蛋白纯化工作站

[font=宋体]重组蛋白的表达（尤其是使用细菌载体和宿主）是一项成熟的技术。难点在于如何将其以活化形式分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]蛋白标签[/b][/url]是一种可以提高重组蛋白的溶解度、简化蛋白纯化的简单有效的工具，并通过简单的方法跟踪蛋白表达和纯化过程。此外，蛋白标签是追踪活细胞中蛋白和进程的一种有效工具，可以通过显微镜直接跟踪或者通过[/font][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]、免疫沉淀或免疫染色间接进行跟踪。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification]蛋白纯化[/url]操作步骤：[/b][/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同表达系统的蛋白纯化服务，有细菌系统蛋白纯化、哺乳动物瞬时系统蛋白纯化、杆状病毒系统蛋白纯化。详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

有网友建了一个蛋白纯化群，大家可以一起交流学习，欢迎加入！号码：75501967

[font=宋体] [font=宋体]重组蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体][b]重组蛋白纯化常用的几个方法如下：[/b][/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]1.[/font][font=宋体]蛋白纯化色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]色谱法无疑是下游处理中主要和常用的操作，因为色谱法相比其他单元操作具有某些优势。例如色谱法支持高分辨率的效率，可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外，色谱法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池，其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备，但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]2.[/font][font=宋体]亲和色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]亲和色谱法依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上与其相结合。亲和层析通常是最有效的纯化方法，通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标物，同时去除溶液中的污染物或其他分子，并一步富集或纯化目标分子，使其与其他不能结合配体的分子分离。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]除了理论上蛋白能够通过免疫亲和色谱纯化之外，亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白，而免疫亲和色谱是所有亲和技术中特异性最高的。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]3.[/font][font=宋体]离子交换色谱法：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]离子交换色谱[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换色谱法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [font=Calibri]4.HPLC[/font][font=宋体]法蛋白纯化：[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]色谱法是一种常用分析技术，可以将混合物分离成单独的成分。高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法通常称为[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]，在化学生物学研究实验室中广泛应用。[/font][/font][font=宋体] [font=宋体]在化学生物学中，单个分析物（如多肽）通常经色谱纯化后作为一种功能工具使用。高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法[/font][font=Calibri](HPLC)[/font][font=宋体]是一种用于分析和分离液体样品的方法。在化学生物学实验室中，[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]是纯化多肽（人工合成或用合成器自动合成）和其他中小型有机分子不可或缺的过程。它还允许使用颗粒非常小的柱填料，这就给固定相和流经它的分子之间产生相互作用提供了更大的表面积，这样可以更好地分离混合物的成分。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]针对特定应用开发的[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]色谱柱有很多种类，如正相[/font][font=Calibri]HPLC(NP-HPLC)[/font][font=宋体]和反相[/font][font=Calibri]HPLC(RP-HPLC)[/font][font=宋体]。正确选择色谱柱是获得良好的[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]结果的关键。色谱柱的选择取决于我们希望分离的混合物的组分特性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供从基因合成、载体构建到蛋白质表达、纯化的一站式服务，可以根据客户需求，选用不同表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化标签、表达宿主等，真正为客户实现深度私人定制。多种纯化体系，为蛋白表达、纯化提供多种选择，我们致力于为客户提供高质量、低成本的重组蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白表达纯化服务[/b][/url]详情尽在：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]

AKTA蛋白纯化系统是当前重组蛋白表达与纯化服务中经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。

[font=宋体][font=宋体]在生物科学领域，[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白质纯化[/b][/url]是一个至关重要的过程，它有助于获取单一、高纯度的蛋白质，以便进行结构和功能分析。在这个过程中，二硫苏糖醇（[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]）作为一种常用的还原剂，扮演着不可或缺的角色。本文将详细探讨[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]在蛋白纯化中的重要作用。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]的作用机制[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]是一种小分子化合物，具有很强的还原能力。其主要作用是还原蛋白质中的二硫键。在蛋白质中，二硫键的形成对于维持蛋白质的高级结构和功能至关重要。然而，在进行蛋白质纯化时，这些二硫键有时会成为障碍，影响蛋白质的分离和纯化。此时，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]就派上了用场。通过与二硫键反应，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]能够将其还原为巯基，从而打破原有的二硫键，降低蛋白质的聚合倾向，使其更容易进行后续的纯化步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]二、[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]在蛋白纯化中的应用[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]打破二硫键：在许多蛋白质中，二硫键的形成维持了蛋白质的高级结构。在纯化过程中，为了更好地分离和纯化蛋白质，需要打破这些二硫键。[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]的引入可以有效地实现这一目标。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]防止蛋白质聚合：某些条件下，蛋白质可能会发生聚合，这会影响纯化的效果。[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]可以通过还原二硫键，降低蛋白质的聚合倾向，从而提高纯化的效率和效果。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]辅助蛋白质的分离和纯化：在某些情况下，蛋白质的电荷性质会因为二硫键的存在而受到影响，这会影响到蛋白质在电泳或离子交换等分离技术中的行为。此时，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]可以改变蛋白质的电荷性质，使其更容易被分离和纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三、使用[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]时的注意事项[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]虽然[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]在蛋白纯化中具有广泛的应用，但使用时仍需谨慎。首先，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]具有一定的还原性，可能会影响某些实验的准确性或导致非特异性反应。因此，在使用[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]处理蛋白质样品时，应充分考虑其对实验的影响。其次，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]的处理时间、浓度等条件需要进行优化，以避免对目标蛋白造成不必要的修饰或破坏。最后，处理过的蛋白质样品应及时进行下一步分析或保存，以避免重新形成二硫键或发生其他变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]四、总结[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总的来说，[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]在蛋白纯化中起到了重要的作用，它能够还原二硫键、打破蛋白质的高级结构、降低蛋白质的聚合倾向等。然而，使用[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]时也需要注意其对实验的影响和可能带来的问题。未来随着研究的深入和技术的发展，我们期待更加高效、准确的蛋白纯化方法出现，为生物科学领域的研究提供更多可能性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化详情可以关注义翘神州！[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol][b]蛋白纯化[/b][/url]是生物实验室和制药工业中至关重要的技术。它涉及从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，同时保持蛋白质的结构和功能。了解蛋白纯化的原理和步骤不仅有助于提高实验效率，还可以降低实验失败的风险。在本篇文章中，我们将详细介绍蛋白纯化的定义、原理和步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化定义及原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高，再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤，因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱，有时其他色谱步骤中会使用恒压泵，然而蛋白纯化系统将提供更多的控制，可获得更详细的目标蛋白和杂质信息，并为色谱柱提供更好的保护。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]可溶性蛋白纯化的步骤[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]用于分离可溶性重组或非重组蛋白的分离方法取决于蛋白的内在生理化学特性（被标记蛋白除外）。典型的纯化方案如下所示（使用离子交换色谱法）。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、细胞裂解液[/font][/font][font=宋体]澄清裂解液[/font][font=宋体][font=宋体]离心（[/font][font=Calibri]60000[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]90 [/font][font=宋体]分钟）过滤或脱盐和交换缓冲液[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、澄清裂解液[/font][/font][font=宋体]①用亲和法[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）进行[/font][font=Calibri]DEAE-Sepharose[/font][font=宋体]离子交换[/font][/font][font=宋体]交换缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）进行离子交换[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 弱阳离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]羧甲基[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 强阳离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]甲基磺酸盐[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 强阴离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]季铵盐[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 弱阴离子[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]二乙氨基乙基[/font][/font][font=宋体]? 磷酸纤维素[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）用其他色谱方法[/font][/font][font=宋体]? 染料基质[/font][font=宋体]? 疏水[/font][font=宋体]? 羟磷灰石[/font][font=宋体]? 层析聚焦[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②浓缩[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③进行凝胶过滤[/font][font=宋体]④无菌过滤[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、经纯化的蛋白[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]包涵体蛋白的折叠与纯化[/b][/font][font=宋体]在大肠杆菌中表达的重组蛋白位于细胞裂解后低速颗粒部分，它们高度聚集。包涵体通常来自于细胞质（或细胞周质，如使用了分泌载体）中的蛋白聚集。如前所述，由于与细菌核酸的相互作用，蛋白也可以位于低速或高速颗粒部分中。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]采用蛋白变性剂提取蛋白，如盐酸胍[/font][font=Calibri](Gu[/font][font=宋体][/font][font=Calibri]HCl)[/font][font=宋体]、尿素或有机酸。使用还原剂二硫苏糖醇[/font][font=Calibri](DTT)[/font][font=宋体]防止人工二硫键形成（尤其是分子间键）。变性后的蛋白可以通过各种方法纯化后再折叠，也可以直接折叠。通常建议在折叠前进行一些纯化（如[/font][font=Calibri]Gu[/font][font=宋体][/font][font=Calibri]HCl[/font][font=宋体]中的凝胶过滤），因为这往往会带来更高的折叠产率。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原文转载：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol[/font][/font]

[font=宋体]蛋白纯化采用多种色谱技术，根据其性质的差异将产物分离。标签蛋白便于用亲和色谱法处理，亲和色谱法根据蛋白标签的生物识别来捕获靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中，亲和色谱法占主要地位。事实上，亲和色谱是最特异、最有效的蛋白纯化技术，为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理，即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代，人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产，任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此，下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和色谱法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换色谱法是一种常见的蛋白纯化方法，该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法，根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用色谱分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白，与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]下面是不同纯化方法的优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、亲和色谱法：[/font][/font][font=宋体]蛋白质特征：生物识别[/font][font=宋体]应用：受体和配体，酶和底物，抗原和抗体[/font][font=宋体][font=宋体]优点：[/font] [/font][font=宋体]①一次能够分离一种特定的蛋白[/font][font=宋体]②高回收率[/font][font=宋体]③快速分离[/font][font=宋体]缺点：要求配体具有高选择性[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、离子交换色谱法[/font][/font][font=宋体]蛋白质特征：电荷[/font][font=宋体]应用：带电分子[/font][font=宋体][font=宋体]优点：[/font] [/font][font=宋体]①高准确度和精度[/font][font=宋体]②高基质耐受性[/font][font=宋体]③高选择性[/font][font=宋体]缺点：柱间不一致性[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、尺寸排阻色谱法[/font][/font][font=宋体]蛋白质特征：大小[/font][font=宋体]应用：大分子，大分子复合物[/font][font=宋体][font=宋体]优点：[/font] [/font][font=宋体]①高回收率[/font][font=宋体]②明确的分离时间[/font][font=宋体]③可获得窄条带[/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]MW [/font][font=宋体]的需求存在差异[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、疏水作用色谱法[/font][/font][font=宋体]蛋白质特征：疏水性[/font][font=宋体]应用：表面具有疏水氨基酸侧链的蛋白和多肽[/font][font=宋体][font=宋体]优点：[/font] [/font][font=宋体]①高选择性[/font][font=宋体]②温和、非变性条件[/font][font=宋体]缺点：相互作用强[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白纯化方法[/b][/url]详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font][font=Calibri] [/font]

为了赚分啊 [img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=12683]蛋白纯化技术（GST）[/url]

[font=宋体][b]什么是抗体纯化？抗体纯化原理：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]抗体纯化是指从抗血清（[/font][font=Calibri]pAb[/font][font=宋体]）、腹水或杂交瘤细胞系（[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）细胞培养上清液中提取抗体的过程。纯化后的抗体适用于多种应用。该过程可以在提供抗体纯化服务的实验室中进行，如果有必需的设备和工具，也可以自行纯化。如研究人员担心原始研究的完整性受到破坏，可在实验室中进行纯化，确保研究快速进行。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体的主要来源之一是在动物体内生成的抗血清。在这种情况下，反复向动物体内注射抗原，直到抗体开发完成为止，其血液用于制备抗血清，经纯化后可获得多克隆抗体。抗体的另一个来源是克隆细胞，其作为相同细胞群的一部分生成抗体；这种方法用于大规模生产单克隆抗体。查看更多有关[/font][font=宋体]“单克隆抗体纯化”的信息。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]什么是蛋白纯化？[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白标签是一种可以提高重组蛋白的溶解度、简化蛋白纯化的简单有效的工具，并通过简单的方法跟踪蛋白表达和纯化过程。此外，蛋白标签是追踪活细胞中蛋白和进程的一种有效工具，可以通过显微镜直接跟踪或者通过[/font][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]、免疫沉淀或免疫染色间接进行跟踪。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白纯化原理：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供重组蛋白表达纯化服务和[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]，更多详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]

[b]职位名称：[/b]蛋白纯化工程师/经理[b]职位描述/要求：[/b]收藏职位信息液相色谱填料的技术应用，需配合公司销售人员对大区客户提供应用技术方案解决服务。1、根据客户需求，为客户推荐合适的产品，为销售制定和执行销售计划；2、负责公司生物大分子层析填料及层析设备的售后服务；3、帮助销售拓展客户及渠道，给销售培训相关层析技术；4、能够为客户纯化相关蛋白样品，给其制定合理的纯化方案。任职资格：1、生物工程或相关专业本科及以上学历，生物制药、生物化工、药学、免疫学等相关专业；2、两年以上生物制药企业纯化工作经验，熟练使用AKTA等层析系统；’3、具有在相关填料企业应用经验者优先；4、具备良好的沟通能力及自我管理能力；做事细心、认真，责任心强；富有团队合作精神；5、优秀应届生或1年以内工作经验者也可以培养。[b]公司介绍：[/b] 月旭科技（上海）股份有限公司2003年8月在上海张江高科技园区注册成立，2011年在浙江金华成立全资子公司，2014年10月完成股份制改造，2015年5月在全国中小企业股份转让系统（新三板）挂牌上市（股票代码：832463）。月旭科技集研发、生产、销售和服务为一体，致力为客户提供色谱分离分析技术、产品和整体解决方案。色谱技术广泛应用于生物医药、食品安全检测、环境监测、精细化工等关系民生并处于快速发...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/70433]查看全部[/url]

[font=宋体][b]蛋白纯化的原理：[/b][/font][font=宋体]不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]大多数的纯化方案需要不止一步才能达到理想的纯度水平。该过程中的每一步都会造成一定的产品损失，假设每一步的获得率为[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]。因此，建议尽可能减少纯化步骤。起始原料的选择是纯化过程设计的关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在背景信息、检测方法和样品规格都已到位的情况下，可以考虑采用三阶段纯化策略。纯化分为捕获、中度纯化和精细纯化三个阶段，每个阶段都有特定的目标。捕获阶段的目标是分离、浓缩和稳定目标产物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]蛋白纯化实际操作：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]理想情况下，最终的纯化过程包括样品制备，其中包括在需要时进行萃取和澄清，然后进行上述三个阶段的纯化。步骤的数量始终取决于所需的纯度和蛋白的预期用途。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]分析纯化通常利用三个特性来分离蛋白。首先，蛋白可以通过[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]梯度凝胶或离子交换柱，根据其等电点进行纯化。其次，根据蛋白大小或分子量，可以通过体积排除色谱法分离或通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE([/font][font=宋体]十二烷基硫酸钠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]聚丙烯酰胺凝胶电泳[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分析。通常采用[/font][font=Calibri]2D-PAGE[/font][font=宋体]对蛋白进行纯化，然后进行肽质量指纹图谱分析，以确定蛋白的特性。这对于实现科学目的非常有用，目前蛋白的检测限非常低，纳克级的蛋白足以用于分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]如何应用纯化原则：[/b][/font][font=宋体]①纯化技术的选择和组合：[/font][font=宋体]这种组合的目的是发展出一条最快的方法来获得所需纯度的产品。对于任何色谱分离来说，不同的技术在回收率、分辨率、速度和容量方面的表现都各不相同。我们可以对一种技术进行优化，使其专注于其中一个参数；例如分辨率要在速度和容量两个参数之间达到最佳。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分辨率是通过技术的选择和色谱基质产生窄峰的效率来实现的。一般来说，此时目标蛋白和杂质具有非常相似的性质，分辨率是最难实现的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②标签蛋白的纯化[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白中添加标签可以使蛋白具有它本来不具有的结合亲和力。通常重组蛋白是混合物中唯一具有这种亲和力的蛋白，有助于蛋白分离。最常见的标签是对镍或钴离子有亲和力的组氨酸标签（[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签）。因此，我们通过将镍离子或钴离子固定在树脂上，可以创建与组氨酸标签蛋白特异性结合的亲和介质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③评估纯化产量：[/font][font=宋体][font=宋体]通常使用[/font][font=Calibri]SDS PAGE[/font][font=宋体]监测纯化过程中的不同步骤。这一方法只能粗略地测量混合物中不同蛋白的量，并且无法区分具有相似分子量的蛋白。为了评估多步纯化的过程，必须将特定蛋白的量与总蛋白的量进行比较。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白表达纯化实验中注意事项有哪些？[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]融合表达时在选择外源[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]菌液[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值要小于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]，否则细胞太浓太老，不易破碎，且质粒易丢失。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]诱导温度适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. IPTG[/font][font=宋体]浓度：一般在[/font][font=Calibri]1 mM [/font][font=宋体]以内，可适当摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]7. [/font][font=宋体]超声条件可视实际情况改变，只要使菌体裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。[/font][font=宋体][b]义翘神州提供[/b][url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核蛋白纯化服务[/b][/url][b]，服务内容包括：[/b][/font][font=宋体]①基因合成及密码子优化[/font][font=宋体]②载体构建[/font][font=宋体]③表达鉴定和可溶性分析[/font][font=宋体][font=宋体]④放大表达和[/font][font=Calibri]1-2[/font][font=宋体]步纯化[/font][/font][font=宋体]⑤大量表达及纯化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service[/font][/font]

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白纯化[/b][/url]是生物学实验中的关键环节，旨在从复杂的生物样本中分离和提纯出目标蛋白质。然而，在蛋白纯化的过程中，研究人员常常会遇到各种问题和挑战。这些问题可能源于样本的复杂性、蛋白质的特性，或是纯化技术的局限性。为了成功地进行蛋白纯化，理解并解决这些常见问题至关重要。下面是关于蛋白纯化的相关问题解析，希望对你有帮助：[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、蛋白质的纯化技术有哪些？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①沉淀法[/font][font=宋体]②电泳[/font][font=宋体][font=宋体]在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：[/font][font=宋体]①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。此法简单但回收率低。②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。[/font][/font][font=宋体]③色谱法：[/font][font=宋体][font=宋体]色谱法（[/font][font=Calibri]chromatography[/font][font=宋体]）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（[/font][font=Calibri]high-performance liquid chromatography,HPLC[/font][font=宋体]）。凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。[/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]包括反相高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（[/font][font=Calibri]reversed-phase HPLC,RP-HPLC[/font][font=宋体]）、离子交换高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（[/font][font=Calibri]ion exchange HPLC[/font][font=宋体]）等。根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、什么是最好的蛋白质纯化方法？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常见的蛋白质纯化方法包括色谱法（如凝胶过滤、离子交换和亲和色谱）、电泳法（如[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Native-PAGE[/font][font=宋体]）以及沉淀法（如盐析和有机溶剂沉淀）。每种方法都有其独特的优缺点和适用范围。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]例如，凝胶过滤色谱适用于大规模纯化，能够基于蛋白质的分子量进行分离；离子交换色谱则适用于根据蛋白质的电荷差异进行分离；而亲和色谱则特别适用于那些与特定配体有高亲和力的蛋白质。电泳法则更适用于分析蛋白质的纯度或分离特定亚型的蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]综合考虑，我认为最好的蛋白质纯化方法应该是结合了多种纯化技术的综合方案。这种方案可以根据目标蛋白质的具体性质，灵活选择和应用不同的纯化技术，以达到最高的纯度和分离效率。此外，自动化和智能化的纯化系统也是未来的发展趋势，它们能够减少人为操作误差，提高纯化的稳定性和可重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，选择最佳的蛋白质纯化方法需要综合考虑多种因素，并可能需要根据实际情况进行调整和优化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]三、蛋白质纯化的一般策略是什么？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①纯化技术的选择和组合：[/font][font=宋体]这种组合的目的是发展出一条最快的方法来获得所需纯度的产品。对于任何色谱分离来说，不同的技术在回收率、分辨率、速度和容量方面的表现都各不相同。我们可以对一种技术进行优化，使其专注于其中一个参数；例如分辨率要在速度和容量两个参数之间达到最佳。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分辨率是通过技术的选择和色谱基质产生窄峰的效率来实现的。一般来说，此时目标蛋白和杂质具有非常相似的性质，分辨率是最难实现的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②标签蛋白的纯化[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白中添加标签可以使蛋白具有它本来不具有的结合亲和力。通常重组蛋白是混合物中唯一具有这种亲和力的蛋白，有助于蛋白分离。最常见的标签是对镍或钴离子有亲和力的组氨酸标签（[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签）。因此，我们通过将镍离子或钴离子固定在树脂上，可以创建与组氨酸标签蛋白特异性结合的亲和介质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③评估纯化产量：[/font][font=宋体][font=宋体]通常使用[/font][font=Calibri]SDS PAGE[/font][font=宋体]监测纯化过程中的不同步骤。这一方法只能粗略地测量混合物中不同蛋白的量，并且无法区分具有相似分子量的蛋白。为了评估多步纯化的过程，必须将特定蛋白的量与总蛋白的量进行比较。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]四、蛋白质纯化的色谱技术有哪些不同？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]以下是几种常见的蛋白质纯化色谱技术及其特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]凝胶过滤色谱（[/font][font=Calibri]Gel Filtration Chromatography[/font][font=宋体]）：也被称为尺寸排阻色谱，它主要根据蛋白质的分子量和形状大小来分离蛋白质。这种技术使用多孔的球形颗粒作为固定相，允许小分子量的蛋白质进入孔中并长时间滞留，而大分子量的蛋白质则不能进入孔中，因此会更快地洗脱出来。这种方法的优点在于设备简单、操作方便，且适用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖等多种物质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]离子交换色谱（[/font][font=Calibri]Ion Exchange Chromatography[/font][font=宋体]）：这种技术是基于蛋白质与离子交换剂的亲和力来分离蛋白质的。离子交换剂上的带电基团与蛋白质表面的带电基团相互作用，从而实现蛋白质的分离。这种方法适用于分离具有不同电荷或电荷密度的蛋白质。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]亲和色谱（[/font][font=Calibri]Affinity Chromatography[/font][font=宋体]）：亲和色谱是一种高度特异性的分离方法，它利用生物分子之间的特异性亲和作用来分离目标蛋白质。通常，亲和色谱使用一种与目标蛋白质有高度亲和力的配体作为固定相，当目标蛋白质流经色谱柱时，会与配体结合，从而实现分离。这种方法具有高分辨率和高选择性的优点，特别适用于分离含量极低或性质不稳定的蛋白质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总的来说，不同的色谱技术各有优缺点，选择哪种方法取决于目标蛋白质的性质、纯化的要求以及可用的设备和技术。在实际应用中，可能需要根据实际情况将不同的色谱技术组合使用，以达到最佳的纯化效果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白表达纯化服务[/b][/url]，详情关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

现在还有多少人在用Bio-CAD的蛋白纯化仪，我们单位有两台，非常不顺手。特别是它的六通阀是气动阀，不是电磁阀，非常费劲。有人把这个气动阀换成电磁阀吗？

请问论坛里有在用AKTA purifier 10蛋白纯化仪的吗？有转让的吗？有转让的可以联系我 18630125805

[b]职位名称：[/b]蛋白纯化应用工程师[b]职位描述/要求：[/b]1、负责客户抗体、疫苗、重组蛋白药物纯化工作，了解客户需求，提供技术解决方案2、负责蛋白类药物小试、中试及放大。3、填料检测性能方面略懂即可。任职资格：1、生物工程或相关专业本科及以上学历，2、具有蛋白类（抗体，疫苗及重组蛋白等领域）工作经验优先；3、具有在相关填料企业应用经验者优先；4、具备良好的沟通能力及自我管理能力。5、优秀应届生或1年以上工作经验者也可以培养。[b]公司介绍：[/b] 月旭科技（上海）股份有限公司2003年8月在上海张江高科技园区注册成立，2011年在浙江金华成立全资子公司，2014年10月完成股份制改造，2015年5月在全国中小企业股份转让系统（新三板）挂牌上市（股票代码：832463）。月旭科技集研发、生产、销售和服务为一体，致力为客户提供色谱分离分析技术、产品和整体解决方案。色谱技术广泛应用于生物医药、食品安全检测、环境监测、精细化工等关系民生并处于快速发...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/53108]查看全部[/url]

[font=宋体]在生物科学领域，蛋白质纯化是一项关键的技术，它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它具有分辨率高、分离效果好的优点。本文将介绍用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，包括实验准备、样品处理、层析柱的制作和上样、洗脱和收集等步骤。通过学习本文，读者可以了解凝胶过滤层析在蛋白纯化中的应用及其优缺点，为后续的实验和研究提供参考。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，主要分为以下步骤：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。[/font][font=宋体]杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。[/font][font=宋体]样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。[/font][font=宋体]洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。[/font][font=宋体]收集纯化蛋白：收集洗脱液，进行后续的分析或使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]以上步骤只是粗略的概述，实际操作时还需要注意许多细节和技巧。例如，选择合适的凝胶类型和柱子对纯化效果有很大影响；样品加载时需要防止样品泄漏；洗脱时需要选择合适的缓冲液等。因此，建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并请教有经验的实验人员。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]凝胶过滤层析（[/font][font=Calibri]Gel Permeation Chromatography[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]）具有以下优点：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①操作条件温和：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]不需要使用有机溶剂等强烈的条件，因此对样品的活性影响较小。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高分离效果：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可以分离不同分子量的蛋白质，且分辨率较高，能够实现样品的较纯分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③重复性好：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]的层析柱可以重复使用，分离效果稳定，有利于提高实验的可重复性和数据可靠性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④适用范围广：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在应用方面，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。例如，从混合物中分离纯化蛋白质、去除蛋白质中的盐和缓冲剂、脱去多糖和脂质等杂质、对蛋白质进行分子量测定等。此外，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]还可以用于分离合成多肽和基因克隆产物的纯度鉴定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，凝胶过滤层析具有温和的操作条件、高分离效果、重复性好等优点，被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体]蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高，再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤，因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱，有时其他色谱步骤中会使用恒压泵，然而蛋白纯化系统将提供更多的控制，可获得更详细的目标蛋白和杂质信息，并为色谱柱提供更好的保护。下面是关于蛋白纯化常见问题[/font][font=Calibri]FAQ[/font][font=宋体]解析：[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]通过 [/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除[/font][font=Calibri](1%-2%Tritonx-100)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri][b]2. [/b][/font][b][font=宋体]镍柱使用中出现棕色是怎么回事[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]出现这样的情况，主要是缓冲液中[/font] [font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]的影响， [/font][font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 [/font][font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]还原生成[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免[/font] [font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]的参与（一般的镍柱耐受小于 [/font][font=Calibri]5mM DTT,[/font][font=宋体]推荐缓冲液中不要超过[/font][font=Calibri]2mM DTT[/font][font=宋体]）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]镍柱堵了怎么办？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 [/font][font=Calibri]1-2mM DTT ([/font][font=宋体]上清样品处理要在冰浴中进行[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，还不行加尿素变性，使其在变形环境下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在[/font][font=Calibri]1/10-1/15 [/font][font=宋体]之间较适宜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 [/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]没能纯化到带 [/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）超声的功率不对[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放[/font][font=Calibri]) [/font][font=宋体]；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）样品或者是结合缓冲液不正确 ；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]策略：检测[/font] [font=Calibri]pH [/font][font=宋体]及样品和结合缓冲液的组成份（[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]）。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）组氨酸的标签没有完全的暴露 ；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]策略：在变性条件下[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]用 [/font][font=Calibri]8M [/font][font=宋体]脲，[/font][font=Calibri]6M [/font][font=宋体]盐酸胍[/font][font=Calibri],1%SDS) [/font][font=宋体]并加入 [/font][font=Calibri]1-2mMDTT [/font][font=宋体]进行纯化。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）[/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]标签丢失；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font] [font=Calibri]1[/font][font=宋体]：[/font][font=Calibri]WB [/font][font=宋体]或者 [/font][font=Calibri]anti-his [/font][font=宋体]的抗体检查 [/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]是否表达，上游构建，改变[/font][font=Calibri]his-tag [/font][font=宋体]的位[/font][font=Calibri](C-terminal or N-terminal)[/font][font=宋体]，必要时增加 [/font][font=Calibri]his [/font][font=宋体]个数[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]常用 [/font][font=Calibri]6-10 [/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font] [font=Calibri]2[/font][font=宋体]：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font] [font=Calibri]3[/font][font=宋体]：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]组氨酸[/font][font=Calibri])6 [/font][font=宋体]标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 [/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 [/font][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]。可以利用 [/font][font=Calibri]Hitrap IMACHP [/font][font=宋体]来筛选不同的金属离子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]蛋白挂在柱子上洗脱不下来[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]怎么解决？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低 [/font][font=Calibri]pH [/font][font=宋体]来找出最佳的洗脱条件。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）降低 [/font][font=Calibri]PH [/font][font=宋体]的方法洗脱的[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]因 为若 [/font][font=Calibri]PH [/font][font=宋体]低于 [/font][font=Calibri]3.5,[/font][font=宋体]会导致镍离子脱落 策略：改变洗脱办法[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]咪唑竞争性洗脱[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）蛋白已沉淀在柱上 策略：减少上样量和孵育的时间，试用去污剂[/font][font=Calibri](1%-2%Tritonx-100)[/font][font=宋体]或改变 [/font][font=Calibri]NaCl [/font][font=宋体]的浓度，或在变性条件下洗脱[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]用 [/font][font=Calibri]8M [/font][font=宋体]脲，或 [/font][font=Calibri]6M [/font][font=宋体]盐酸胍[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，最终也可在洗脱 [/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]中加入 [/font][font=Calibri]2mMDTT [/font][font=宋体]或者 [/font][font=Calibri]0.5%[/font][font=宋体]肌氨酸钠进行洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）非特异性疏水或其他相互反应 策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，[/font][font=Calibri]2%Triton X-100[/font][font=宋体]）或增加 [/font][font=Calibri]NaCl [/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]7. [/font][font=宋体]如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）去大肠杆菌自身带（两条 [/font][font=Calibri]30KD-40KD[/font][font=宋体]）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 [/font][font=Calibri]6000r/min,30min,10[/font][font=宋体]℃。（若效果不够可继续上述步骤）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 [/font][font=Calibri]1M/2M/4M/8M [/font][font=宋体]尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol][b]重组蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-protocol[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font]

[font=宋体][font=宋体]融合标签是已知的蛋白或多肽[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]可融合到目标蛋白上。在重组蛋白中，常常将目的蛋白末端与一些标签进行融合表达，这是为什么呢？常见的融合标签有哪些呢？它们都有什么区别呢？下面是[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]融合标签蛋白纯化[/b][/url]常见问题解析分享：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]：什么是融合标签？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]：融合标签是指利用 [/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]体外重组技术，在目的蛋白 [/font][font=Calibri]N [/font][font=宋体]端或 [/font][font=Calibri]C [/font][font=宋体]端进行融合表达的特定蛋白、多肽或寡肽标签。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]：融合标签有什么作用？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]：重组蛋白通过融合标签与包被在固相基质上的特异配基结合，使重组蛋白定向固定并得以纯化，大大简化了重组蛋白的检测，同时既能保留天然蛋白的大部分结构，又能实现增加溶解度，防降解，促进分泌，便于纯化等功能。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]：融合标签的分子量和功能有关吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]：蛋白融合标签的分子量越大，对蛋白质本身的功能影响越大，所以大分子融合标签一般只用于检测或蛋白纯化等。常见的小分子量的融合标签，因其具有很多商品化的标签抗体，可以节省使用者制备目的蛋白的单克隆抗体的时间与成本。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]：是否所有的融合标签都需要切除？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]：融合标签较小，免疫原性也很弱，一般不需要切除，对蛋白质的后续应用和研究不会产生影响。但是有些大标签是需要切除的，例如：[/font][font=Calibri]Dsb [/font][font=宋体]蛋白、[/font][font=Calibri]FkpA [/font][font=宋体]蛋白、[/font][font=Calibri]GST [/font][font=宋体]蛋白、[/font][font=Calibri]SUMO [/font][font=宋体]标签等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为了便于将重组蛋白的融合标签去除，在设计构建载体时需要在标签蛋白和目的蛋白之间加上蛋白酶识别位点，常用的蛋白酶位点有：[/font][font=Calibri]HRV 3C [/font][font=宋体]蛋白酶切位点、[/font][font=Calibri]TEV [/font][font=宋体]蛋白酶切位点、肠激酶切位点、[/font][font=Calibri]SUMO [/font][font=宋体]蛋白酶切位点等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]：融合标签加在 [/font][font=Calibri]N [/font][font=宋体]端或 [/font][font=Calibri]C [/font][font=宋体]端，有什么区别？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]：蛋白融合标签对于 [/font][font=Calibri]N [/font][font=宋体]端或 [/font][font=Calibri]C [/font][font=宋体]端的选择性对重组蛋白的结构与特性会造成一定的影响。例如，对于较难表达或较容易降解的蛋白，可将融合标签选择在 [/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’ 端，可以提高重组蛋白的稳定性，也可减小对重组蛋白的免疫原性。但是重组蛋白为分泌蛋白，在其分泌到高尔基体的过程中，处于 [/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’ 端的融合标签会随着 [/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’ 端信号肽的切除而切除，从而失去作用。在目的蛋白结构未知的情况下，可以分别于两端构建标记的表达克隆，以确定哪个更有效。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州蛋白标签：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag[/font][/font]

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质纯化出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，表达蛋白纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的)，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(overexpression)，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%.(一)试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit1. T7·Tag抗体琼脂。2. B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。4. 洗脱缓冲液： 0.1M柠檬酸，pH2.2。5. 中和缓冲液：2M Tris,pH10.4.6. PEG 20000.(二)操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr,中间换液数次。8. 用PEG 20000浓缩蛋白。(三)注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。

[font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白纯化原理：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]-S-[/font][font=宋体]转移酶[/font][font=Calibri](GST)[/font][font=宋体]是一个由[/font][font=Calibri]211[/font][font=宋体]个氨基酸组成的大小为[/font][font=Calibri]26kDa[/font][font=宋体]序列，它是另一种广泛使用的可提高靶蛋白的溶解度亲和标签。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签与固定化的谷胱甘肽具有亲和力，常用于原核表达。它可以与一个蛋白的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端或[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端融合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽亲和是一种有效的一步纯化[/font][font=Calibri]GST([/font][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]标签蛋白的方法。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]可作为一种可溶性蛋白在大肠杆菌细胞质中大量表达，并具有完全的酶活性。此外，许多在大肠杆菌中表达时不溶的真核蛋白，在表达为[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白时被证明至少部分可溶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）的应用：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]谷胱甘肽[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）是具有多基因、多功能的[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]相代谢酶家族成员，广泛存在于动物、植物、昆虫、真菌、酵母和各种细菌中。能够催化还原型谷胱甘肽与各种亲电化合物进行亲核加成反应，从而使其极性提高，易于从尿液中排出。因此，[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]家族蛋白是一类在外源化合物生物转化、保护机体免受过氧化作用损害和药物代谢过程中的一类极为重要的多功能蛋白质。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在生物研究领域，来源于日本血吸虫的谷胱甘肽巯基转移酶（[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]）标签，是目前应用最为广泛的融合标签之一。融合标签技术是利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]重组技术将某种标签编码基因融合于目的基因的[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]′端或[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]′端，再通过适宜的宿主来表达融合蛋白。表达的融合蛋白可以通过其融合标签与包被在固相基质上的特异性配基结合，从而纯化出融合蛋白。[/font][font=Calibri]1988[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Smith[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Johnson[/font][font=宋体]首次提出[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的亲和纯化法，此后广泛使用。目前，国内外纯化[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的主要方法是亲和纯化法。[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白亲和纯化，其配基通常是[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]的底物谷胱甘肽（[/font][font=Calibri]GSH[/font][font=宋体]），通过酶与底物的特异性结合来实现[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]蛋白的分离纯化。其原理是：在固相基质上通过巯基结合一个谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶之间的特异性作用力，使得带[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签的融合蛋白与基质上的谷胱甘肽结合，达到分离纯化的目的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]自[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白亲和纯化法问世以来，[/font][font=Calibri]GST-pull down[/font][font=宋体]技术也随即成为一种研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的热门手段。该技术的原理是：利用重组技术将诱饵蛋白与[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签融合表达，融合表达的蛋白经纯化后与待测蛋白共同孵育，并用[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]琼脂糖凝胶或[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]琼脂糖磁珠将其分离下来，再通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]鉴定待测蛋白与诱饵蛋白的相互作用。这种方法简单易行，操作简单。此外，[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签还有助于对目标蛋白的检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression]GST[/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression]标签蛋白纯化[/url]常见问题解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为什么使用[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签来表达和生产蛋白？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在蛋白[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端添加[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签有利于通过[/font][font=Calibri]GSH[/font][font=宋体]亲和树脂对其进行检测、分离和纯化。更重要的是，由于[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]是具有很好的溶解性的高表达的蛋白，将难以表达的蛋白与[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签相融合，有时可以显著提高重组蛋白的表达量和溶解性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纯化后如何裂解[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在某些应用（如蛋白的结晶）中需要去除[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签。为了裂解[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签，需要在标签和蛋白之间设计一个蛋白酶裂解位点。在 [/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签后面的[/font][font=Calibri]EK[/font][font=宋体]裂解位点[/font][font=Calibri](GST-EK[/font][font=宋体]位点[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]蛋白结构[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]可以使[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签和裂解位点完全去除，在[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签的特异裂解后不留下任何额外的氨基酸。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签纯化蛋白的优劣势？[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]适用范围广，可在不同宿主中表达；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]增强外源蛋白可溶性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]可用不同的蛋白酶进行去除；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]有助于保持蛋白的抗原性与生物活性，提高外源蛋白的稳定性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]特异性好，纯化方便且温和。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]仅能纯化可溶性蛋白，若蛋白不可溶，则很难用变性的方法纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：义翘神州[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/gst-tag-protein-expression[/font][/font]

[font=宋体]重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。在蛋白纯化的过程中，我们可能会遇到一些问题。让我们一起来看看这些问题，并探讨相应的解决方案吧！[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]蛋白纯化过程中的七大常见问题详解：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]通过 [/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①若纯化的是上清液，蛋白酶可能会对目的蛋白产生部分降解作用。为改善此情况，可尝试加入多种蛋白酶抑制剂。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②为降低杂蛋白与镍柱的亲和力，可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③若杂蛋白与目的蛋白结合，可在超声处理前加入适量的去垢剂（如[/font][font=Calibri]1%-2% Tritonx-100[/font][font=宋体]），以消除此现象。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]镍柱使用中出现棕色是怎么回事[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当使用镍柱时出现棕色，这主要是由于缓冲液中的[/font] [font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]引起的。[/font][font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响。在碱性缓冲液条件下，镍离子会被 [/font][font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]还原生成棕色的沉淀。因此，所有的镍柱生产商都强调要尽量避免 [/font][font=Calibri]DTT [/font][font=宋体]的参与。一般来说，镍柱的耐受性小于 [/font][font=Calibri]5mM DTT[/font][font=宋体]，推荐缓冲液中不要超过 [/font][font=Calibri]2mM DTT[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]镍柱堵了怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①样品处理：在样品中可能存在细胞碎片或其他杂颗粒，这些杂质可能会导致柱子堵塞。因此，在将样品加载到柱子上之前，必须对样品进行高速离心处理，以确保只加载纯净的样品。[/font][font=宋体][font=宋体]②加入蛋白酶抑制剂：如果在纯化上清液时发现蛋白变性，产生了絮状物，应立即加入[/font][font=Calibri]1-2mM DTT[/font][font=宋体]，以避免变性导致的蛋白质聚集。加入[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]的操作应在冰浴中进行。如果加入[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]后问题仍未解决，可以进一步加入尿素以变性蛋白质，使其在变性环境下稳定。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③调整料液比：样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大或导致蛋白析出或变性。料液比在[/font][font=Calibri]1/10-1/15[/font][font=宋体]之间较为适宜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在纯化过程中，如果蛋白出现浑浊，可能是由于蛋白处于不稳定的环境中或其本身不稳定所导致的。因此，需要检查缓冲体系是否正确以及环境是否低温。此外，为了提高蛋白的稳定性，可以在缓冲液中加入还原剂[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]。另一种解决方案是加入肌氨酸钠，这可以迅速使蛋白变性并消除浑浊现象。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]没能纯化到带 [/font][font=Calibri]His [/font][font=宋体]标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①超声功率问题：[/font][font=宋体]超声功率过大可能导致蛋白炭化，而过小则可能使蛋白没有充分释放。[/font][font=宋体]策略：尝试调整超声功率，并在超声处理前加入适量的溶菌酶。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②样品及结合缓冲液问题：[/font][font=宋体][font=宋体]样品或结合缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值不正确，或缓冲液中的成分（如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]）可能影响蛋白的结合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略：检测样品和结合缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值以及成分，确保它们是正确的和适合的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③组氨酸标签暴露问题：[/font][font=宋体]如果组氨酸标签没有完全暴露，将影响蛋白与镍柱的结合。[/font][font=宋体][font=宋体]策略：在变性条件下（如使用[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]脲，[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]盐酸胍，[/font][font=Calibri]1%SDS[/font][font=宋体]），并加入[/font][font=Calibri]1-2mMDTT[/font][font=宋体]进行纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签丢失问题：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签丢失可能是由于蛋白在纯化过程中发生了降解或脱落。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]：通过[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]anti-his[/font][font=宋体]抗体检查[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签是否存在，检查上游构建是否正确，并尝试改变[/font][font=Calibri]His-tag[/font][font=宋体]的位置（[/font][font=Calibri]C-terminal[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]N-terminal[/font][font=宋体]），必要时增加[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签的数量。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]：孵育时间不足可能导致蛋白未能充分结合。降低流速并增加孵育时间可能有助于提高蛋白的结合效率。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]策略[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]：不同的金属离子可能对蛋白与镍柱的结合产生影响。尝试改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。例如，[/font][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]通常是首选的金属离子用于从宿主细胞蛋白中纯化大多数组氨酸[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]标记的重组蛋白质。但是，有些蛋白可能更适合使用其他金属离子进行纯化而非[/font][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]。可以通过[/font][font=Calibri]Hitrap IMACHP[/font][font=宋体]来筛选不同的金属离子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]蛋白挂在柱子上洗脱不下来[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]怎么解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①洗脱条件太温和：[/font][font=宋体]如果洗脱条件过于温和，可能导致组氨酸标记的蛋白质仍然与柱子结合，因为结合力较强。[/font][font=宋体][font=宋体]策略：尝试增加咪唑的梯度洗脱，或者降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]来找出最佳的洗脱条件。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]方法洗脱的问题：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]如果使用降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]的方法进行洗脱，但[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值过低可能会导致镍离子脱落。[/font][/font][font=宋体]策略：改变洗脱方法，使用咪唑竞争性洗脱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③蛋白已沉淀在柱上的问题：[/font][font=宋体]有时蛋白可能已经沉淀在柱上。[/font][font=宋体][font=宋体]策略：减少上样量和孵育的时间，尝试使用去污剂（如[/font][font=Calibri]1%-2% Tritonx-100[/font][font=宋体]）或改变[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度。还可以在变性条件下进行洗脱（如使用[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]脲或[/font][font=Calibri]6M [/font][font=宋体]盐酸胍），最终也可以在洗脱[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]2mMDTT[/font][font=宋体]或者[/font][font=Calibri]0.5%[/font][font=宋体]肌氨酸钠进行洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④非特异性疏水或其他相互反应的问题：[/font][font=宋体]可能是由于非特异性疏水或其他相互反应导致蛋白挂在柱子上。[/font][font=宋体][font=宋体]策略：在洗脱缓冲液中加入非离子去污剂（如[/font][font=Calibri]2% Triton X-100[/font][font=宋体]）或者增加[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7. [/font][font=宋体]如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）去大肠杆菌自身带（两条 [/font][font=Calibri]30KD-40KD[/font][font=宋体]）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 [/font][font=Calibri]6000r/min,30min,10[/font][font=宋体]℃。（若效果不够可继续上述步骤）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 [/font][font=Calibri]1M/2M/4M/8M [/font][font=宋体]尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]纯化[/b][/url]相关问题的可以查看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font]

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