EM）使用极低温度，克服了真空条件下使用电子束测量高含水量生物标本的难题。在20世纪80年代冷冻电镜商业化之前，生物标本是通过化学固定或染色等方法制备的，但这些方法存在保存伪影，会影响图像分辨率。快速冷冻通常用于将样品保持在与自然生理环境相似的冷冻状态，在临床前阶段取得的结果必须在临床研究中可复制，这在药物研究中尤其重要。Cryo-CLEM结合低温荧光技术和冷冻电镜技术，提高了活检细胞内生物、化学和遗传过程的灵敏度。Cryo-CLEM能够对冷冻固定样品中的分子或分子组件(如细胞内膜、DNA或细胞结构元件)进行直接荧光标记和靶向，精确定位区域，以便后续使用EM进行高分辨率成像。为了使生物样品与EM中发现的真空条件兼容并保存结构细节，样品被嵌入玻璃状的冰中，需要保持在-140°C以下。必须避免与空气中水分接触，因为一旦接触会形成冰晶并污染样品。在低温条件下，荧光信号的结构细节被保留，光漂白显著减少。冷冻光学电子显微镜技术的进步体现在它包含了创新的冷冻荧光级，如Linkam CMS196，它能够自动获取整个电镜网格的高分辨率荧光图。这也用于样品导航，并将cryo-CLEM的案例情况与EM或与x射线显微镜等其他技术相关联。西班牙巴塞罗那的一组研究人员和临床医生使用荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)和低温软x射线断层扫描(cryo-SXT)，可以观察到抗癌药物顺铂在极低浓度下的有效性，确定产生效果所需的最低剂量，以最大限度地降低毒性2。该小组在荧光显微镜上对低温冷冻的细胞样本进行成像，使用CMS196冷冻荧光台在液氮温度下将它们玻璃化，然后使用cryo-SXT对样本进行分析，这使得在纳米尺度上进行3D研究成为可能。得益于现有的低温成像技术，研究结果表明，三甲碱(研究的两种佐剂之一)促进了顺铂在较低剂量下的有效治疗，这可能为化疗治疗的发展铺平了道路，减少了对患者的副作用。冻干显微镜许多药物生产为冻干或冻干配方，以增加稳定性和延长保质期。药物开发人员必须为新的药物化合物创建一个优化的冷冻干燥过程，这可能是一项复杂而昂贵的工作。为了简化流程和开发更高效的冷冻干燥循环，了解三个主要冷冻干燥步骤的温度和压力要求是很重要的。使用冷冻干燥显微镜(FDM)，研究人员可以直接可视化每个步骤，并确定药物产品在不同热条件下的行为。FDM包括一个专用的光学显微镜和一个专用的热工作台，它可以准确地控制样品的温度和压力，并允许实时进行热测量。冷冻干燥的一个关键参数是塌陷温度(Tc)，即产品失去结构完整性并导致加工缺陷的温度。FDM使药物开发人员能够密切监测样品并快速有效地调整冷冻干燥方案。英国国家生物标准与控制研究所(NIBSC)的一个研究小组正在利用先进的FDM技术研究冷冻干燥药物的复杂性。该小组由Paul Matejtschuk博士领导，正专注于研究优化冻干脂质体药物的配方。由于冻干脂质体药物物理和化学性质不稳定，这对开发提出了挑战。Matejtschuk博士和他的团队使用安装在光学显微镜上的专用冷冻台(FDCS196, Linkam科学仪器)(图1)，通过估计冻结、塌陷和融化温度，预测脂质体-冷冻保护剂混合物的理想的冷冻干燥条件3。图1:NIBSC实验室的仪器配置。Linkam FDCS196冷冻干燥冷冻台，T94控制器和液氮泵，真空泵，奥林巴斯BX51光学显微镜。图像显示FDM系统的旧版本图2: Linkam FDCS196冻干显微镜系统的最新版本这样的实验对于继续努力开发快速、可转移和可扩展的冷冻干燥方法来稳定脂质体等药物化合物至关重要。低温贮藏储存用于研究的生物标本有赖于有效的保存技术，以保持细胞的物理和生物完整性。冷冻或冷冻样品可能会导致冰晶的积聚，导致终端细胞损伤。冷冻保护剂是在冷冻过程中通过降低水的熔点来防止细胞损伤的重要物质。许多生物，如极地昆虫、鱼类和两栖动物，会产生自己的冷冻保护剂或防冻化合物。科学家们正在研究这些化合物，以开发新的冷冻保护剂来保存研究用的细胞。例如，由Matthew Gibson博士领导的英国华威大学的研究人员，正在研究防冻剂(糖)蛋白(AFP)，目的是开发新的合成AFP模拟化合物。该实验室使用低温生物学工作台(BCS196，Linkam Scientific Instruments)来测量细胞中的冰晶生长，依靠该仪器的温度控制能力来观察AFP。Gibson博士研究了使用金纳米颗粒作为探针来测量冰再结晶抑制活性现象，使用低温生物学工作台来改变温度，并开发出一种高通量方法来筛选类似AFP具有结构特征的材料。4诸如此类的发现为开发新型冷冻保护剂提供了潜力，这种保护剂可以防止冷冻保存细胞中冰的生长，从而保持细胞的完整性，因此在生物医学和药学研究中具有潜在用途。未来药物研究本文中描述的技术强调了目前已有的各种冷冻显微镜方法的选择，这些方法有助于推进药物研究。Cryo-CLEM结合了cryo-EM和低温荧光的力量，作为一种相对较新的技术，它的成功依赖于专用冷冻工作台的发展，从而促进了Cryo-CLEM工作流程。这种工作台能够在液氮温度下保持玻璃化样品，使它们在从荧光显微镜移动到冷冻电镜成像时保持无污染。其他专用的冷冻台可与广泛的显微镜技术兼容，如FDM，可在成像过程中精确控制样品的温度，低至-196°C。这些创新为制药研究人员新疗法和生产工艺评估，以及生物样本保存以供未来研究等大量应用提供了工具。 作者：Linkam Scientific Instruments销售及市场部经理Clara Ko参考文献：1. Booy, F. and Orlova, E.V. Cryomicroscopy, in: Chemical Biology: Applications and Techniques (eds Larijani, B., Rosser, C.A., and Woscholski, R.) 2007.2. Gil, S., Solano, E., Martinez-Trucharte, F., et al. Multiparametric analysis of the3. effectiveness of cisplatin on cutaneous squamous carcinoma cells using two different types of adjuvants. PLoS ONE. 2020 15(3): e0230022.4. Hussain M.T., Forbes N., Perrie Y., Malik K.P., Duru C. and Matejtschuk P. Freeze-drying cycle optimization for the rapid preservation of protein-loaded liposomal formulations. International Journal of Pharmaceutics 573, 2020 118722.5. Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., and Gibson, M. I. Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 2015 5: 15716.

冷冻共聚焦显微镜及其在冷冻电子断层扫描中的价值 Cryo ET（电子断层扫描）是一种专用的透射电子显微镜技术，可以重建观察区域的三维体积。借助先进的冷冻EM（电子显微镜），图像分辨率可以提升到令人难以置信的亚纳米等级。因此，可以在细胞内的原生环境中研究蛋白质以及其他生物分子，从而揭示尚未探明的分子机制。由于细胞和组织必须薄到能够透过电子，样品必须进行切片以获取足够薄的样品体积（薄层）。为对样品中的靶区进行精确的三维定位，冷冻共聚焦显微镜是必不可少的工具。 以下部分，我们将描述冷冻电子断层扫描工作流程的主要步骤，以及如何通过冷冻共聚焦显微镜定位靶区并进行切片，以提高整个工作流程的可靠性。 在EM网格上培养细胞 通常，在涂有多孔碳膜（例如 QuantifoilR）或二氧化硅（SiO2）膜的金质或钛金网格上植入急性分离或培养的细胞（图1，Mahamid等人，2019）在后续步骤中，钛金属和二氧化硅似乎更加坚硬而且稳定，无需额外添加碳层（Toro-Nahuelpan 2019） 网格通过Poly-L-Lysin或纤连蛋白（Fibronectin）实现生物激活，胰蛋白酶解离细胞在前一晚植入，以便在后续步骤中附着在碳层表面（Mahamid等人，2019）。 图1：采用12纳米厚多孔二氧化硅膜（R 1.2/20，即孔径1.2微米，间距20微米）的3毫米EM金质（Au）网格的反射图像拼接图。HeLa细胞已经植入并玻璃化。实心箭头：定位用的中心标记；空心箭头：聚焦离子束进入的切片槽；虚线箭头：空的网格方格。一个网格方格的边长：90微米。 添加微型图案 为进入细胞样品以成功实现FIB切片并在冷冻TEM中开展后续分析，必须确保相关细胞位于网格方格的中心位置或其附近。但细胞喜欢在网格条上生长或者集簇生长，因此不适合进行FIB切片和电子透射分析。为了克服这一挑战，微型图案技术允许用户控制细胞在碳膜（图2）上的位置和分布，提高相关工作流程的可靠性。 网格表面涂有聚乙二醇（PEG），可防止生物材料附着。利用紫外激光移除该涂层，即可对细胞的黏附进行针对性控制，保证FIB切片以及TEM的可操作性（Toro-Nahuelpan 2019）。此外，可以创建特定图案，从而影响整个细胞结构并且有助于使用冷冻电子显微镜研究生物力学现象。 图2：有/无微型图案的细胞分布情况左图：分布不均的细胞（小鼠A9成纤维细胞，使用Alexa Fluor 488 Phalloidin标记，以显示纤维状肌动蛋白）。右图：网格方格中心定位精确的细胞，可进行FIB（成纤维细胞黏附在纤维蛋白原微型图案表面；图片由Alvéole与德国汉堡CSSB中心教授Kay Grünewald博士共同提供。） 投入冷冻 为在固定用于电子显微镜检查的同时确保样品接近原生状态，细胞必须极速冷冻，以免产生破坏性的冰晶。这个过程称为玻璃化，因为冰片变成无结晶的玻璃状（玻璃体） 为让样品细胞达到这种效果，网格必须快速投浸到适当的冷冻剂（通常为乙烷，或者乙烷和丙烷）中。1981年，Jacques Dubochet发表了首个手动吸液和投入冷冻方法，该方法仍获广泛使用以获取出色的结果（Dubochet, J.以及McDowall, A. W.，1981）。 在投入冷冻之前，必须去除多余的液体。标准技术是使用滤纸实现受控吸液（图3，Dubochet, J等人，1982；Bellare等人，1988；Frederik, P. M.等人，1989）。 图3：在投入冷冻前，通过吸液处理对多余液体进行受控移除。使用镊子固定网格，并通过单独步骤将吸液纸移向网格。吸液传感器可以自动并反复执行该过程。 市面上有多种不同的吸液设备，例如用于自动吸液和投入冷冻的Leica EM GP2。根据不同样品类型的多种需求，可以使用多种涉及吸液步骤的样品制备方案（另见此处）。 冷冻状况下的存储、装载和转移 玻璃化之后，样品必须在整个工作流程期间处于冷冻状况下。因此，必须对从存储到转移至不同成像系统的所有步骤进行冷冻处理，以免样品析晶和/或污染这尤其困难，因为这种低温冷冻样品会像磁铁一样吸引附近的湿气和灰尘。研究人员和制造商付出巨大的努力来开发并提供解决方案，以便在工作流程的不同步骤中保证样品安全。 样品通常以四个为一组存储在网格盒内，而网格盒又保存在大型液氮（LN2）罐中的Falcon多孔试管中。还可以使用更为复杂的冰球系统。 转移并装载到样品架时，通常使用液态氮（LN2）。不幸的是，LN2往往会在一段时间后，因为空气中的水分而产生结晶冰污染。在转移时，这些冰晶可能会附着到网格上，干扰随后的切片和成像过程。此外，LN2内部的能见度很低，因为它在不断移动，而且始终会有条纹。 因此，最好在LN2上部的气相部分装载并转移样品以保持冷冻条件，同时为装载步骤（图4）提供出色的可见性。 徕卡显微系统在提供GN2（气态氮）装载和转移设备方面拥有30多年的悠久历史。新的冷冻显微镜套件就在这些经验的基础上开发而成，同时融合众多客户的反馈意见打造出先进的转移舱和夹具系统。 图4：在冷冻显微镜套件转移舱的GN2（气态氮）环境中装载网格。转移舱的可见度在冷冻条件下不受干扰。 检查样品质量和靶分布 在冷冻工作流程中，一般而言，EM操作时间尤其宝贵，因此对样品进行早期质量检查至关重要。许多因素会关系到样品能否转移到下一个工作流程步骤，包括碳箔的结构完整性、玻璃化的质量（包括冰层的厚度及其分布）、目标细胞的存在、分布和可及性，以及目标结构的存在和定位。 所有这些参数均可通过基于相机的冷冻光学显微镜（例如THUNDER Imager EM Cryo-CLEM）或使用STELLARIS冷冻共聚焦显微镜上的相机模式来检查（图5）。 透射模式显示网格、箔膜和细胞质量，反射图像显示网格表面，尤其是呈现玻璃化质量和冰层厚度，而荧光图像可以提供有关不同靶蛋白的表达水平及其分布情况的信息。 图5：不同模式呈现出网格的完整性以及靶分布。A——网格表面的反射图像可以显示碳膜或二氧化硅层的缺陷以及冰层的厚度。B——绿色荧光（线粒体）。C——液滴分布以实现高精度关联D——通过Hoechst标记的细胞核E——所有模式的叠加图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 在LAS X Coral Cryo软件工作流程中，用户可以在引导下，通过不同图像模式对整个网格自动创建清晰的合焦概览图像。 标记标志点、薄片点以及液滴中心 为了关联冷冻LM（光学显微镜）的3D图像以及后续的冷冻FIB-SEM/TEM图像，首先需要获取网格的概览图像以便大致对齐两种模式的图像（图6）。这里，反射图像非常重要，因为它们类似于SEM图像，但也可以使用透射图像。中心标记以及其他标志点（例如碳层中的缺陷）有助于快速定位并对齐概览图。 图6：以不同模式获取整个网格的合焦概览图像，用于识别网格缺陷、对齐标记和靶分布。中心标记用实心箭头表示，二氧化硅层中的主要缺陷用空心箭头突出显示。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 其次，需要超分辨率的共聚焦3D图像。这些图像堆栈用于在潜在薄片位置的范围内执行高精度关联。完成概览图对齐后，可以找到3D共聚焦堆栈的正确位置以便后续进行高精度关联这样做的前提是必须提供图像相对于概览图以及相对于彼此的位置。这就是Coral Cryo软件工作流程之后的处理步骤（图7）。 图7：相机概览图像与共聚焦Z-堆栈相机和共聚焦图像的组合含有XY坐标位置，因此可以匹配。所有图像都包含在Coral Cryo软件工作流程期间创建的相关项目文件夹中。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 必须组合相机概览图像和超分辨率3D图像以检索靶区位置并在FIB-SEM上定义切片位置。这个步骤非常重要，因为在标准FIB-SEM中，无法看到荧光以及相应的靶区点位。 EM（电子显微镜）制造商近期研发出一种集成了FIB-SEM功能的荧光显微镜，可以作为在切片过程中通过检查荧光来提高工作流程的可靠性和准确性的一种绝佳选择。不过，这些系统并不具备必要的分辨率以及采集模式的灵活性，无法像单独的共聚焦系统那样实现精确的3D定位。 如何关联并检索薄片位置 作为常用的最低标准，研究人员使用LM图像的屏幕截图在EM上检索靶区的XY坐标。不幸的是，并排比较图像不仅费力耗时而且很容易出错，因此并不可靠。身为工作流程提供商，徕卡显微系统致力于通过THUNDER Imager EM Cryo-CLEM来改善这种情况。研究人员可以在图像上定位标志点和靶区标记，然后以开放EM格式的完整坐标集导出。首先，这个流程适用于2D图像，因此合乎逻辑的下一步骤就是提高分辨率并将坐标系扩展到3D坐标。 对于高精度关联和3D定位，目前广泛采用的是基于液滴的方法（Alegretti等人，2020；Klumpe等人，2021年；Bieber, A.，Capitanio, C等人，2021）液滴通常在玻璃化之前添加到细胞中，可在LM和EM中观察到，用于通过XYZ坐标对齐图像堆栈，作为图像数据相关性的基础，从而正确定位FIB切片窗口（图8）。 典型液滴的尺寸为1微米，完全呈球形，这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子，可以更清晰地观察到含有金属的微滴，从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择液滴，使其荧光发射不同于实际靶的荧光发射，以便能够更好地分辨。 图8：3D共聚焦图像（左）和俯视SEM图像（右）的最大投影。荧光液滴（1微米）在两种模式中均可以观察到，因此可以用于对齐数据。SEM图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung和Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 要使用来自冷冻LM和FIB-SEM的3D数据，在冷冻LM的引导下，进行薄片制备，可以使用一款开源软件（3D关联工具箱，简称3DCT，Jan Arnold等人，2016）。 将冷冻LM图像载入到在FIB-SEM上运行的该软件中。二维LM概览图和SEM图像之间的三点关联用于初步定位。之后，使用离子束获取相关视场，并手动点击LM堆栈和FIB图像中的相同液滴图10显示了一张LM图像和一张FIB图像，其中的靶区点位以及液滴可以在定位软件中重现其排列组合。 图9：在LM和FIB图像中关联标记。左图：点击观察结构周围的液滴，并在3D图像中执行质心定义（白圈中的绿点）计算得到的位置随后投影到FIB图像（右图）上根据液滴标记，计算目标结构的位置并标记到FIB图像中（红圈中的红点）。离子束图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 该软件通过对X、Y、Z信号进行高斯拟合，精准确定液滴的中心。近期的改进增加了半自动液滴检测功能以及其他功能，从而更加方便地执行冷冻FIB工作流程。(SerialFIB, Klumpes等人，2021）。 在网格条上选择围绕最终目标结构的几处液滴，作为切片处理的坐标系。基本计算方法是考虑缩放、旋转以及平移之后的线性仿射变换最后，在LM图像中选择目标结构并叠加到FIB图像上。 根据目标结构的位置，就可以定位切片窗口(图10)。 图10：定位切片窗口左：离子束细胞图像，含有标记液滴和目标结构根据目标结构的计算位置，在所用FIB-SEM的切片软件中，交互定位上下切片窗口的位置（细薄条纹上方和下方的红色方块）。图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 Coral Cryo工作流程具有哪些优势？ Coral Cryo软件工作流程旨在为基于液滴的靶区定位工作流程提供支持。它可以提供创建合焦相机概览图像所需的成像作业（图6和图7）。所有必要的自动对焦功能均可以正确调整并分配，并且可以标记潜在薄片位置，同时能够在定义的位置执行超分辨率共聚焦Z-堆栈。 在定位管理器（图11）中，可以确定所有必要的坐标标记，并且以开放格式（*.xml）提供。此类图像会自动保存，其数据格式可以导入任何FIB-SEM软件。 图11：Coral Cryo软件模块标记点、薄片和液滴标记均可以在软件工作流程中定义。反射图像中细胞的顶部和底部坐标值可以作为在FIB SEM中正确计算靶区3D位置的额外参考。本文前述部分图像中的相同细胞经过突出显示，用于标记定义。 对齐标记用于使用相机概览图像对标记点进行初步的粗略对齐。薄片标记具有双重用途：作为进行超分辨率共聚焦3D扫描的位置标记，或者在图像采集后，作为靶结构的精确3D标记。亚像素插值确保该阶段可以在3D图像内进行高精度定位。最后，插值方法还用于标记液滴坐标，以便在FIB-SEM上进行后续液滴关联。 冷冻FIB切片 进行必要的关联并设置切片窗口，薄片位置通常会粗略切薄至大约1微米，随后进行最终的抛光步骤以达到电子透明（图12）。 图12：目标薄片的离子束图像以及SEM俯视图图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：10微米。 采用两步方法的原因在于冰污染和/或切片材料可能会沉积在薄片上。为避免在最终薄片上发生冰污染，建议采用快速抛光工艺（Schaffer M.等人，2017）。还可以采用开源的商业软件，以自动方式进行切片。 冷冻透射电子显微镜 进行冷冻FIB切片之后，含有薄片的网格转移至冷冻TEM，通过对网格（连同薄片）逐渐倾斜，采集一系列断层扫描图像。图像经过计算处理以重建所记录体积的3D断层扫描图像。通过对样品的多个图像取平均值，可以降低固有噪点，从而对蛋白质或蛋白质复合物等颗粒获得更高分辨率的结构。这种处理方式称为亚断层图像平均（Wan和Briggs，2016；Zhang 2019）。从概念上说，这相当于通过单颗粒成像（SPA），在原位实现对大分子的亚纳米分辨率。 总 结 本文旨在表明冷冻共聚焦显微镜是冷冻工作流程中的一个重要组成部分，用于评估EM网格上玻璃化样品的质量和靶分布。在冷冻条件下记录的高分辨率共聚焦数据使科学家能够在3D荧光下识别目标结构。此外，3D体积可作为相关方法的参考，以便在FIB-SEM中检索靶结构进行切片，然后在冷冻TEM中进行电子断层扫描，以获得靶区的亚纳米分辨率图像。 Coral Cryo工作流程搭配新的共聚焦平台STELLARIS，再加上Coral Cryo软件，可以帮助新手用户创建网格概览图像、超分辨率3D图像以及精确的坐标标记，为后续的FIB切片和冷冻电子断层扫描奠定坚实基础。 参考文献：（上下滑动查看更多） 1.Allegretti M, Zimmerli CE, Rantos V, Wilfling F, Ronchi P, Fung HKH, Lee CW, Hagen W, Turoňová B, Karius K, Börmel M, Zhang X, Müller CW, Schwab Y, Mahamid J, Pfander B, Kosinski J, Beck M.: In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 2020 Oct 586(7831):796-800. doi: 10.1038/s41586-020-2670-5. Epub 2020 Sep 2. PMID: 32879490. 2.Arnold, J., Mahamid, J., Lucic, V., de Marco, A., Fernandez, J., Laugks, T., Mayer, T., Hyman, A. A., Baumeister, W., Plitzko, J. M., Biophysical Journal, Vol. 110, Feb. 2016, pp 860-869. 3.Bellare, J. R., Davis, H. T., Scriven, L. E. & Talmon, Y.: Controlled environment vitrification system: an improved sample preparation technique. J. Electron Microsc. Tech. 10, 87–111 (1988). 4.Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P.S.: Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo--Electron Tomography. J. Vis.Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021). 5.Dubochet, J. & McDowall, A. W.: Vitrification of pure water for electron microscopy. J. Microsin cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Curr Opin Struct Biol. 2019 Oct 58:249-258. Doi: 10.1016/j.sbi.2019.05.021. 相关产品 UC Enuity 超薄切片机 徕卡显微咨询电话：400-630-7761 关于徕卡显微系统 徕卡显微系统的历史最早可追溯到19世纪，作为德国著名的光学制造企业，徕卡显微成像系统拥有170余年显微镜生产历史，逐步发展成为显微成像系统行业的领先的厂商之一。徕卡显微成像系统一贯注重产品研发和最新技术应用，并保证产品质量一直走在显微镜制造行业的前列。

2019年6月18日下午，北京公司携手日立高新在天美北京总部举办了“冷冻扫描电镜应用技术研讨会”。参加会议的有南京农业大学、东北农业大学、沈阳农业大学、大连工业大学、中科院植物所等40多名电镜专家和学者。 　　日立高新技术公司总经理田中先生对到场参加的专家学者表示感谢，天美公司副总裁赵薇女士介绍了天美公司发展情况并作会议致辞，quorum公司总经理robert henning先生也作了公司介绍。日立高新技术公司总经理田中先生（右） 天美公司副总裁赵薇女士 quorum公司总经理robert henning先生　　天美公司市场部副总监高敞先生介绍了日立冷场扫描电镜的特点及应用。quorum公司技术总监robert morrison先生介绍了冷冻制样系统的技术优势，操作过程及应用特点。南京农大贺子义老师介绍了冷冻制样系统的使用经验，以及跟传统干燥方法的区别。日立高新产品经理张希文先生介绍了日立120kv透射电镜的特点及应用。robert morrison先生最后还在实验室现场演示了冷冻制样操作过程。很多用户对冷冻扫描电镜能实现的效果大加赞赏，现场热烈讨论。 天美公司市场部副总监高敞先生 quorum公司技术总监robert morrison先生 日立高新产品经理张希文先生　　冷冻制样技术解决了含水样品的扫描电镜无形变高倍观察的需求，冷冻制样技术跟冷场扫描电镜配合使用，不仅可以发挥冷冻电镜低电压条件下分辨率高的优势，而且可以利用冷场电镜小束流观察样品从而避免电子束的损伤。冷冻扫描技术已经广泛应用在生命科学、化学化工、材料科学、食品科学、地质地矿等领域。本次技术交流会给日立电镜用户提供了冷冻制样手段的交流平台，很多老师希望能够今后能加强沟通合作。我们在此感谢各位专家的积极参与和热情支持，今后我们将再接再厉，继续为广大用户提供最好的服务！ 　　robert morrison先生在实验室现场演示冷冻制样操作过程及叶片断面现场拍摄结果 原创文章 作者：高敞 关于天美：　　天美集团从事表面科学、分析仪器、生命科学设备及实验室仪器的设计、开发和制造及分销；为科研、教育、检测及生产提供完整可靠的解决方案。近年来天美集团积极拓展国际市场，先后在新加坡、印度、澳门、印尼、泰国、越南、美国、英国、法国、德国、瑞士等多个国家设立分支机构。公司亦先后收购了法国Froilabo公司、瑞士Precisa公司、美国IXRF公司、英国Edinburgh Instruments公司等多家海外知名生产企业和布鲁克公司Scion气相和气质产品生产线，以及上海精科公司天平产品线, 三科等国内制造企业、加强了公司产品的多样化。

生活中的科学应用草莓的冷冻干燥冻干应用”冷冻干燥是水果可以长期保存食用的一种常用方法，目的是保持水果原有的口感及外观。在本文中，我们利用自主研发的 LyovaproTM 系列冷冻干燥机 L-200 开发了一种优化处理草莓干燥时间和剩余水分含量的方法。当然，该方法适用于 LyovaproTM 系列所有机器，包括但不限于 L-200、L-250 以及 L-300。1简介水果和蔬菜在人类的饮食和营养中起着重要的作用。它们是膳食营养素、维生素和矿物质的重要来源，并可以为人体提供粗质纤维。它们为单调的食物提供了颜色、风味和口感多样性。由于水分含量高(80% 以上)，它们具有很容易受到破坏。在热带和亚热带地区的许多发展中国家，由于缺乏足够的冷藏和冷冻设施，造成了 40 - 50% 的经济损失。食品加工的主要目的是将这些可持续成分转化为静态储存的材料，可以长时间储存，从而减少损失，并在食物短缺时可加以利用。在工业上，水果和蔬菜的保鲜已经采用了几种工艺技术，其中最重要的就是脱水处理。脱水技术是人类实践的最古老的粮食保障方法。去除水分能够阻止导致分解的微生物的进一步生长，同时减少许多水分介导的降解反应。在储存和运输上提供了大幅减少重量和尺寸的优势，并使产品能够在环境温度下储存。市场上有不同类型的脱水技术。然而，与其他脱水技术相比，冷冻干燥工艺在形态、外观、质地、味道和香气方面提供了更高质量的样品。冷冻干燥过程是一种升华过程，其中固体颗粒将直接转化为蒸汽形式而不进入液相状态。在冷冻干燥中，可将水蒸气除去，而不会扰乱产品的内部结构。预冻、初级干燥和次级干燥是冷冻干燥过程中的重要步骤。样品需要冷冻在其共晶或玻璃化转化温度以下以保持其固体结构。预冻后，进行抽真空处理，真空压力要低于样品的临界压力，然后进行初级干燥，该过程需进行加热。在这一阶段，大多数水蒸气将被除去。在次级干燥中，剩余的结合水分将通过蒸发而除去。2实验设备步琦冷冻干燥机Lyovapor&trade L-200 Pro.步琦冷冻干燥软件 Lyovapor&trade Software.真空泵 Pfeiffer Duo 6.可加热层板不锈钢托盘海尔低温冰箱 -40 °C.梅特勒分析天平梅特勒卡尔费休水分仪 3实验材料新鲜草莓，于当地市场采购4实验步骤4.1 样品制备草莓被切成两片，草莓片放在不锈钢托盘上。为了监测草莓样品的温度，温度传感器被放置在一片草莓的内部。装有样品的托盘和层板在 -25°C 的设定温度下冷冻过夜。4.2 冻干机 LyovaporTM L-200 的设置深度冷冻 12 小时后，草莓切片完全冷冻，冷冻后的样品托盘在常温下转移到带有 PMMA 干燥室的 L-200 冻干机中。实验方法的设计考虑了样品的共晶温度 -2℃、临界压力 0.3mbar、临界温度 50℃ 等关键参数。冷冻干燥过程是从装样步骤开始，需要设置层板温度，例如 -25°C，这是因为样品是在 -25℃ 的冰箱中进行预冻。在初级干燥阶段，层板温度保持在 -10℃。为了便于有效升华，层板温度逐渐升高到 20℃。压力最初维持在 0.400mbar，再降至 0.3mbar，从而保持在临界压力以下。在次级干燥阶段，温度最高保持在 45°C，压力设置到最小值，以去除样品中的结合水分。这一阶段的目标是保证样品中水分含量尽可能低，确保样品的长期稳定性和保存性。图1 显示了详细信息。▲ 图1：在Lyovapor&trade 软件上设置的初级和次级干燥步骤参数5实验结果和讨论5.1运行数据图图2 中的图表清晰地区分了初级干燥和次级干燥两个阶段。冷冻干燥约 15 小时后，样品温度接近层板温度，表明样品中的大部分水分已通过升华除去。这是因为层板提供给样品的能量不再被升华所消耗。因此，样品温度与 17 小时程序初级干燥结束时的层板温度相同。在 图2 所示的次级干燥阶段，通过将温度最高保持在45℃，同时压力设置为最低。由于通过解吸去除的水量要比初级干燥经历 15 个小时阶段的量少，所以样品温度会快速跟随层板的设定温度和实际温度而变化。▲ 图2：Lyovapor&trade 软件绘制的初级和次级干燥步骤的运行数据5.2 产品外观▲ 图3：冻干前(左)和冻干后(右)草莓果实在冷冻干燥前后，草莓的外观确实略有变化。样品初始总重量为 1606g。干燥后，总重量急剧减少到 132g。这一结果与引言部分提出的 80% 的含水率是一致的。5.3 残留水分含量卡尔费休（KF）滴定因其实用的优点而广受欢迎，例如准确性、测量速度和适配性。测量干燥后的质量损失即可检测到损失任何挥发性物质的。KF 测量方法具有很高的准确度和精密性，通常精确度在可测水含量值的 1% 以内，例如 3.00% 的水分含量值则显示为 2.97 - 3.03%。因此，使用已校准的 1% 水标准进行单点校准就已足够，无需校准曲线。发生的化学反应公式如下：公式1：ROH + SO2 + Rn → (Rn H+) SO3R-公式2：H2O + I2 + (RnH)SO3R + 2Rn → (RnH)SO4R + 2(RnH)I*(Rn = 胺和ROH = 甲醇)冻干草莓的水分含量通过卡尔费休滴定法分析，如下图所示。表1：冻干草莓的卡尔费休滴定结果。参数结果实际草莓重量（不含水）128.2g水分含量3.74%总除水量96%6实验结果和结论在冻干机 L – 200 Pro 上成功进行草莓的冷冻干燥。在 26 小时的干燥过程中，草莓的外观、质地和颜色没有发生改变，最终样品的水分含量https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1350417716304473?via%3DihubRatti, C (2001). "Hot air and freeze drying of high-value foods: a review". Journal of Food Engineering. 49:311 – 319.Shishehgarha, F Makhlouf, J Ratti, C (Jan 2002). "Freeze drying characteristics of strawberries". Drying Technology. 20 (1): 131 – 145.Pol. J. Food Nutr. Sci., 2011, Vol. 61, No. 3, pp. 165 – 171, https://www.researchgate.net/publication/244603084Dehydration of fruits and vegetables – recent developments in principles and techniques, http://dx.doi.org/10.1080/07373939208916413Strawberries hybrid drying combining airflow, dic technology and intermittent microwaves, http://dx.doi.org/10.4995/ids2018.2018.7556Effect of vacuum microwave drying on the quality and storage stability of strawberries, Journal of Food Processing and Preservation ISSN 1745-4549https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S026087749700023XKARL FISCHER METHOD determination of water – TEST METHOD, https://law.resource.org/pub/in/bis/S02/is.2362.1993.pdf

一、项目一（一）项目基本情况项目编号：ZTXY-2024-H41565项目名称：首都医学科学创新中心冷冻透射电镜采购项目预算金额：670.000000 万元（人民币）最高限价（如有）：670.000000 万元（人民币）采购需求：设备序号设备名称主要用途采购数量是否接受进口产品投标1冷冻透射电镜透射电镜用于观察蛋白、细菌、细胞组织等生物医学的超微结构，通过观察和分析生物大分子的结构和形态，从而了解它们在生物体内的功能和作用，配置的冷冻功能可以用冷冻方法观察蛋白的二维和三维结构。1套是详细采购货物技术参数详见第五章《采购需求》。用途：科研。 合同履行期限：国产货物及进口含税货物，合同签订后5个月内完成供货；进口免税货物，合同签订后5个月内完成供货。本项目( 不接受 )联合体投标。（二）获取招标文件时间：2024年08月02日 至 2024年08月09日，每天上午8:30至12:00，下午12:00至16:30。（北京时间，法定节假日除外）地点：北京市朝阳区南磨房路37号华腾北搪商务大厦11层1109室方式：现场获取，无需携带材料售价：￥300.0 元，本公告包含的招标文件售价总和（三）对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：首都医学科学创新中心　　　　　地址：北京市丰台区右安门外西头条10号　　　　　　　　联系方式：010-83950090　　　　　　2.采购代理机构信息名 称：中天信远国际招投标咨询(北京)有限公司　　　　　　　　　　　　地　址：北京市朝阳区南磨房路37号华腾北搪商务大厦11层1109室　　　　　　　　　　　　联系方式：周姗、成志凯、王师安、张静、于海龙、鲁智慧，010-51909015　　　　　　　　　　　　3.项目联系方式项目联系人：周姗、成志凯、王师安、张静、于海龙、鲁智慧电　话：　　010-51909015二、项目二（一）项目基本情况项目编号：TJYL-ZFCG-20240014项目名称：天津医科大学总医院毒物检测实验室设备采购项目预算金额：539.0万元最高限价：539.0万元采购需求：包号是否设置最高限价预算（万元）最高限价（万元）采购目录采购需求第1包否425425其他医疗设备液相色谱串联质谱仪采购1台（详见技术规格书）第2包否110110其他医疗设备电感耦合等离子质谱仪采购1台（详见技术规格书）第3包否44其他医疗设备组织研磨仪采购1台（详见技术规格书）合同履行期限：货到时间：签订合同之日起45日内（特殊情况以合同为准）。安装（调试）完成：货到之日起15日内（特殊情况以合同为准）。本项目不接受联合体参与 ，本项目不接受进口产品（二）获取招标文件时间：2024年08月02日到 2024年08月09日，每天上午09:00至12:00，下午13:30至17:00（北京时间，法定节假日除外）地点：天津银隆工程管理咨询有限公司（天津市西青区华科三路华鼎智地4号楼2门601室）方式：现场领取或以邮件方式获取，获取招标文件时可携带或以邮件形式提供供应商营业执照复印件，以现金或电汇形式支付。以邮件形式获取的，可以在办理汇款手续后到现场领取或以快递方式获得纸质文件。注：（1）选择电汇形式缴纳标书费的须在获取招标文件时间内汇至采购代理机构的银行账号（须使用对公账户），【电汇过程中请标注“标书费TJYL-ZFCG-20240014（拟投包号）”】。（2）代理机构邮箱地址tjyinlong@163.com。友情提示：参与本项目的供应商需在《天津市政府采购网》上完成注册并成为合格供应商（注册网址：http://tjgp.cz.tj.gov.cn/gys_login.jsp）。招标文件一经售出，概不退还。售价：400元（三）对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息 名称：天津医科大学总医院 地址： 天津市和平区鞍山道154号 联系方式：022-603617772.采购代理机构信息 名称：天津银隆工程管理咨询有限公司 地址：天津市西青区华科三路华鼎智地四号楼2门601 联系方式：022-879307663.项目联系方式 项目联系人：韩晴 李娜 电　话：022-87930766

佳音再传！上海昊扩与欧洲冷藏和冷冻设备领域的佼佼者Liebherr达成重要战略合作，正式成为其在中国南区的授权代理商。此次合作标志着双方将共同携手，深耕中国南区市场，为更多用户提供高效、可靠的冷藏和冷冻设备解决方案。关于Liebherr利勃海尔集团（Liebherr Group）是一家家族经营的技术公司，拥有丰富多样的产品分类。作为世界上最大的工程机械制造商之一，集团在众多不同领域为客户提供高品质、以用户为导向的产品和服务。利勃海尔集团由遍布各大洲的150多家公司组成。2023年，利勃海尔集团拥有超过 50,000名员工，总收入超过140亿欧元。集团由汉斯利勃海尔于1949年在德国南部小镇伊勒河畔基希多夫创立。自那时起，全体员工始终致力于通过不断的技术创新，为客户提供先进的解决方案。秉持“75载砥砺前行”的口号，利勃海尔集团将于2024年庆祝其成立75周年。Liebherr-Hausgerä te GmbH是利勃海尔集团旗下的11个分部控股公司之一。利普赫尔电器拥有6,800多名员工，在位于奥克森豪森（德国）的总部以及位于利恩茨（奥地利）、马里卡（保加利亚）、居銮（马来西亚）和奥兰加巴德（印度）设有生产基地，为家用和专业领域开发和生产各种高品质冰箱和冰柜。实验室与生物医药专业制冷解决方案易受温度影响的物质需要可靠的冷藏，这给科研和生物医药领域带来了巨大挑战。上海昊扩将为您提供以下Liebherr旗下各类高品质冷藏和冷冻设备：产品优势： &bull 温度稳定：出色的温度稳定性是 Liebherr 专业设备的特色。即使在极端气候条件下，易受影响的样品也能在精确的恒定温度下加以冷藏。此外，设备可以维持温度稳定性，并在出现偏差时发出警报。&bull 标准安全功能：Liebherr 素有为高价值产品提供妥善保护的良好声誉。众多安全功能可以确保易受温度影响的物质的品质，使其与您出色的工作质量一样始终得到保证。&bull 新型警报系统：科研和医药领域不允许出现差错，储存温度同样必须高度精准。Liebherr 专业设备配备了各类警报系统，可在发现任何偏差时立即发出提醒，并帮助您以切合实际的视角评估危急情况。&bull 可持续性和经济性：Liebherr 的冷藏和冷冻设备仅使用环保制冷剂，其特点是高效率、低能耗和运营成本。出色的 TCO (总拥有成本) 还得益于较长的使用寿命和易于维护的特性，尤其是设备几乎不需要维护。&bull 标准和指令遵从性：Liebherr 冷藏和冷冻设备遵循关于储存质量、卫生状况和安全的标准、规范和指令。作为国内实验室设备的专业代理商，上海昊扩始终坚守为客户提供优质产品和服务的初心。我们深感荣幸能与欧洲冷藏和冷冻设备专家Liebherr达成战略合作，借助Liebherr的技术优势和产品实力，上海昊扩将不遗余力，为客户提供更加优质、专业的服务，助力Liebherr开拓中国市场，进一步实现品牌的快速发展。 关于上海昊扩：上海昊扩科学器材有限公司成立于2019年，总部位于上海，是一家实验室设备/耗材及分析仪器的综合服务商。公司致力于为生物、医药、物性检测、化工分析、食品、工业生产等相关领域客户提供国内外高科技专业设备以及技术咨询服务。→ 了解更多产品信息，欢迎访问官网：www.hankosci.com→ 产品咨询电话：李经理 18019039812

p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 第二届电镜网络会议(iCEM 2016)特邀报告 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 生物冷冻电镜大数据中的高效处理方法 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 张法-CCF.jpg" style=" HEIGHT: 267px WIDTH: 200px" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/dc7fdb41-74c6-43cb-b460-d66b7a4118a0.jpg" width=" 200" height=" 267" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 张法 副研究员 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 中国科学院计算技术研究所 /strong /p p strong 报告摘要： /strong /p p 　　近年来，随着成像设备和处理方法的飞速发展，冷冻电镜三维重构技术已成为确定生物大分子三维结构的第一选择，生物学家利用冷冻电镜解析了大量生物大分子的高分辨率三维结构。我国已具有全世界最先进和最大规模的冷冻电镜硬件实施，这些设施每天都在产生海量的生物大数据。如何对冷冻电镜大数据进行高效处理已成为计算科学所面临的关键科学问题。本报告将从科学计算的角度讨论冷冻电镜数据处理中的科学问题，并介绍本领域最近的研究成果。 /p p strong 报告人简介： /strong /p p 　　张法，博士，中国科学院计算技术研究所副研究员，博士生导师。CCF生物信息学专业组委员，秘书长。中国生物物理学会冷冻电镜显微学分会理事。2002-2005年，作为国际交换学生在美国俄亥俄州立大学(Ohio State University)客座访问，2009-2010年，在西班牙胡安卡洛斯国王大学(Universidad Rey Juan Carlos)进行客座访问。 /p p 　　长期从事生物信息学和高性能计算方面的研究，目前主要从事生物大分子冷冻电镜三维重构方面的研究。作为项目负责人和主要参与人主持和参与了多项国家自然科学基金重点项目、国际合作重大项目、中科院知识创新重大项目、中科院战略性先导项目(B类)等多项国家项目，作为第一作者或通信作者在国内外著名期刊和国际会议上发表论文60余篇。开发完成了国内首款冷冻电镜三维重构系统AuTOM，其中电子断层数据对位软件Markerauto 和三维重构软件ICON已成为本领域知名软件，帮助生物学家取得了重要的生物学发现。 /p p strong 报告时间： /strong 2016年10月26日下午 /p p span style=" COLOR: #ff0000" strong 报名链接： /strong strong a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html" target=" _blank" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html /a /strong /span /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html" target=" _self" img src=" http://www.instrument.com.cn/edm/pic/wljt2220161009174035342.gif" width=" 600" height=" 152" / /a /p

p 　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。 /p p style=" text-align: center " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style=" width: 600px height: 350px " / /p p 　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F sub 420 /sub -还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。 /p p 　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。 /p p 　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。 /p p 　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。 /p p 　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。 /p p 　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。 /p p 　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。 /p p 　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。 /p p 　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟） /p p & nbsp & nbsp 原文检索： a href=" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short /a /p

p style=" text-align: center " strong 第四届全国冷冻电子显微学与结构生物学专题研讨会在京举行 /strong /p p 　 strong 　仪器信息网讯 /strong 2015年6月8日-11日，第四届全国冷冻 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" 电子显微 /a 学与结构生物学专题研讨会在北京举行，本次会议的主题为“中国冷冻电子显微学的新阶段”。这是冷冻电镜研究领域第一次独立举行的全国性会议，相比于2009年在中国电子显微学年会期间二三十人的一个分会场，此次会议的参加人数达到了近200人。来自海内外的华人学者共聚一堂，交流冷冻电子显微学的最新研究成果。 /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　三十年的坚持与守望 /strong /span /p p 　　据了解，我国在该领域的研究起始于上个世纪八十年代，当时国内的条件非常艰苦，电镜都没有几台，更不用说计算机、软件系统。然而就是在当时那样艰苦的条件下，以清华大学隋森芳院士为代表的老一辈科学家因为看好这一技术的发展前景，依然坚持推进我国在这一领域的研究工作。同时，一直以来许多海外学者对于国内冷冻电子显微学的发展给予了极大的支持和帮助。 /p p 　　隋森芳在此次会议中多次提到海外学者对于我国冷冻电子显微学发展的贡献。他说：“我们所有这个领域的人都不能忘记他们的贡献。在上个世纪90年代，国内的条件非常困难，我们还处在起步阶段。王大能、周正洪他们这些在国外都已经很有名的学者，每次回来都会来我们的实验室，不分日夜的帮我们安装软件、调试程序，手把手的教学生制样，培养学生。一直到现在，程亦凡、隋海心、章佩君、徐晨等许多海外学者还经常到国内来交流和培训学生。” /p p span style=" color:#0000ff " 　　 strong 迎来新的发展阶段 /strong /span /p p 　　近几年来，随着国家科研投入的加大以及一批优秀的海外学者回到国内。我国在该研究领域与国际先进水平的差距逐渐缩小。在本次会议上就有不少优秀的研究成果展示，如清华大学施一公教授研究组在世界上首次揭示了人源& amp #947 分泌酶复合物(& amp #947 -secretase)的精细三维结构 清华大学王宏伟、生物物理所刘迎芳课题组合作揭示了A型流感病毒RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构等。 /p p 　　另外，还有一些学者已经开始从事方法学的研究，尽力去发展完善这一技术。如：中科院生物物理所孙飞与中国科学院计算技术研究所张法合作开发了针对断层扫描成像三维重构算法ICON。 /p p 　　北京大学尹长城介绍说：“在2009年第一届会议上，只要是相关的研究，都可以在会议上作报告。但是现在只有高水平的研究成果才有机会展示。”美国匹兹堡大学教授章佩君也表示：“本次会议报告的水平非常高，我们看到了许多一流的研究成果。” /p p 　　同时为了推进人才培养，近年来国内组织开展了一系列的培训班。如自2008年起每隔一年举行的郭可信电子显微学和晶体学暑期培训班，以及自2013年起每隔一年举行的国际冷冻电镜图像处理技术培训班和今年开始举行的冷冻电镜成像技术培训班。 /p p 　　当前，我国已经有许多年轻的学者成长起来，他们在国际顶尖的实验室做着非常出色的工作，如：英国MRC的白晓辰、畅磊福，还有美国加州大学洛杉矶分校的江健森等。 /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　百尺竿头 更进一步 /strong /span /p p 　　虽然目前我国在该领域的研究取得了一定的成绩，隋森芳仍然提出：“国内冷冻电子显微学研究这5年的发展非常快，也有一些重要的成绩，但总的来说都还是点，整个领域还需要进一步发展。” /p p 　　另外，国内科研的软环境与国外相比还是有一定的差距。中科院生物物理所黄小俊介绍说，“目前国内研究所需的一些耗材试剂，需要从国外采购，这样不仅耗时、遇到问题沟通交流也不是很方便。”据了解，有时遇到试剂质量问题，甚至会给科研人员的研究带来不必要的困扰，耽误研究进程。 /p p 　　还有伴随着国内冷冻电子显微学的快速发展，技术人才短缺的问题逐渐显现出来。在本次会议上，国家蛋白质科学研究中心(上海)研究员丛尧，还有浙江大学教授洪健都发出了求贤令，希望能有合适的人才加入工作。洪健在会议中表示：“由于待遇体制等方面的原因，引进课题负责人相对容易，要招到合适的冷冻电镜技术人员却很难。” /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　科研文化的坚守与传承 /strong /span /p p 　　近年来，随着冷冻电镜仪器、直接电子探测相机、图像处理算法的发展，冷冻电镜的分辨率取得了革命性的突破，吸引了越来越多研究人员的关注，许多以X射线晶体学、NMR为技术手段的研究人员也开始进入这一领域。 /p p 　　在隋森芳院士看来，我国冷冻电镜领域的研究人员就像一个大家庭，海内外的研究人员关系一直非常融洽。长期以来，大家相互帮助、相互支持，有很多的交流和合作。他殷切的期望这种文化氛围随着该领域人员队伍的壮大，依然能够得到很好的坚守和传承。 /p p 　　同时，隋森芳指出冷冻电镜的工作需要积累，要做好这一工作，需要从样品制备、电镜技术、结构解析，到问题的解决都要去学习，这是一个系列的完整的工作，切忌急功近利，要耐得住性子，仔细的做好这项工作。 /p p 　　据了解，到目前为止我国已经在清华大学、生物物理所、国家蛋白质科学中心(上海)采购并安装了最先进的Titan Krios透射电子显微镜，浙江大学的第一台Titan Krios即将落户，而电镜三维重构技术的发源地英国目前也只有一台类似的冷冻电子显微镜。王宏伟表示：“和老一辈科学家的艰苦条件相比，我们现在的科研环境好了很多，我们应该抓住机遇，做出更好的成绩。” /p p style=" text-align: right " strong 　　撰稿：秦丽娟 /strong /p p style=" text-align: center " a href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/201565105926.gif" style=" width: 600px height: 151px " / /a /p