推荐厂家
暂无
暂无
俺公司新建一实验室,做酶免,胶金,核酸扩增,请问需要哪些仪器
如下手持式基因与核酸扩增分析仪的市场需求怎么样?[img=,690,975]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907121534081873_2288_2963345_3.jpg!w690x975.jpg[/img]
【参数解读】基因扩增仪(PCR)的技术参数解读与使用PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。请您来解析:1、普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类仪器有何异同?http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/02/201502251536_536341_1608710_3.png2、我们应该如何根据检测需求来选购PCR的四类仪器?根据检测的定量要求来选择仪器类型。3、PCR的核心参数都有哪些?核心参数是温度控制。4、梯度PCR仪可以分离不同DNA的片段吗?与普通PCR的异同在哪?梯度PCR可以分离不同DNA片段,与普通PCR仪不同的地方在于。可以设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样可节省试验时间、提高实验效率,又节约实验成本。5、使用过程中常见的问题PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污 染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于 密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染. (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物 污染,就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大. 二、污染的监测 一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染. 对照试验 1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照. 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染. 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 三、防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸 样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染. (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装,如有可能,PCR反应液应预先 配制好,然后小量分装,-20℃保存.以减少重复加样次数,避免污染机会.另外,PCR试剂,PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一 冰箱. (四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. (五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. (六)减少PCR循环次数,只要PCR产物达到检测水平就适可而止. (七)选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前 应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻,以防管内液体溅出. 常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致