磁畴观察显微镜

应用专家 易海英 荧光现象荧光是指荧光物质在特定波长光照射下，几乎同时发射出波长更长光的过程(图1)。当特定波长(激发波长)的光照射一个分子(如荧光团中的分子)时，光子能量被该分子的电子吸收。接着，电子从基态(S0)跃迁至较高的能级，即激发态(S1’)。这个过程称为激发①。电子在激发态停留10-9–10-8秒，在此过程中电子损失一些能量②。电子离开激发态(S1)并回到基态的过程中③，会释放出激发过程中吸收的剩余能量。荧光分子在激发态驻留的时间为荧光寿命，一般为纳秒级别，是荧光分子本身固有的特性。利用荧光寿命进行成像的技术叫荧光寿命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM)，可以在荧光强度成像之外，更加深入地进行功能性精准测量，获取分子构象、分子间相互作用、分子所处微环境等常规光学成像难以获得的信息。荧光的另一个重要特性是Stokes位移，即激发峰和发射峰之间的波长差异（图2）。通常发射光波长比激发光波长更长。这是由于荧光物质被激发之后、释放光子之前，电子经过弛豫过程会损耗一部分能量。具有较大Stokes位移的荧光物质更易于在荧光显微镜下进行观察。图2：Stokes位移荧光显微镜及荧光滤块荧光显微镜是利用荧光特性进行观察、成像的光学显微镜，广泛应用于细胞生物学、神经生物学、植物学、微生物学、病理学、遗传学等各领域。荧光成像具有高灵敏度和高特异性的优点，非常适合进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中的分布的观察，共定位和相互作用的研究，离子浓度变化等生命动态过程的追踪等等。细胞中大部分分子不发荧光，想要观察它们，必须进行荧光标记。荧光标记的方法非常多，可以直接标记（比如使用DAPI标记DNA），或利用抗体抗原结合特性进行免疫染色，也可以用荧光蛋白（如GFP，绿色荧光蛋白）标记目标蛋白，还可以用可逆结合的合成染料（如Fura-2）等。图3：Leica DMi8倒置荧光显微镜及滤片转轮目前荧光显微镜已成为各个实验室及成像平台的标配成像设备，是我们日常实验的好帮手。荧光显微镜主要分为三大类：正置荧光显微镜（适合切片）、倒置荧光显微镜（适合活细胞，兼顾切片）、荧光体视镜（适合较大标本，如植物、斑马鱼（成体/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。荧光滤块是显微镜荧光成像的核心部件，由激发滤片、发射滤片和二向分光镜三部分组成，安装在滤片转轮里，如Leica DMi8配有6位滤片转轮（图3）。不同的显微镜转轮位数会有区别，也有些显微镜使用滤块滑板。滤块在荧光成像中起着重要作用：激发滤片选择激发光来激发样品，阻挡其他波长的光；通过激发滤片的光经过二向分光镜（其作用是反射激发光和透射荧光），反射后通过物镜聚焦，照射到样品，激发出对应的荧光即发射光，发射光被物镜收集，透过二向分光镜，到达发射滤片。如图4中：激发波长为450-490nm，二向分光镜反射短于510nm的光、透过长于510nm的光，发射光接收范围为520-560nm。图4：荧光显微镜光路图荧光显微镜常用荧光滤块可分为长通（long pass，简称LP）和带通（band pass，简称BP）两种类型。带通通常由中心波长和区间宽度确定，如480/40表示可通过460-500nm的光。长通滤色片如515 LP，表示可以通过波长长于515nm的光（图5）。图5：FITC光谱曲线及滤片荧光物质具有其特征性激发（吸收）曲线和发射曲线，激发峰为最佳激发波长（激发效率最高，从而可以降低激发光能量，保护细胞和染料），发射曲线为发射荧光波长范围。因此，在实验中，我们会尽可能选择与激发峰最接近的波长进行激发，而接收范围需包括发射峰。如Alexa Fluor 488的激发峰为500nm，在荧光显微镜中可以选择480/40的激发滤片。图6：Alexa Fluor 488光谱曲线滤块的详细信息可以在显微镜成像软件里看到。了解染料并找到最匹配样品的滤块对于荧光成像有着至关重要的作用。荧光染料和荧光蛋白的光谱信息一般在说明书中会注明，也可在网上查阅（如https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/、https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-proteins-introduction-and-photo-spectral-characteristics/）。滤块的选择除考虑荧光探针的激发、发射波长，对于多色标记样品还需考虑是否有非特异激发、是否串色。此外还需考虑所使用的荧光光源，目前常用的荧光光源有汞灯、金属卤素灯，以及近年来飞速发展的LED光源。荧光光源的光谱有连续的和非连续的，在不同波段能量也会不同。LED光源因为其相对较窄的光谱带、更稳定的能量输出、超长的寿命、更安全环保等诸多优点，正逐步成为荧光显微镜的主要光源。除了显微镜内置的滤块，还有外置快速转轮（图7），徕卡的外置快速转轮相邻位置滤片转换速度为27ms，可实现高速多色实验，如FRET及Fura2比例钙成像（图8）等。图7：徕卡外置快速转轮EFW图8：钙成像，Fura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats. Courtesy of: Drs. Kazunori Kanemaru and Masamitsu Iino, Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo 丰富多样的荧光显微成像技术为了满足不同的荧光成像需求，除荧光显微镜外，还发展出了各种荧光显微成像解决方案：? 宽场高清成像系统，如Leica THUNDER Imager，采用Leica创新的Clearing专利技术，在成像时高效去除非焦平面干扰信号，呈现清晰图像，同时兼有高速成像的优点；? 共聚焦激光扫描显微镜，利用针孔排除非焦平面干扰，实现光学切片，得到高清图像及三维立体图像；? 突破衍射极限的超高分辨率显微镜及纳米显微镜，可对小于200nm的精细结构进行观察；? 利用多光子激发原理进行厚组织及活体深层成像的多光子成像系统；? 具有高时空分辨率的光片成像技术，成像速度快、分辨率高、光毒性低，特别适合进行发育、活体动态观察等研究；? 荧光寿命成像(FLIM），不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响，能更加深入地进行功能性精准测量；? 荧光相关光谱(FCS)及荧光互相关光谱(FCCS），测量荧光分子的分子数、扩散系数，从而分析分子浓度、分子大小、粘性、分子运动、分子结合/解离、分子的光学特性等；? 全内反射荧光显微镜(TIRF)，极高的z轴分辨率，非常适合细胞膜表面的分子结构和动力学研究。 荧光显微成像技术应用广泛，种类丰富，而且新技术还在不断涌现，大家可以选择最适合的技术去完成自己的研究。

从古至今，人类一直在追寻更高更远的真相，从远洋航行到太空探索，人们不断征服一个个宏伟的目标，但是人们肉眼所见的宏观世界不是世界的全部，还有人眼无法看清的微观世界，它同样也吸引着无数人去探索和追寻。无论宏观还是微观事物，我们的观测都是基于三维空间的属性，即XYZ三维，而对事物形态变化的观察则需要再引入一个衡量因素--时间T，因此对事物观察的最完备方式一定是XYZT的同时记录，即形态+时间的长时间摄影，这也是显微镜的终极功能。经过三百多年的发展，现代显微镜提出分辨率、景深、视野等概念，并不断提出解决方案，显微镜已经初步满足我们对微观世界观察的需求，帮助我们记录下微观世界的空间和时间。微观世界观察最重要的是细节的分辨，分辨率的概念便由此诞生，分辨率是指人眼可以区分的两个点之间的最小距离，只在XY维度有效，根据瑞利判据，Rayleigh Criterion，正常人能分辨的极限是明视距离25cm处0.2mm的两个点，当我们使用显微镜后，我们可以看清更小距离的两个点，这便提升了我们观察的分辨率。随着现代研究的不断深入，人们对分辨率的要求也在不断提高，而科学家们也在不断的提升显微镜的分辨率，如电子显微镜将分辨率提升至纳米级别，实现了对病毒的观察，超高显微成像技术，将显微镜的分辨率从200纳米提升到几十纳米，实现了对活细胞细胞器的观察。分辨率的提升也带来了新的问题，即视野和景深的减小，当用普通中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA，可见光波长范围为400—700nm，取其平均波长550nm，波长是固定常量，因此，增大NA数值，即可得到更小的D值，也就是可以分辨的两点之间的距离更小，可以让人眼看清楚更小的物体。NA值即数值孔径，描述了透镜收光锥角的大小，NA = n * sinα，即透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积。n为物镜与样本之间介质的光折射率，当显微镜物方介质为空气时，折射率n = 1 , 采用折射率高于空气的介质，可以显著提高NA值，水浸介质是蒸馏水，折射率为1.33；油浸物镜介质是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52左右，接近透镜和载玻片的折射率，因此，油镜的NA值高于空气镜。孔径角又称“镜口角”，是透镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度，增大镜口角，可以提高正弦值，其实际上限约为72度（正弦值为0.95），乘以香柏油折射率1.52，可以得出最大NA值为1.45左右，代入分辨率计算公式，可以得出常规显微镜极限XY平面分辨率为0.2um左右。NA值还会直接影响显微镜的视野亮度（B）。由公式B∝N.A.2/ M2 我们可以推出，亮度随数值孔径（N.A.）的增大或者物镜倍率（M）的降低而增加。从理论上来说，我们应该追求尽可能高的NA值，以获得更好的XY平面分辨率和视野亮度。然而凡事都有两面性，XY平面分辨率的提升，会带来Z轴景深和观察视野的减小。显微镜一般都是垂直向下取景的，通过视场直径内观察到的物体表面凸起的位置与凹下的位置都能够看的很清楚时，那么凸点与凹点之间的高度差就是景深了，对于显微镜来说景深越大越好，景深越大在观察高低不平整的物体表面时，能够得到更好更立体的清晰度画面，大景深有助于我们对微观世界进行垂直方向形态的观察，也就是XYZ三维形态中的Z轴信息。景深就是象平面上清晰的象所对应物平面的前后空间的深度：dtot=(λ*n)/NA + n/(M∗NA) * e，dtot：景深，NA ：数值孔径，M ：总放大率，λ：光波波长, （通常λ=0.55um），n: 试样与物镜之间介质的折射率（空气: n=1、油: n=1.52）根据这个公式，我们可以知道，Z轴景深与XY平面NA值成反比。除了景深外，视野也受到NA值的影响，通过仪器固定注视一点时所能看见的空间范围即视野，它的计算与物镜的放大倍数直接相关，观察所看到的实际视野直径等于视场直径除以物镜的放大倍数，目镜会表明对应视场数，如10/18，即放大倍数10倍，视场直径18mm，因此当目镜确定后，放大倍数越大则观察的视野越小。XY平面分辨率是对局部细节的解析，而视野则决定了我们对样本的观察范围，视野必然是越大越好，但受限于当前的技术，我们必须采用高倍物镜，才可以得到良好的NA值，因此,视野和NA值有间接的负相关系。当我们需要观察的样本大于我们的视野时，每次观察只能看到一个局部，为了解决这个问题，拼图技术便应运而生。通过在XY方向移动样本，连续拍下不同位置的图像，最后拼接在一起，就可以得到一张全视野的图像。▲镜下局部视野▲拼接后全视野▲手动拼接▲自动拼接(图源：Echo显微镜)拼接分为手动和自动两种，手动拼图成本低廉，但是对人员的操作水平，经验要求很高，如上图，操作人员稍有不慎，就会出现图片接缝问题，同时手动拼图速度慢，不适合大批量，高通量样本处理，比如医院病理科日均上百病理切片观察，手动拼图方式无法满足要求。自动拼图的核心部件是全自动载物台，结合软件，可自动实现全自动，大范围全视野拍摄，结合自动Z轴对焦补偿，即可得到全视野的清晰图像。Echo Revolution 全自动荧光显微镜Echo Revolution全自动荧光显微镜，将XYZ三轴全部实现电动化，从而实现自动完成多图拼接的大视野高分辨率成像，而电动化的Z轴可以帮助用户实现自动聚焦、自动定焦和Z-Stacking 多层扫描大景深成像。Echo Revolution全自动荧光显微镜还添加了延时摄影功能，可以帮助用户实现长时间观察和时间回溯，使用户可以进行更全面的观察实验。

科学家们一直希望能够更清楚地看到大脑是如何工作的。以前研究人员只能在电子显微镜下摆弄死亡的脑细胞，而从来没有用高分辨率显微镜清晰地看到活的脑细胞在有生命的动物体内的活动图景。据美国物理学家组织网近日报道，现在，德国马克斯普朗克研究所的物理学家斯蒂芬和其同事将这一梦想付诸实现。相关论文刊登在最新一期美国《科学》杂志上。　　斯蒂芬与该研究所的其他研究者多年来一直在研发一种被叫做“受激发射损耗” (STED)的超高分辨率显微镜。现在，他们将这项工作提高到一个新的水准。为了让实验结果更清晰，他们首先对一只老鼠的特定脑细胞进行基因修改，使其能够发出荧光，然后切掉老鼠头盖骨的一小部分，放进玻璃器皿里，通过STED观察那些发亮的脑细胞。同时，研究人员启动STED中所装置的软件以遮盖鼠脑里那些没有变亮的部分，这样即可在有生命的老鼠外部实时地再现出神经细胞的高清活动影像。　　这个新型显微镜提供的清晰度可以达到70纳米级以下，四倍于以前的显微镜，足以帮助科学家观察到脑部树突棘的活动，树突棘是存在于哺乳动物大脑神经元树突上的小突起，构成中枢神经系统兴奋性突触传递的原始位点。　　研究人员未来将有可能进一步发现这种新型显微镜的许多种用途，而其中最重要的领域是用于观察治疗精神病药物在脑部神经元突触里是如何工作的，也许还会引发制药学针对特殊疾病开发新药的突破性进展。