蛋白质分析装置

园区微晶体结构研究站 园区荧光激发细胞分选仪 海科路园区设施 科研人员研究大分子复合体　　7月28日上午，全球生命科学领域首个综合性大科学装置——蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称“上海设施”)在上海通过国家验收。中国科学院院长白春礼、上海市市长杨雄、国家发改委副主任林念修等出席验收会。　　据介绍，作为国家重大科技基础设施项目之一的上海设施，主要围绕蛋白质科学研究的前沿领域和我国生物医药、农业等产业的发展需求，建设高通量、高精度、规模化的蛋白质制取与纯化、结构分析、功能研究等大型装置，实现技术与设备的集成化、通量化和信息化。目前已建成用于蛋白质结构研究的9大技术系统。　　验收委员会认为，上海设施建成了国际一流的蛋白质科学研究支撑体系，是全球生命科学领域以各种大型科学仪器和先进技术集成为核心的首个综合性大科学装置，其总体指标达到国际先进水平，部分指标达到国际领先水平。　　白春礼表示，建设设施不是最终的目的，吸引全国和全世界的优秀科学家来从事高水平科研工作、产出重大科技成果才是应该致力追求的目标。上海设施要成立设施科技委员会和用户委员会，建立科学民主开放的课题遴选制度，不断扩大设施开放共享。　　据统计，上海设施2014年5月开放试运行，截至2015年7月，各系统累计运行5万多小时，共执行用户课题500多个 服务60多家单位，以中科院和高校科研机构为主，覆盖北京、上海、香港等地 同时吸引了一批国际药企和国内外优秀科学家开展前沿课题研究。用户使用上海设施的设备和服务做出了一系列重要成果，有多项研究成果发表在Nature、PNAS等高水平国际学术刊物上。

蛋白质是细胞功能的执行者，是一切生命的物质基础。然而人们对蛋白质和蛋白质组的了解还远远不够，蛋白质分析被认为是一项复杂而艰巨的任务。2015年是蛋白质领域的关键一年，有可能决定着蛋白质分析的未来走向。　　1.人类蛋白互作图谱取得更大的成果。最近Cell杂志上发表了一项大规模的蛋白质研究，科学家们鉴定了一万四千个蛋白相互作用，获得了迄今为止最大规模的人类蛋白互作图谱。他们计划将在未来六年中逐步完成人类基因组的全部互作图谱。这种图谱可以帮助人们更全面的了解人类互作组，进一步理解疾病的发生和发展。对新发现的蛋白互作进行研究，能够揭示基因型和表型之间的真实关系。我们期待在2015年看到这类研究结出更多硕果。　　2.人造环境为蛋白质分析提供便利。今年八月Roy Bar-Ziv及其同事在Science杂志上发表文章，展示了以微流体DNA隔室为基础的人造细胞。这些二维的人造细胞可以实现预编程的蛋白合成、代谢和通讯，是一种非常灵活的蛋白合成系统。研究显示，人造细胞能够更好的模拟蛋白表达的动态模式，维持蛋白信号的梯度。人们可以利用这一系统来评估蛋白质的活性和相互作用，这种方法将对蛋白质功能研究产生重要的影响。　　3. 一个时代的终结&mdash &mdash 蛋白质结构计划PSI收官。PSI项目在运行了十五年后，正逐步走向自己的终点。PSI项目已经确定了六千三百多个蛋白结构，为蛋白质分析做出了重要的贡献。那些为PSI而建的高通量蛋白生产中心可能会继续维持下去，给其他结构生物学实验室使用。结构生物学家们也可能启动与数据处理有关的中、大型项目，作为PSI的延续。　　不管怎样，对于蛋白质领域来说明年都是特别的一年，研究者们需要决定PSI之后的前进方向。我们希望未来能有更多类似人类互作组图谱的大型项目，增进我们对蛋白质结构和功能的理解。

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T., Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

2015年1月23日一期的Science公布了基于人类蛋白质图谱的大分析结果，包括与癌症相关的详细蛋白质图片，血液中蛋白质种类和数量，以及市场上被批准的所有药物所作用的目标蛋白质。 人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas）,是由Knut and Alice Wallenberg基金会于2014年11月支持的一个大型跨国研究项目。近期他们又开放了一个以人器官组织为基础的蛋白质图谱数据库。基于1300万个注释的图像，整个数据库涵盖了人体中的所有主要组织和器官的蛋白质分布，也标注了仅表达在特定组织，如脑，心脏或肝脏的蛋白。作为一个开放的数据资源，这个数据库提高了对人类生物学的基本见解，更有望帮助推动新的诊断和药物的开发。 在Science的这篇文章里，"基于组织的人类蛋白质组图谱" 结合基因组学，转录组学，蛋白质组学，以及基于抗体的分析，详细分析了大约20,000个蛋白质编码基因。分析结果表明，蛋白编码基因几乎一半都是普遍表达在所有分析的组织。而有大概的15％的蛋白质编码基因大量表达在一个或几个特定的组织或器官，包括众所周知的组织特异性蛋白质，如胰岛素和肌钙蛋白。睾丸是含有最丰富种类蛋白质的器官，其后是大脑和肝脏。分析结果还表明，大约3000种蛋白质是从细胞中分泌释放的，另有5500种蛋白位于细胞膜结构。 这一蛋白质图分析结果为制药行业的提供了重要信息。研究小组的Uhlé n表示,他们发现了市场上使用的药品有70%的作用目标是分泌或膜结合蛋白。有趣的是，另外30%被发现是作用其他组织和器官，这可能有助于解释药物的一些副作用，并且对未来药物开发提供一定的参考价值。 该数据库已经免费对外开放，网址是www.proteinatlas.org.

细胞异质性作为细胞系统中一种普遍存在的现象，受到生物研究领域的日益关注。在传统的群体分析中，单个细胞的独特差异往往被整体的平均值所掩盖，而这些被忽略的细节恰恰构成了细胞分化过程中的关键线索。随着微阵列芯片、核酸测序、质谱等技术的进步，对单一细胞进行基因组、转录组、代谢组和蛋白组分析已不再遥不可及。特别是核酸扩增技术的进步极大地推动了基因组、转录组在单细胞层面的测序技术的应用。尽管取得了这些进步，但在单细胞层面对蛋白质和代谢物的分析仍然面临重大挑战，这主要是由于它们的量有限且缺少有效的扩增手段。本文提出了一种新的策略，通过一次性单细胞蛋白质组和代谢组分析（scPMA），可以在单次LC-MS/MS分析中同时获取单个细胞的蛋白质和代谢物信息。通过这种策略，研究人员能够整合单个细胞的多组学数据，以深入理解细胞内部相互作用的网络和调控细胞状态的复杂机制。scPMA策略共包括以下三个部分（图1）：单细胞捕获及分离、纳升级样品预处理、一次性LC注入和质谱检测。前两个环节都是基于课题组前期自制的机械装置操作完成的，最后一部分才是scPMA策略的亮点。在常规分析流程中，由于蛋白质组和代谢组在物理化学特性上的根本差异，它们通常需要匹配不同的质谱检测技术。因此，在传统的样本预处理阶段，蛋白质和代谢物会被分离，随后各自经历特定的处理流程，并最终分别进行LC-MS/MS检测。然而，这些额外的分离和处理步骤不仅增加了分析的复杂性，而且往往不可避免地会导致样本的损失，特别是在处理单细胞水平的微量样本时，这种损失尤为显著，可能对研究结果的准确性和可靠性造成影响。基于此，作者希望能够开发一种易于使用的方法来实现同一单细胞个体的蛋白质组和代谢组同步分析。图1 一次性单细胞蛋白质组和代谢组同步分析示意图实际上，代谢物和蛋白酶切后的肽段在C18反相色谱柱上的保留时间是存在差异的。如图2所示，在作者设置的45 min梯度下，大部分A549细胞酶切的肽段在9至17 min的范围内就已流出（图2a），而此时流动相中乙腈的最高含量仅为40%。而A549细胞产生的代谢物则主要分布在17 min之后，只有极少部分是在17 min以前流出（＜10）（图2b）。导致这些现象的根本原因是肽段与代谢物之间疏水性的差异，因此，该策略更适合蛋白组与有一定疏水性的代谢物分析。得益于C18的有效分离，可以在色谱梯度的不同时间段针对不同的样本成分（肽段/代谢物）设置不同的质谱检测参数（图2c）。有效的色谱分离加与之匹配的双区域质谱检测便可实现一次性单细胞蛋白质组和代谢组双重分析。与之前的单组学的结果相比，scPMA策略在定量深度上并无明显差异（图2d-f）。图2 单蛋白质组和代谢组分析与scPMA的性能比较 通过scPMA策略，研究者们能够对单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）进行双重组学分析，平均定量了816、578和293个蛋白质以及72、91和148个代谢物。并利用UMAP聚类和随机森林机器学习模型，基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息，实现了对细胞类型的初步分类（图3、4）。根据结果可得知，细胞在代谢组中的异质性要大于蛋白组。图3 scPMA策略分析单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）图4 基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息对细胞进行分类随后，作者还利用scPMA方法在单细胞水平上研究了多柔比星对肿瘤细胞的诱导作用（图5）。对比药物处理组的各个单细胞样本发现给药后不同的单细胞在蛋白质表达上存在着异质性，这也是在群体分析中无法观察到的现象。与未给药的细胞相比，给药组共鉴定出255个差异蛋白(图5b、c)，一些肺癌细胞中过表达的蛋白显著降低。大部分的差异蛋白涉及的通路与DNA、染色质、核小体的合成有关（图5g）。同样，给药组和未给药组中鉴定出的代谢物也被用于UMAP聚类(图5d)和差异分析。差异分析结果(图5e、f)显示，93种代谢物有差异表达。其中，多柔比星仅在给药组检测到。值得注意的是，在给药组的各个细胞中，多柔比星丰度有明显的离散分布，甚至有10倍的丰度差异。这一结果表明不同的细胞个体具有不同的药物吸收水平，从而表现出明显的细胞异质性，这可能为进一步深入探索提供启发。基于差异蛋白质组和代谢组信息，利用MetaboAnalyst 5.0进行联合通路分析，分别富集出62条和234条相关通路。其中有37条显著相关的通路涉及的差异蛋白和代谢物与核糖体、DNA复制等药物作用机制有关（图5i）。图7.氘代差异分析流程示意图这些结果展示了scPMA策略在单细胞分析中的潜力，尤其是在药物干预研究中的应用前景。同时，这项工作也证明了一次性获取单细胞蛋白质组和代谢组信息的可行性，为未来在细胞分化、衰老和肿瘤免疫等领域的研究提供了新的工具。本文2024年发表在Analytical Chemistry上，One-Shot Single-Cell Proteome and Metabolome Analysis Strategy for the Same Single Cell。该文章的通讯作者是来自浙江大学化学系微分析系统研究所的方群教授。

干血斑（Dried Blood Spot, DBS）是一种微量血液采集、干燥和储存的生物采样技术。该技术由Robert Guthrie于1963年首次应用于新生儿苯丙酮尿症（PKU）筛查[1]。相比于临床检验中常用的液态血液基质，干血斑技术具有采血量少、操作简便、一般不需冷冻或冷藏、储存和运输成本低等优点，已应用于新生儿疾病筛查、流行病学样本分析、药物研发等领域。将干血斑应用于蛋白质研究，拓宽了蛋白质分析研究的生物样本采集形式，具有很好的临床研究和实际应用价值。本文重点讨论两种常见干血斑蛋白质分析技术及应用。1. 基于干血斑的蛋白分析技术1.1 酶联免疫吸附分析法原理：酶联免疫吸附分析法（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，进行免疫反应的定性和定量分析，具有灵敏、特异、及易于自动化操作等特点。根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等。实验材料及分析仪器：研究人员可通过购买固相载体、抗体或抗原进行包被制备ELISA试剂盒或购买市售试剂盒。酶联免疫吸附测定试剂盒已成为实验中不可缺少的工具，目前国内外Elisa试剂盒生产厂家很多，如上海酶联生物、Abcam、BioVision等，科研人员可根据研究需求选择高质量的试剂盒品牌，以提升分析效率及结果有效性。干血斑处理：以干血斑HIV分析为例：用HIV阴性混合血液样本对阳性混合血液样本进行梯度稀释后，以固定体积点样至干血斑收集卡，室温下干燥。采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，用300 μL PBST（0.05% Tween20）室温静置洗脱，洗脱液经酶标仪测定样本吸光度值（OD值）。分析和结果处理：以标准曲线样品的浓度为横坐标，以测得的OD值为纵坐标，根据不同类型ELISA本身的特点拟合标准曲线（如竞争法和夹心法可以采用四参数拟合回归方程），选择R值大于0.99的拟合方式，并根据标准曲线计算样品浓度。分析仪器：酶标仪（MicroplateReader）即酶联免疫检测仪，是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶标仪可分为普通酶标仪和多功能酶标仪，普通酶标仪的主要功能一是充当分光光度计的角色，二是基于免疫反应的ELISA分析，价格相对较低；多功能酶标仪可实现吸光度、荧光强度、时间分辨荧光、荧光偏振和化学发光等多种检测模式拓展，满足生化分析、免疫检测、细胞研究、药物筛选和机制探索等众多领域检测需要。目前酶标仪市场常用的仪器品牌进口的有：伯腾、帝肯、美谷分子、珀金埃尔默和赛默飞等；国产的有：安图生物、奥盛和闪谱等。1.2 基于质谱技术的蛋白质分析技术基于质谱（Mass Spectrometry, MS）技术的蛋白质分析方法具有高通量、自动化程度高、分离能力强等特点，已逐渐成为蛋白质分析和鉴定的重要技术。原理：蛋白酶将样本中的蛋白质消化成肽段混合物，可采用鸟枪法（Shotgun）对蛋白组进行全谱分析，在最小限度分离蛋白质的同时实现复杂混合物中成千上万种蛋白质的鉴定和定量；或用液相色谱法（Liquid Chromatography, LC）对酶解肽段进行分离，经基质辅助激光电离（MALDI）或电喷雾电离（ESI）等软电离技术将其离子化，带电蛋白质离子通过质量分析器将具有特定质荷比的肽段离子分离，然后经检测器分析。质谱技术与干血斑技术的结合为蛋白质组学研究和蛋白生物标志物筛选提供了强有力手段。图1 基于质谱技术的蛋白质组学分析流程[2]样本处理：采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，转移至EP管中，加入少量水后用组织研磨器或匀浆机快速、彻底破碎干血斑样片，剧烈摇晃试管。后续处理与常规样本的蛋白提取相似：加入蛋白裂解液（如SDS、SDC、RIPA等），冰上裂解约半小时（辅以震荡），低温、高转速离心后取上清，得干血斑蛋白提取物。分析和结果处理：蛋白质组学数据分析和结果处理包括：①应用数据库搜库对蛋白进行鉴定并相对定量分析，借助如主成分分析、相关性分析、聚类分析等方法掌握数据的整体情况；②对蛋白的生物学功能进行注释，例如GO功能注释、KEGG注释等；③通过蛋白的生物学功能或参与的信号通路可以进一步筛选与研究目标相关的蛋白进行后续的分析。分析仪器：蛋白质组学分析主要使用高分辨液质联用系统进行。可进行蛋白质组学分析的液质联用系统目前以进口为主，常见仪器主要有布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX的Q-TOF、Q-Orbitrap、Q-Trap质谱仪等。2. 干血斑蛋白分析应用实例分享2.1 采用ELISA法分析干血斑中HIV抗体1996年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了以干血斑为载体的样本邮寄传递检测模式，并证明其可作为传统检测模式的良好补充，极大地推动了干血斑技术在传染性疾病分析中的应用。在我国，全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）第二章第4部分“常规HIV抗体或HIV抗体抗原联合检测方法”中指出：ELISA试验可使用血液（包含血清、血浆和干血斑）或尿液样本检测HIV抗体，也可联合检测HIV抗体抗原，说明干血斑在基于ELISA技术的HIV抗体检测中是可代替血浆、血清的生物样本基质，具有广阔的应用前景。近年来，相关专家多推荐受检者使用HIV自主采样包，根据说明采集干血斑样本，匿名寄至专业实验室，通过电话等方式获取结果。图2 RDA Spot公司的干血斑自主采样包（包含一次性采血针，消毒湿巾，样本采集卡，使用说明书及用于运输的特殊包装）图片来源：https://www.rdaspot.com/2.2 基于质谱技术的干血斑蛋白质组学分析研究人员建立了应用Thermo UltiMate 3000 RSLCnano纳升液相色谱联合Q Exactive HF-X质谱技术的干血斑蛋白质组学分析方法，并于2020年在Journal of Proteome Research中报道了该项工作[3]。由于全血中含有较多可溶性蛋白（如血红蛋白、白蛋白、纤维蛋白原等），研究人员为克服干扰、提高分析灵敏度，采用碳酸钠沉淀法（SCP）成功去除干血斑中可溶性蛋白并富集目标分析物疏水性蛋白。采用基于数据非依赖采集模式（DIA）的蛋白质组学分析方法，进行EMBL-EBI（针对人类蛋白GO功能分析的综合注释数据库）蛋白组学搜库分析，通过限定质谱扫描范围和延长离子累积时间等提高了分析方法的检测灵敏度。该研究最终在健康受试者干血斑样本中鉴定到1977种蛋白质，其中包含585种疾病相关蛋白。3. 小结与展望干血斑是一种先进的血液采集及保存技术，具有操作简单、对人体损伤小、便于运输和储存等优势，在临床快检中受到关注。干血斑技术与蛋白质研究的结合将有效推动蛋白质研究成果临床转化。随着分析技术的发展和相关研究的不断深入，前处理自动化仪器、高通量分析仪器和成熟的蛋白分析流程将成为干血斑蛋白质分析的有力工具，干血斑蛋白质分析定将在蛋白质分析中发挥重要作用，为高通量诊断、差异蛋白分析和疾病生物标志物挖掘等拓展新的技术平台。参考文献：[1] R. Guthrie, & Susi, A., A Simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants., Pediatrics, 32 (1963) 338–343.[2] B. Kuster, M. Schirle, P. Mallick, R. Aebersold, Scoring proteomes with proteotypic peptide probes, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6 (2005) 577-583.[3] D. Nakajima, Y. Kawashima, H. Shibata, T. Yasumi, M. Isa, K. Izawa, R. Nishikomori, T. Heike, O. Ohara, Simple and sensitive analysis for dried blood spot proteins by sodium carbonate precipitation for clinical proteomics, Journal of proteome research, 19 (2020) 2821-2827.

贾伟、陈熙沃特世科技（上海）有限公司实验中心氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。参考文献(1) John R. 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6月25日，安捷伦科技公司和Anderson Forschung Group LLC (AFG)表示，将合作开发多肽定量分析方法，旨在加快蛋白质生物标志物的开发和验证速度。　　在合作中，AFG将利用其稳定同位素标准和用抗肽抗体提取(SISCAPA)技术，与安捷伦的1200系列HPLC-芯片和6400系列三重串联四极杆质谱仪(MS)相结合。用这种组合开发测定复杂样品(如，血浆)酶解产物中多种多肽含量的方法。其成果将使双方受益，财务细节尚未披露。AFG首席执行官Leigh Anderson表示：候选生物标志物的SISCAPA分析可以大大受益于安捷伦平台的重现性和灵敏度，我们期待着对这一组合进行优化。　　据了解，Agilent 1200系列HPLC-Chip/MS系统是一个在聚合物芯片上集成了液相色谱柱、连接毛细管和纳流喷雾喷射器的微流控平台，即使样品载入量很小，也可以提供无与伦比的色谱性能。信用卡大小的装置插入安捷伦的HPLC-Chip Cube中，与质谱连接。芯片载入、溶剂和样品输送、液流的高压切换，以及在质谱离子源中芯片的定位，全部实现了自动化。 Agilent 6400系列三重串联四极杆LC/MS系统可以在宽质量范围提供飞克级灵敏度。该仪器以其对复杂基质中痕量有机化合物的可靠定量而享有盛誉，包括，测定药物代谢物、食品中农药残留和地下水中的污染物等。SISCAPA方法是利用抗体包被的磁珠和一个旋转的磁珠捕集装置，捕获目标多肽，然后用纳流LC-MS/MS系统进行测定。目的是对样品酶解液中极少量多肽的量进行测定，创建一种对高级诊断有潜在用途的研究工具。　　安捷伦科技有限公司是分析仪器系统的领导供应商，其产品正在化学、环保、食品、医药和生命科学领域中广泛使用。安捷伦具有世界最先进的化学分析仪器，丰富的法规适应性和专业技术经验，以及优良的支持服务系统，这些都能够帮助您的实验室超前应对分析的挑战。

近日，中科院大连化学物理研究所研究员王方军团队与南方科技大学教授田瑞军、副教授李鹏飞等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。相关研究成果发表在Cell Chemical Biology上。与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。团队通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位和蛋白质组学规模化序列鉴定。相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2022.01.005

从中国科学院大连物理研究所官网了解到，近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员王方军团队在蛋白质复合物形成和干预机制分析新方法研究方面取得进展，通过溶液状态蛋白质赖氨酸两步稳定同位素标记和定量蛋白质组学分析，实现对蛋白—蛋白识别关键位点区域的精确探测，并可评估小分子对蛋白质复合物的构象识别干预情况。蛋白质的结构和相互作用决定了其生物学功能，目前对溶液状态蛋白—蛋白识别和结构动态变化研究仍然缺乏高灵敏度的分析方法。此前，研究团队发现蛋白质上赖氨酸的原位标记反应性与其所处微观结构中的氢键、静电相互作用强度密切相关；提出以蛋白质上所有赖氨酸位点为内源性反应探针，通过定量赖氨酸在蛋白—蛋白，蛋白—小分子结合前后的标记反应性变化，精确探测蛋白质识别过程中的关键区域。为进一步提高赖氨酸反应性定量分析的通量和灵敏度，该团队进一步发展了溶液状态蛋白质“活性—变性”赖氨酸两步稳定同位素标记定量策略（TILLRP），系统研究了重组SARS-CoV-2 S1蛋白质和人体ACE2受体之间的相互作用情况；发现S1蛋白质RBD Lys386-Lys462区域的赖氨酸位点在S1-ACE2复合物形成前后标记反应性发生了显著改变；提出可以利用该区域赖氨酸的标记反应性调控水平评估小分子活性物质对S1-ACE2识别的干预情况，可能有助于相关治疗药物分子的研发。该研究结果发表在《化学科学》（Chemical Science）上。上述研究工作得到国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目的资助。王方军简介：中国科学院大连化学物理研究所分析化学博士，师从邹汉法研究员，博士生导师，主要研究方向为复杂生物样品高效分离表征：激光-质谱高灵敏度分析、生物分子高校标记与功能解析、翻译后修饰蛋白组学分析。担任中国蛋白质组学专业委员会理事、中国分析测试协会青年学术委员会委员。

仪器信息网讯 近日，中国科学院大连物理研究所生物分子高效分离与表征研究组(1810组)张丽华研究员和张玉奎院士团队，蛋白组组学分析最新成果发表于《自然-通讯》(Nature Communications)上。团队发展了N-磷酸化肽段高选择性富集新方法，并结合肽段的高效分离和高灵敏度鉴定，实现了N-磷酸化蛋白质组的深度覆盖分析。　　与研究相对深入的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链氨基上的蛋白质O-磷酸化修饰相比，发生在蛋白质组氨酸、精氨酸和赖氨酸上的N-磷酸化修饰，由于P-N酰胺键具有较高的吉布斯自由能，且易发生水解，目前仍缺乏有效的N-磷酸化蛋白质组分析方法，制约了人们对其生物学功能的认识。　　团队研制了具有核壳结构的亚二微米硅球，并通过在硅球表面键合双二甲基吡啶胺双锌分子，在中性条件下实现了N-磷酸化肽段的高效、高选择性、快速富集 通过基于该材料的on-tip富集方法和液质联用分离鉴定的结合，不仅从HeLa细胞中鉴定到3384个N-磷酸化位点(目前最大的哺乳动物N-磷酸化数据集)，而且还发现N-磷酸化位点附近亮氨酸高度表达 建立的N-磷酸化蛋白质组分析新方法不仅为深入研究其生物学功能提供了基础数据，而且也为推动精准医学、合成生物学等领域的发展提供了技术支撑。　　上述工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、中科院大连化物所创新基金等项目的资助。文章链接：《自然-通讯》(Nature Communications)。

近日，中科院大连化学物理研究所王方军博士、邹汉法研究员等人在高通量多重蛋白质组定量分析方法研究方面取得新进展，发展了一级质谱(MS1)谱图中六种不同蛋白质样品同时规模化定量分析的同位素标记方法，并将该方法应用于细胞蛋白质合成-降解周转更新分析，分析通量是常规同位素标记方法的三倍，研究成果发表在自然出版社新创立的综合性刊物《科学报告》(Scientific Reports, 2013, 3, 1827. doi: 10.1038/srep01827)上。　　基于一级质谱(MS1)的蛋白质组学定量分析由于定量精度高，是现今蛋白质组学定量分析中应用最为广泛的分析技术。由于同位素标记的限制，现有的方法最多可以在一次液相色谱-质谱联用分析中定量三种不同的蛋白质样品，极大限制了蛋白质组学定量分析的通量。王方军博士、邹汉法研究员等人将体内氨基酸同位素标记方法与体外二甲基化同位素标记方法进行有机组合，实现了六种不同蛋白质样品的差异标记并在单次实验中实现了相对定量分析。该六重同位素标记策略还可以应用于细胞中蛋白质的合成及降解速率的高通量分析，成功测定了HeLa细胞中1365个蛋白质的合成-降解周转更新时间。此外，该工作中使用的基于MS1六重蛋白质组学定量及蛋白质周转分析软件系统也由我所自主开发，是国际上首个可以同时定量六个不同蛋白质样品的软件系统。Quant-ArMone 六重蛋白质组学定量及蛋白质周转分析软件示意图HeLa细胞内蛋白质降解动态拟合曲线示例

近日，大连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员团队与南方科技大学田瑞军教授、李鹏飞副教授等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。 与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。　　免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。　　大连化物所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位（Chin. Chem. Lett.，2018）和蛋白质组学规模化序列鉴定（Anal. Chim. Acta.，2021）。　　相关研究结果以“Motif-dependent Immune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”为题，于近日发表于Cell Chemical Biology上。

2014年5月15日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）近日发布了《蛋白质药物液质分析》应用文集。此文集介绍了蛋白质药物，特别是单抗药物的质谱分析方法。文集汇集了Thermo Fisher大分子质谱应用团队精心编写的八篇综述。所涉及的应用主要包括：完整蛋白质分析、ADC分析、肽图分析、修饰分析、突变监测、二硫键的确定与错配的发现、糖基化分析、残留宿主细胞蛋白分析、蛋白质药物代谢分析等。 文集针对相关分析项目，均描述了完整的分析流程(样品处理——液质分析——数据分析)和以Orbitrap为基础的，液质联用技术(LCMS)相关的整体分析方案及应用实例。 图1. 《蛋白质药物液质分析》 图2. Q Exactive Orbitrap LC/MS 系统 此文集作为国内第一本专注于高分辨质谱在蛋白质药物分析领域的综述文集，特别适合于质谱使用经验较少的分析人员。通过阅读这些精致的综述，分析人员可快速地了解各种LCMS技术及相应的分析项目。对于有丰富的蛋白质液质分析经验的人员来说，同样可以通过文中大量精确专业的引用文献了解最新的应用实例、分析软件与质谱发展趋势。 文集亦可同时作为Thermo Fisher即将开展的“生物制药液质分析技术培训班”的先导读物供广大分析人员参考。 获取《蛋白质药物液质分析》应用文集请联系：Jerry.jia@thermofisher.com欲了解相关产品请点击：http://www.thermo.com.cn/Category409.html 关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有员工约50,000人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于Thermo Scientific、Life Technologies、Fisher Scientific和Unity? Lab Services四个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

4月24日，中科院过程工程所苏志国研究员主持完成的“多柱组合层析高通量蛋白质分离设备”重大科研装备研制项目通过中科院计划局组织的专家验收。　　验收专家组成员认真听取设备研制工作报告、经费收支检查报告、设备使用报告、测试报告，并现场考察了研制的4柱和12柱组合层析分离装置。专家组充分讨论后认为：承担单位研制的多柱组合层析高通量蛋白质分离设备拥有自主知识产权，具有创新性和实用性，在蛋白质分离设备的国产化方面取得了突破 研制的4柱和12柱组合层析分离装置运行正常，各项技术指标均达到了任务书规定的要求，部分技术指标优于任务书原定的指标 研制的设备采用多柱组合的创新设计思路，实现了计算机自动控制和高通量、高效率、多模式层析，在同时分离纯化多种蛋白产物和蛋白质的分离纯化效率方面优于当前国际知名品牌的同类仪器。　　自2007年以来，苏志国课题组开始进行多柱组合层析高通量蛋白质分离设备的研制工作，经过两年多的努力，取得了一系列创新性成果，实现了关键部件的自主设计加工，完成了一套通用性强、自动化高、操作简便快捷的蛋白质层析工作站。　　蛋白质的高通量层析分离纯化是蛋白质组学研究和蛋白质产品生产过程中的关键技术之一。本项目的成功，一方面解决了生化工程国家重点实验室分离纯化各种蛋白质药物和天然产物药物的装备所需，另一方面也可以为我国生物技术同行提供有自主知识产权的蛋白质分离纯化装备，满足国家和中科院蛋白质工程研究所需，提供一种高通量大规模制备蛋白质的平台。　　 　　12柱组合层析系统　　 　　4柱组合层析系统

北京蛋白质组研究中心/蛋白质组学国家重点实验室朱云平研究员课题组张纪阳博士等通过建立贝叶斯模型分析“鸟枪法”鉴定蛋白质组数据，大幅提升蛋白质组质谱数据的利用率。相关论文发表在最新一期国际蛋白质组学权威杂志：《分子与细胞蛋白质组学》(Molecular & Cellular Proteomics, MCP)上面，同期杂志还发表了该所姜颖副研究员课题组、钱小红研究员课题组的两篇研究论文，创该刊单期同一单位发文数之最。　　大规模、高通量的蛋白质组研究产生了海量的数据，其中包含了大量的噪声，而高可靠的数据是进一步生物学分析的基础，故目前的分析方法均采用了过严的标准，但在降低假阳性的同时也人为地造成了数据较高的假阴性及较低的利用率。因此，"在保证高可信度的前提下，最大限度地利用实验数据"一直是蛋白质组学界的追求。"鸟枪法"是目前蛋白质组鉴定中地位最重要、应用最广泛的技术策略。他们基于随机数据库策略、非参概率密度模型和贝叶斯公式，建立了串联质谱数据过滤的多元贝叶斯非参模型。通过标准蛋白和复杂样品的严格考核，表明该模型具有良好的灵敏性和普适性，可将质谱数据的利用率提高10~40%，创本领域最好水平。　　原始出处：　　Molecular & Cellular Proteomics 8:547-557, 2009.doi:10.1074/mcp.M700558-MCP200

p　　据仪器信息网编辑最新获悉，牟一萍女士目前已加盟蛋白质分析仪器及相关耗材设计制造商AES (Advanced Electrophoresis Solutions Ltd.)，并担任该公司联席首席执行官(Co-CEO)一职，同时还成为了AES公司董事会成员。/pp style="text-align: center "img style="width: 450px height: 328px " title="QQ截图20160329092644.jpg" border="0" hspace="0" vspace="0" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/insimg/da3c305a-524a-4b46-968f-1226ed553929.jpg" width="450" height="328"//ppspan style="font-size: 16px "　　/spanspan style="font-size: 16px "作为一名成功的职业经理人，牟一萍女士拥有超过20年的生命科学企业领导经验。不久前，她曾在GE医疗集团生命科学事业部担任大中华区总经理一职，在此任职期间大中华区销售额保持了两位数增长的强劲速度，实现了年销售额超过2亿美元。在此之前，她还曾担任安捷伦科技全球副总裁兼生命科学和化学分析事业部大中华区总经理；在她的带领下，安捷伦科技大中华区在不到10年的时间内营业收入从5000万美元攀升至5亿美元，并成为了该公司在全球业务上增长最快的地区；牟一萍女士不仅擅于推动业务的有力增长，还建立了以客户为中心的企业文化，并打造了优秀的售前售后服务团队。/span/ppspan style="font-size: 16px "/span　　对于牟一萍女士的加盟，AES公司创始人兼Co-CEO黄铁民博士表示：“我们非常高兴和幸运牟一萍女士在这个重要时刻加入AES。AES在蛋白质分析仪器系统和全系列CEInfinite产品线的开发及商品化方面投入了巨大精力，接下来我们需要对公司业务的未来发展采取进一步措施，相信牟一萍女士的领导能力和丰富的销售及市场营销技巧将把我们的业务推向新的高度。”/pp　　对此，牟一萍女士则谈到：“我一直在寻求带给客户新的技术。AES是一个充满活力和创新的公司，它已经开发出了蛋白质iCIEF分离和质谱耦合技术，这是生命科学行业一直在寻找的独特解决方案。AES是目前全球唯一能够提供这种专利技术的公司，我非常期待与大家一起合力促进AES技术的广泛应用，我期待由此带来的挑战与机遇。”/ppstrong关于AES/strong/pp　　AES公司位于加拿大安大略省，是一家致力于为客户提供全柱成像检测毛细管电泳系统、试剂和耗材的公司。其最新推出的新一代毛细管电泳仪系统——毛细管电泳等电聚集-全柱成像检测技术（cIEF-WCID），用户借助cIEF-WCID技术，复杂蛋白质的分离和 pI点的测定变得异常轻松。该技术将成为蛋白质药物和抗体药物研发和质量控制、蛋白质组学基础研究和生物相互作用机制探索的强有力工具，同时也是食品安全中功能蛋白检测、育种、奶制品、肉类等最新的技术手段。/pp style="text-align: right "strong编辑：刘玉兰/strong/p

p style="text-indent: 2em "RedShift™ BioAnalytics公司推出了一款新型蛋白质表征平台——AQS3® PRO，这一平台结合了强大的、高度集成的自动化生物分析软件，为生物医疗行业带来了高灵敏度的光谱分析。/pp style="text-indent: 2em "用户通过这一平台可以观察浓度范围在0.1至200 mg/mL的蛋白质二级结构变化，并能进行集成性、可量化、稳定的结构检测和相似性检测，为用药的安全性和有效性提供重要支撑。它能够提供多种属性的测量，减少甚至消除了使用不同工具进行各种单一属性测量的需要。此外，AQS3pro还具有先进的自动化多样本分析功能，大大简化了生物医疗产业的分析工作流程。/pp style="text-indent: 2em "RedShift™ BioAnalytics公司的首席技术官Eugene Ma表示：“ AQS3prois是生物物理表征领域的一项重大进展——将红外光谱应用在生物医疗领域的诊断分析上。这一平台是我们内部一流研发团队与大量行业专家、学术专家倾力合作的结晶。其检测的准确性、重复性和重现性已在数百个样本中得到验证，这些样本包含有数千种尺寸量度的蛋白质。有力的数据支撑和合作伙伴的热情增强了我们对AQS3Pro的信心，我们相信这一成果具有相当大的产业化价值。”/pp style="text-indent: 2em "AQS3Pro新系统使用了RedShift™ BioAnalytics公司的微流控调制光谱学（MMS）专利技术，这一技术将针对微流体的中红外激光光谱分析与先进的信号处理相结合，对蛋白质的二级结构进行测量。它能够在0.01至200mg/mL的浓度范围内对蛋白质直接进行无需标记的测量，在生物医药研发和制造过程经常遇到的各种条件下，无需样品稀释，就可以进行样品表征。其检测是高度自动化的，其多样品检测功能、便捷化操作设置和最先进的生物分析软件进一步提升了检测流程的效率。创新而灵活的分析套件也使得光谱数据的常规分析高度自动化，其先进的检测分析工具能够方便地获得样品的结构性变化，并对这些变化的影响进行深入分析。/pp style="text-indent: 2em "“我与RedShift™ BioAnalytics一直在AQS3PRO的验证性测试中合作。”美国特拉华大学的Christopher Roberts教授说， “这一平台将MMS和红外光谱应用在蛋白质溶液的分析中，让我们能够对多种样本、多种浓度范围蛋白质的二次结构性变化，进行同时的原位量化测量。无论是对从事蛋白质基础性研究的科学家，还是负责生物产品开发的工程师，AQS3PRO都将带来极大的助益。”/p

1965年，中国科学家在世界上首次人工合成牛胰岛素，开启了生命化学研究的新时代。过去数十年历尽科研工作者的不断努力，蛋白质的人工化学合成取得了巨大进步。相较于自然界的生物合成，化学合成可创制具有各种精确控制结构及非天然结构的人造蛋白质，对于发展满足我们需求的蛋白质工具和蛋白质产品带来了新机遇。近期科研工作者们在化学合成蛋白领域又取得了新的成果，并应用了月旭科技的相关色谱柱产品，快来随小编一起饱尝科研的饕餮盛宴吧！化学合成大型镜像聚合酶并实现镜像DNA信息存储WELCH据悉，自然状态下的DNA，会经过精巧的进化来存储遗传信息。而手性倒链L-DNA具有相同的信息能力，但耐生物降解，可作为一个健壮的生物正交信息库。在一项新研究中，清华大学生命学院朱听课题组的研究人员们用化学方法合成了一个90kda的高保真镜像Pfu DNA聚合酶，它能够精确组装一个千碱基大小的镜像基因。该实验中首次使用的大型镜像蛋白质全化学合成策略及千碱基长度镜像基因的组装技术，解决了长期制约镜像生物学领域发展的大型镜像生物分子的制备难题。该研究成果以“利用高保真镜像Pfu DNA聚合酶实现生物正交的镜像DNA信息存储”（Bioorthogonal information storage in L-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase）为题，于2021年7月29日发表在Nature Biotechnology杂志上。研究成果快览研究人员们用聚合酶在L-DNA中编码路易斯巴斯德1860年的一段话，这段话第一次提出了生物学的镜像世界。为突破全化学合成对蛋白质大小的限制，研究团队通过将嵌合的D-DNA/L-DNA关键分子嵌入到D-DNA存储库中，来实现手性隐写。团队将全长为775个氨基酸的Pfu DNA聚合酶分割为长度为467个氨基酸和308个氨基酸的两个片段分别合成，将其混合后共同复性，使其正确折叠为具有完整功能的90 kDa高保真镜像Pfu DNA聚合酶，为目前已报道最大的全化学合成蛋白质；研究者还利用该高保真镜像聚合酶组装出长达1.5 kb的镜像16S核糖体RNA基因，为目前已报道最长的镜像DNA。此外，他们发现保存在自然环境条件下（当地池塘水中）的微量L-DNA条形码，在1年内仍可扩增和测序；而在相同条件下的D-DNA条形码，在1天后就已经无法扩增。背后原因只有一个：它们的手性不同。在研究中，该课题组利用Ultimate XB-C4 （4.6*250mm, 5μm）来监测反应的进行，并检测肽段产品的纯度。同时用制备柱Ultimate XB-C4和C18 （21.2*250mm, 5μm或10*250mm, 5μm）来分离制备粗品肽段和连接产物。全化学合成富含二硫蛋白质WELCH在生物医学研究中，富含二硫的蛋白质是有用的药物或工具分子，但它们的合成由于折叠的困难而变得复杂。有鉴于此，清华大学的刘磊教授、中国科学技术大学的郑基深教授等研究人员，使用可移除的O-连接的β-N-乙酰葡萄糖胺策略，实现了正确折叠的富含二硫键蛋白质的全化学合成，该研究成果以“Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O-Linked β-N-Acetylglucosamine Strategy”为题，发表于2022年1月3日的JACS杂志上。研究成果快览研究人员描述了一种可移除糖基化修饰(RGM)策略，它可以加速具有多个或甚至链间二硫键的正确折叠蛋白质的化学合成。实验过程中，利用Ultimate XB-C4（120Å或300Å，250mm×4.6mm，5μm）监测蛋白的合成反应，并用半制备柱Ultimate XB-C4和C18（300Å，250mm×10mm，5μm）成功制备得到目标蛋白。该策略包括在Ser/Thr位点引入简单的O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)基团，通过稳定其折叠中间体，有效地促进了富含二硫的蛋白质的折叠。折叠后，O-GlcNAc基团可以用β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(OGA)被有效地去除，从而获得正确折叠的蛋白质。使用这种策略，该研究组完成了正确折叠的铁调素的合成，这是一种含有四组二硫键的铁调节激素。研究人员首次实现了正确折叠的白细胞介素5(IL-5)的全合成，这是一种26kDa的同型二聚体细胞因子，负责嗜酸性粒细胞的生长和分化。“工欲善其事，必先利其器”，月旭科技专门针对多肽、蛋白类等生物样品方法开发，推出Welch生物样品分析方法开发包，助力前沿的科学研究和日常生产分析制备工作。● 适合蛋白、多肽或其他大分子的方法开发。为了能更好地与键合相发生作用，需使用大孔径（300Å或450Å）的填料。● 不同保留能力的不同选择性键合相，满足各种分子大小的蛋白质、多肽的保留和分离。参考文献1. Ting F. Zhu, et al. Bioorthogonal information storage in l-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase. Nature Biotechnology,2021. Nature Biotechnology | VOL 39 | December 2021 | 1548–1555.2. Lei Liu, et al. Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O-Linked β-N-Acetylglucosamine Strategy. J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 349−357.

近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员叶明亮、研究员秦洪强团队开发了表征蛋白质中组氨酸残基反应活性的蛋白质组学分析新方法。该工作筛选并获得了具有组氨酸优异反应效率的α, β-不饱和醛探针，发展了基于烯醛探针的组氨酸标记技术和可逆酰肼化学富集方法，通过蛋白质组定量技术实现了人类蛋白质组中的组氨酸反应活性的高效表征。相关成果发表在《美国化学会志》上。　　氨基酸亲核反应活性的表征推动了共价药物靶点和候选药物分子的发现。组氨酸占据超过1/5人源酶活性中心，在生理环境中既是质子的供体又是质子的受体，受到蛋白质空间微环境的精细调控。然而，由于缺乏可以在生理条件下标记组氨酸的化学探针，在此之前难以实现组氨酸活性的全局性表征。　　本工作发现α, β-不饱和醛在生理状态下可与组氨酸残基发生迈克尔加成反应，且引入的醛基可作为富集标签用于后续的可逆酰肼富集。与基于点击化学的经典活性蛋白质组分析方法（ABPP）相比，该策略引入活性最高的烯醛探针——丙烯醛作为反应基团和富集标签，是目前报道的最小尺寸的ABPP多功能探针。　　同时，该方法样品处理流程简便，引入标签质量小，并通过可逆富集过程引入稳定同位素标记试剂，有效避免了传统工作中制备同位素连接臂的繁琐流程和高成本。该方法共定量了超过8200个组氨酸残基的标记效率，筛选到317个高亲核反应性组氨酸残基，并且发现组氨酸的反应活性和其磷酸化呈负相关。　　该方法为后续基于组氨酸的共价靶向偶联药物的开发提供了数据支持，且丙烯醛衍生物也可作为新型反应基团用于共价抑制剂的研制。

在国家自然科学基金的大力支持下(项目资助号：21021004)，中国科学院大连化学物理研究所邹汉法研究员在磷酸化蛋白质组分析技术方面获得新进展，相关成果发表在最近一期的Nature Protocols上(2013，8，461-480)。(http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/abs/ nprot.2013.010.html)。　　固定化金属离子亲和色谱(IMAC) 是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化肽段富集技术之一，常规的IMAC使用的螯合基团有三羧甲基乙二胺、次氨基乙酸、亚氨基二乙酸等，在螯合铁、镓等金属离子后可用于磷酸肽的富集。其缺点是特异性不高，在富集磷酸肽的同时也富集了一些酸性肽。研究人员发现了磷酸酯锆或钛表面与磷酸肽之间的高特异性相互作用，并利用这一相互作用建立了以磷酸基团为螯合配体的新一代固定化金属离子亲和色谱技术。实验表明，该新型IMAC对磷酸肽富集的特异性优异，可以有效避免酸性肽段的非特异性吸附。与传统的IMAC相比较，其对磷酸肽的富集能力提高3-10倍，从而大大提高了蛋白质磷酸化分析的检测灵敏度和鉴定覆盖率。该新型IMAC方法自2006年发表首篇论文以来，已在Mol. Cell. Proteomics, J. Proteome Res., Anal. Chem.等蛋白质组学与分析化学权威期刊发表论文20余篇，其中2007年发表在Mol. Cell. Proteomics的一篇论文已经被引用110余次。采用该方法为核心技术进行了人类肝脏蛋白质磷酸化的规模化分离鉴定，建立了迄今为止国际上人类肝脏蛋白质磷酸化的最大数据集 (Mol. Cell. Proteomics，2012，11，1070-1083)。

Synapt™ HDMS™ 质谱分析系统产品发布会在穗盛大召开 2007年8月19 日，上海 - 沃特世公司(NYSE: WAT)在广州珠江帝景酒店召开新产品发布会，正式向中国用户介绍其于今年年初荣获Pittcon最佳新产品金奖的Synapt™ HDMS™ 质谱分析系统（Waters Synapt High Definition MS™ (HDMS) System）。这是第一台基于高效离子淌度测量和分离技术的高性能四极杆-飞行时间质谱仪。此次发布正值第五届中国蛋白质组学大会在穗举行，因此首次亮相的Synapt HDMS吸引了超过110位来自全国各地的蛋白质组学领域的专家和学者。 晚上19点30分，发布会以为产品亮灯作为序幕：四位客席嘉宾应邀上台，与沃特世中国区市场经理陈红女士共同主持这一仪式。在聚光灯的投射之下，白色巨型的Synapt HDMS仿真模型立刻成为全场的亮点。随后，沃特世中国市场总监舒放、亚太总部市场开发经理Mark Ritchie和应用培训经理吴麟堂，以及中国区质谱维修经理葛玉春等几位高层悉数到场进行精彩演讲，并演示了这一新产品所应用的先进技术。 “这是一套很好的产品。众所周知，蛋白质的结构决定其功能。但是，使用普通的质谱仪是不能观察到异构体的，这或多或少会影响检测结果的准确性。” 东北林业大学生命科学学院的李玉花院长说, “而Synapt HDMS的面世可以很好填补这一技术空白，大大丰富了常规质谱力所不能及的独特信息。” 深圳市南山区疾病控制中心柳洁主任也认为，“Synapt HDMS会在很大程度上有利于对离子空间比较结构的分析，在小分子研究、蛋白质解析、代谢物鉴定和生物制药等领域是一个极大突破。因此，这个产品无论是在全球还是中国的相应领域都有着极大的研究应用潜力”。 Synapt HDMS产品发布会在一片愉悦的氛围中圆满结束。沃特世中国市场总监舒放充满信心地表示，Synapt HDMS进入中国市场的策略是坚决的，也是务实的。“这种激动人心的分析手段，将会利用自身的技术优势，帮助相关领域内的研究人员轻松从事所有UPLC/MS/MS的应用分析。” 关于Synapt HDMS质谱 伴随2006年美国质谱年会上推出Synapt HDMS 质谱系统, 沃特世公司成为第一个将高效离子淌度测量与分离技术结合并商业化的公司，同时设计专业操作软件分析样品离子的大小，形状，电荷数及质量。 作为对该质谱系统创新科技的认可，Synapt HDMS 质谱系统在2007年匹茨堡分析仪器展览会上被评为最佳新产品金奖。 另外，行业通讯杂志—《仪器商业展望》也将Synapt HDMS 质谱系统评为2007年匹茨堡大会新产品最高奖。 欲知更多有关Waters Synapt HDMS质谱分析系统的信息，请访问www.waters.com/HDMS。 关于沃特世公司 沃特世公司（股票代码NYSE:WAT） 在全球范围内，通过传递实用，可持续发展的创新技术在人体保健，环境管理，食品安全和水质分析领域建立了商业优势。 拥有整合的分离科学，实验室信息管理，质谱和热分析技术，沃特世公司的技术突破和实验室解决方案为用户的成功提供了保证平台。 沃特世公司2006年收入为12.8 亿美元，在全球拥有4,700 名员工。沃特世公司致力于与全球用户一同推动科学发现并保障产品的卓越性能。 Waters, Synapt, High Definition MS和HDMS是沃特世公司拥有的商标。 媒体查询，请联络： 沃特世科技（上海）有限公司 谢迎锋 小姐 电话：+86 21 54263597 传真：+86 21 64951999 Email：xie_ying_feng@waters.com 网址：www.waters.com www.waterschina.com

p　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。/pp style="text-align: center "img width="400" height="284" title="1.jpg" style="width: 400px height: 284px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。/pp　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。/pp　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。”/p

—抗体药、蛋白质药、N-末端甲硫氨酸缺失或焦谷氨酸环化封闭等—? 目前，在制药领域，生物药得到越来越多的关注。生物药是利用DNA重组、细胞融合、细胞培养等生物技术开发出的蛋白质药物、抗体药物等。几乎所有蛋白质合成都起始于N-末端，其序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着重要的影响力，因此蛋白质的序列分析对于生物药效果非常关键。 2015版《中国药典》三部人用重组DNA技术产品总论对生物药的生产及质量控制方面，，针对其蛋白质结构提出技术要求，应测定目标产品的氨基酸序列，并与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较。因此，N-末端氨基酸序列分析是很多已上市生物药的年检项目，如重组人促红素注射液（CHO细胞） 、重组人粒细胞刺激因子注射液等。此外，国际法规中也有对于生物药N-末端氨基酸序列测定的要求。药品注册的国际协调组织颁布的指导法规ICH-Q6B规定，生物药进行申报时，必须提供N-末端氨基酸序列信息。《欧洲药典》中规定，生物仿制药申报也必须提供N-末端序列。 Edman降解法是蛋白质N-末端测序的常用方法，岛津公司的蛋白质测序仪（Protein Sequencer）PPSQ以Edman降解法为基础，将蛋白质从N-末端顺次切断进行序列分析。此方法具有直接测定、可靠性高的优势。近期，岛津推出新型的蛋白质测序仪PPSQ 51A/53，配备SPD-M30A高灵敏度检测器、软件满足FDA 21 CFR Part 11数据完整性的要求。PPSQ 51A/53梯度系统更是在等度系统基础上，提高检测灵敏度，适合微量样品的氨基酸序列分析。我们应用岛津PPSQ 51A/53A开发了单克隆抗体药、重组蛋白药的N-末端氨基酸序列分析方法，另外，也开发了具有特殊结构的生物药N-末端氨基酸序列分析方法，如甲硫氨酸缺失、焦谷氨酸环化封闭等样品，编写了《蛋白质测序仪PPSQ在生物药N-末端氨基酸序列分析的应用》文集：包括经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离轻链和重链，从而测定N-末端氨基酸序列的单克隆抗体药贝伐单抗和曲妥珠单抗等；含有特殊结构的如N-末端部分甲硫氨酸缺失的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子注射液原液、N-末端焦谷氨酸环化封闭类单克隆抗体帕尼单抗、含有二硫键的溶菌酶和催产素；用自制的脱盐装置分析具有高浓度盐的蛋白质药物重组人促红素原液（CHO细胞）和重组人粒细胞刺激因子注射液。关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。

沃特世公司（WAT:NYSE）最新推出了Protein-Pak™ Hi Res离子交换（IEX）色谱柱，用于在沃特世 ACQUITY UPLC 系统上分析生物分子，包括单株抗体、重组蛋白质、DNA/RNA和疫苗。生物治疗药物厂商使用该色谱柱分析完整生物分子的各种带点状态，可以获得更高的分辨率，更快的分析速度，以及更好的重现性。，因此，提高了监测能力，有助于厂商高品质和高效率的生产。 　　沃特世Protein-Pak Hi Res IEX系列色谱柱的开发，是为了使用UPLC技术定性分析目前在众多新型生物制药疗法中发现的重组蛋白质和单株抗体的。这些无孔的、高健合密度颗粒技术与传统的多孔IEX颗粒技术在大分子分离方面比较，具有较高峰值容量和较高的分辨率。另外，新的颗粒技术及表面化学特性也提高了色谱柱的载样能力和分辨率，同时最大限度减小了色谱柱污染。　　在聚合物颗粒的表面健合的离子交换的健合相包括强阴离子交换(季胺盐，Q)和弱强阳离子交换物质(羧甲基(CM)和磺丙基(S))。它们在pH值3-10这个范围内可以耐受高盐浓度和高压。离子交换色谱法被证实是重要的用于评估生物分子带电状态的技术。生物分子生产的重现性是个难点问题。是重现，蛋白质带电量的变化是脱酰胺或糖基化作用的良好标志，进而会影响产品稳定性和功效，因此需要密切监测。更多详情，请访问网站 www.waters.com/proteins。　　将UPLC技术的能力扩展至生物分子　　2004年，沃特世公司推出了ACQUITY UPLC系统，彻底改变了LC分离技术，相比传统HPLC技术，UPLC技术大大的提高了样品通量。沃特世公司最新的Protein-Pak Hi Res IEX色谱柱与ACQUITY UPLC系统的完美结合，可以在保持关键组分的分辨率下，获得最高的灵敏度。另外，每根色谱柱都采用沃特世ACQUITY UPLC eCord™ 技术，有助于监测单根色谱柱在整个色谱柱生命周期内的使用参数 – 信息永远伴随着色谱柱。　　总之，这些互相结合的技术极大地增强了单株抗体、重组蛋白质、DNA或RNA以及疫苗成分的定性分析能力。　　关于沃特世公司(www.waters.com)　　50年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用且可持续的创新，实现了全球医疗保健、环境管控、食品安全、水质监测等领域的显著进步，为基于实验室的许多机构创造了商业价值。　　沃特世的技术突破和实验室解决方案开创了分离科学、实验室信息管理、质谱技术和热分析的相互组合，为客户提供了一个持久成功的平台。　　沃特世公司2009年的总收入达15亿美元拥有5,200名员工 公司正在帮助全球客户推进科研进程，并为其提供绝佳的操作体验。

几种不同折叠模式的蛋白质模型(图片来源Protein Data Bank Japan )　　上个世纪初，科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质，而具有独特的作用。随着这个理论被证伪，真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而，蛋白质作为生命体的重要大分子，其重要性也从未被忽视，而且在1950年代开始，科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时，蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性，因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用。　　本文简要回顾了蛋白质结构解析的重大历史事件，并总结了蛋白质结构解析的常用方法和结构分析方向。通过了解蛋白质结构，能够让我们更好地理解生物体的蛋白的理化特性，以及其相关联的化学反应途径及其机制，对于我们认识生物世界和研发治疗方法和药物都起着关键作用。在即将召开的2015高分辨率成像与生物医学应用研讨会上，各位专家学者将会进一步讨论相关议题。　　蛋白质结构解析六十年来大事件　　在1958年，英国科学家John Kendrew和Max Perutz首先发表了用X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构，然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin。因此，这两个科学家分享了1962年的诺贝尔化学奖。事实上，这项工作在早在1937年就开始了。　　然后在1960年代，蛋白质结构解析方法不断进步，获得了更高的解析精度。这个时期，蛋白质序列和DNA序列间关系也被发现，中心法则被Francis Crick提出，然后科学界见证了分子生物学的崛起。分子生物学(Molecular Biology)的名称在1962年开始被广泛接受和使用，并逐渐演变出一些支派，如结构生物学。然后在1964年，Aaron Klug提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构。因为这项研究，他获得了1982诺贝尔化学奖。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。　　进入1970年代，很多新的方法开始发展。存储蛋白质三维结构的Protein Data Bank(1971年) 开始出现，这对于规范化和积累蛋白质数据有着重要意义。1975年新的一种仪器叫做多丝区域检测器，让X-ray的检测和数据收集更加快速高效。次年，Robert Langride将X-ray衍射数据可视化，并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室。同年，KeithHodgson和同事首次证明了可以使用同步加速器获得的X射线并对单个晶体进行照射，并取得了很好的实验效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白质结构的解析 同年首个高精度病毒(西红柿丛矮病毒)衣壳蛋白结构被解析。　　在1980年代，更多蛋白质结构被解析，蛋白质三维结构的描述越来越成熟，而且蛋白质结构解析也被公认成为药物研发的关键步骤。在1983年，冷冻蚀刻的烟草花叶病毒结构在电子显微镜结构下得到描述。两年后德国科学家John Deisenhofer等解析出了细菌光合反应中心，因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。次年，两个课题组解析了HIV与复制相关的蛋白酶结构，对针对HIV的药物研发提供了理论基础。　　下一个十年，因为大量同步加速器辅助的X射线衍射的使用，数千个蛋白质结构得到解析，迎来了蛋白质结构组的曙光。1990年多波长反常散射方法(MAD)方法用于X射线衍射晶体成像，与同步辐射加速器一起，成为了近二十多年来的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年发表了第一个高精度的钾离子通道蛋白结构，对加深神经科学的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的诺贝尔化学奖。Ada Yonath等领导的课题组在1999年首次解析了核糖体结构(一种巨大的RNA蛋白质复合体)。　　进入新千年，更多的技术细节被加入到蛋白质解析研究领域。2001年，Roger Kornberg和同事们描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构，正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。2007年，首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来，越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟，并开始广泛用于蛋白质结构的解析。　　蛋白质结构解析的常用实验方法　　1.X-ray衍射晶体学成像　　X射线衍射晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。X射线是一种高能短波长的电磁波(本质上属于光子束)，被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此析获得粒子的位置信息。利用这种特点，布拉格父子研制出了X射线分光计并测定了一些盐晶体的结构和金刚石结构。首个DNA结构的解析便是利用X射线衍射晶体学获得的。　　后来，获得X射线来源的技术得到了改进，如今更多地使用同步辐射的X射线源。来自同步辐射的X射线源可以调节射线的波长和很高的亮度，结合多波长反常散射技术，可以获得更高精度的晶体结构数据，也成为了当今主流的X射线晶体成像学方法。由X射线衍射晶体学解析的结构在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。　　X射线衍射成像虽然得到了长足的发展，仍然有着一定的缺点。X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且，X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。　　上海同步辐射加速器外景(图片来源 上海同步辐射光源网站)　　2.NMR核磁共振成像　　核磁共振成像NMR全称Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年诺贝尔奖)描述，在上世纪的后半叶得到了长足发展。其基本理论是，带有孤对电子的原子核(自选量子数为1)在外界磁场影响下，会导致原子核的能级发生塞曼分裂，吸收并释放电磁辐射，即产生共振频谱。这种共振电磁辐射的频率与所处磁场强度成一定比例。利用这种特性，通过分析特定原子释放的电磁辐射结合外加磁场分别，可以用于生物大分子的成像或者其他领域的成像。有些时候，NMR也可以结合其他的实验方法，比如液相色谱或者质谱等。　　RCSB Protein Data Bank数据库中存在大约11000个用NMR解析的生物大分子结构，占到总数大约10%的结构。NMR结构解析多是在溶液状态下的蛋白质结构，一般认为比起晶体结构能够描述生物大分子在细胞内真实结构。而且，NMR结构解析能够获得氢原子的结构位置。然而，NMR也并非万能，有时候也会因为蛋白质在溶液中结构不稳定能难得获取稳定的信号，因此，往往借助计算机建模或者其他方法完善结构解析流程。　　使用NMR解析的血红蛋白结构建模(图片来源RCSB PDB)　　3.Cryo-EM超低温电子显微镜成像　　电子显微镜最早出现在1931年，从设计之初就是为了试图获得高分辨率的病毒图像。通过电子束打击样本获得电子的反射而获取样本的图像。而图像的分辨率与电子束的速度和入射角度相关。通过加速的电子束照射特殊处理过的样品表明，电子束反射，并被探测器接收，并成像从而获得图像信息。具体做法是，将样品迅速至于超低温(液氮环境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于样品池，在电子显微镜下成像。图像获得后，通过分析图像中数量众多的同一种蛋白质在不同角度的形状，进行多次的计算机建模从而可以获得近原子级别的精度(最低可以到2.0埃)。　　Cyro-EM解析TRPV1离子通道蛋白(图片来源Structure of the TRPV1 ion channel )　　将电子显微镜和计算机建模成像结合在一起的大量实践还是在新世纪之后开始流行的。随着捕捉电子的探测器技术(CCD技术，以及后来的高精度电子捕捉、电子计数electron counting设备)的提升，更多的信息和更低的噪音保证了高分辨率的图像。　　近些年来，Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体)，取得了非常好的结果。同时，单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备，减少了图像中的噪音和信号衰减，同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步，也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而，Cyro-EM与X-ray不同，该方法不需要蛋白质成为晶体，相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。　　除去介绍的这三种方法以外，计算机建模技术也越来越多地被用在了蛋白质结构解析中。而且新解析的结构也会提高计算机建模的精确度。未来，我们或许能够用计算机构建原子级别的细胞模型，构建在芯片上的细胞。　　蛋白质结构对了解生命体的生化反应、有针对性的药物研发有着重要意义。从1958到如今已经接近60年，蛋白质结构解析得到了较快的发展。然而，在如今DNA测序如此高效廉价的时代，蛋白质和DNA结构解析并没有进入真正高速发展阶段，这也导致了在如此多的DNA序列数据非常的今天，结构数据却相对少的可怜。大数据时代的基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等飞速发展的时候，蛋白质结构组也得到了更加广泛的重视。发展高精度、高效的结构解析技术也一直都有着重要意义。未来，蛋白质结构解析，对针对蛋白质的药物筛选，和计算机辅助的药物研究研究不应被低估。未来说不定在蛋白质结构领域有着更多惊喜，让我们拭目以待。 第一届电镜网络会议部分视频回放

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nature communications上的文章，FLASHIda enables intelligent data acquisition for top–down proteomics to boost proteoform identification counts [1]，文章的通讯作者是德国图宾根大学的Oliver Kohlbacher教授。自上而下蛋白质组学(TDP)能够对完整的proteoform进行全面和深入的分析，目前已广泛应用于生物医学研究领域。proteoform在不同的生物系统中具有高度异质性，proteoform水平的信息可以为了解生物生化功能或疾病表型提供重要的信息。近年来，随着TDP样品处理方法、分离技术、碎裂技术和生物信息学方法的进步，proteoform变得更容易被检测和表征。在复杂样本的大规模研究，如微生物或人类细胞裂解液中，proteoform的鉴定数量已达到4000-6000(对应500-1000个蛋白质)。在单次TDP实验中，在大肠杆菌裂解液中可以鉴定出约800种proteoform，在人脑样本中可以鉴定出约1800种proteoform。由于proteoform的多样性和复杂性，完整蛋白质的DDA采集是非常重要的。然而目前的仪器软件在DDA采集中实施的碎裂技术优化主要针对自下而上蛋白质组学(BUP)，而不是TDP。尽管这些方案在BUP研究中有效地捕获了各种高质量的肽段离子，但这些选择标准对于TDP中的proteoform离子选择并不是最优的。与BUP中的肽段离子相比，单个proteoform由于其高质量和高电荷会产生许多峰，Top-N采集往往会导致从一个丰度较高的proteoform中选择多个峰，而不是从多个不同的proteoform中进行选择，这会导致proteoform的覆盖率较低。此外，基于强度进行选择可能不会选到能产生多种独特片段的高质量前体。目前，大多数大规模TDP研究使用具有特定调优参数的DDA采集，例如，Top-N采用相对较低的N值(3-5)和相对较高的隔离窗口(1.2-15 Th，超宽隔离)。然而对所选前体离子的分析表明，对proteoform的选择依然不理想。因此，采用更智能的数据采集方式(Intelligent data acquisition，IDAs)是非常有必要的。本文中作者提出了一种用于TDP的基于机器学习的智能在线数据采集算法FLASHIda，该算法可以确保实时选择不同proteoform的高质量前体，最大化TDP中的proteoform覆盖。FLASHIda通过iAPI与tribrid Thermo Scientific质谱仪连接，允许对MS数据进行实时访问。在LC-MS运行期间，将实时去卷积算法和评估前体同位素质量的机器学习技术结合，非冗余选择高质量前体离子,从而提高蛋白质的覆盖率。FLASHIda流程如图1所示，该算法能在20毫秒内处理每个MS全扫描，并优化下一个采集周期，以最大限度地提高采集中的异型多样性。FLASHIda包括以下3个关键步骤，第一步是将输入的m/z-强度谱转换为mass-quality谱图，第二步是在转换谱图中选择前体离子，最大化唯一识别的proteoform离子数量，最后，动态确定每个选定质量的电荷态和隔离窗口大小，以尽量减少噪声或共洗脱的干扰。确定的隔离窗口m/z范围通过Thermo iAPI连接提供给仪器。　　图1.FLASHIda总览　　在对大肠杆菌裂解液的分析中，与标准DDA模式相比，FLASHIda在三分之一的仪器时间内将proteoform鉴定数量从800增加到1500，或产生几乎相同的鉴定数量。此外，FLASHIda能够灵敏地绘制翻译后修饰和检测化学加合物。作为仪器的软件扩展模块，FLASHIda可以方便地用于复杂样品的TDP研究，以提高proteoform的鉴定率。　　图2. Proteoform分析　　这项研究展示了IDA在TDP研究中的应用，目前作者依然在开发该算法的不同变体，用于靶向proteoform分析，深度表征，甚至从头测序。此外，由于FLASHIda能够选择无干扰的前体离子，因此它可以用于提高proteoform定量准确性。作者预计，未来在FLASHIda内开发的高级数据采集方法将有助于通过TDP探索proteoform的异质性。　　撰稿：张颖编辑：李惠琳　　原文：FLASHIda enables intelligent data acquisition for top–down proteomics to boost proteoform identification counts　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin 　　参考文献　　Jeong K, Babović M, Gorshkov V, Kim J, Jensen ON, Kohlbacher O. FLASHIda enables intelligent data acquisition for top-down proteomics to boost proteoform identification counts. Nat Commun. 2022 Jul 29 13(1):4407.

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "近日，浙江大学方群团队联合北京大学黄超兰团队在单细胞蛋白质组学分析研究领域取得了突破性进展。/span此项成果近日以全文形式在线发表于美国化学会的Analytical Chemistry杂志上(影响因子 6.32)，论文题目为“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/0d88aade-7372-4d68-b5da-4d57efa64b73.jpg" title="001.jpg" width="650" height="478" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 650px height: 478px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图：纳升级油-气-液滴(OAD)芯片和自动定位(SAM)装置的结构示意图(a)和用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和上样的全流程图(b)。/strong/span/pp　　蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。span style="color: rgb(0, 112, 192) "鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "单细胞内蛋白质含量极少，就典型体细胞而言仅为0.1- 0.2 ng，远远小于常规蛋白质组学样品前处理所需要的微克级蛋白量。/span并且细胞内的蛋白质通常需要在离心管内完成复杂多步的前处理操作，包括细胞裂解和蛋白质释放、蛋白质沉淀纯化、蛋白质还原和烷基化、酶切等，一个全细胞裂解蛋白质组的最后反应体积均是几十甚至过百微升，在这个蛋白质组学常规前处理的过程中，由于样品与离心管的接触、多步的样品转移和不完全上样等原因，在进入质谱之前不可避免地带来了蛋白质的损失。用此流程来处理单细胞，即使之后结合液相色谱仪器的自动进样阀可以以小于十微升的体积完成上样也无济于事，因为尚未等到分离蛋白质样品就有可能已经损失大半了。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/ce546442-97dc-4a87-a243-558d62afe43e.jpg" title="003.png"//pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "如果说单细胞蛋白质组学是在米粒上雕刻，那么两个团队就是造出了适合在米粒上雕刻的工具刀。/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "该项研究起自2014年，两个团队的研究人员协同合作将微流控液滴技术与蛋白质组分析技术相结合，发展了一种微型化的油-气-液“三明治”芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成少量细胞蛋白质组学分析所必需的多步样品前处理操作，并且实现了将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的液相色谱分离与质谱检测。/span通过采用优化后的芯片材料、裂解试剂、酶切比例和色谱质谱参数等实验条件，该芯片系统可以分别成功地从100、50、10和1个HeLa细胞内鉴定到1360、612、192和51个蛋白质。更重要的是，研究人员首次实现了以单个鼠卵母细胞为初始样本的蛋白质组学分析，一共鉴定到355种蛋白质，其中存在一系列与生殖发育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相关(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在该工作中，还采用两种常规的基于离心管的前处理方法进行了对照实验，实验结果明确证实了微流控液滴体系具有更低的样品吸附损失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白质鉴定能力等明显优势，更适用于微量蛋白质样品的蛋白质组学分析。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "此项研究带来三个突破/span：首先是成功发展了适合进行单细胞及类似微量样品的蛋白质组学分析样品前处理芯片和方法。芯片内550 纳升的液滴与芯片的接触面积仅为常规离心管模式下的十五分之一，显著减少了样品与反应器接触所带来的损失；二是发展了一种实现纳升级液滴的直接进样方法，利用3D打印加工的自动定位装置和高压气泵高效地( 99%)将液滴样品注入到分析色谱柱内，完全避免了样品转移和经过液相仪器内复杂管路带来的损失；第三是为避免在常规微流控液滴系统中由于油相直接接触液滴而造成的缺陷，提出了一种采用气相来间隔液滴相和油相的新型液滴芯片结构，在成功防止液滴明显蒸发的同时，还避免了油相和液滴相直接接触带来的脂溶性样品的损失，也使系统能更方便地进行后续的分离柱进样、色谱分离和质谱检测。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "该项研究在基于质谱的单细胞及微量样品的蛋白质组学分析方面开启了全新的技术，其所具有的系统结构简单、容易搭建、操作方便、可靠性高等特点，使其有望被广泛应用到细胞间异质性的研究以及与临床相关的研究，包括稀有的循环肿瘤细胞分析、生殖细胞相关研究和疾病诊疗等方面，因此在未来具有巨大的持续开发和应用转化前景。/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/91e71d83-0fde-4b69-8b5f-10de6af33876.jpg" title="未命名_meitu_0.jpg" width="400" height="400" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 400px height: 400px "//span/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "（左上：浙江大学/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "教授/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "方群、/span/strongstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "右上：/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "北京大学/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "教授/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "黄超兰、/span/strongstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "左下：/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "浙江大学博士生李紫艺、/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "右下：前国家蛋白质科学中心· 上海高级工程师/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "黄敏/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "）/span/strong/pp　　该论文的第一作者为浙江大学博士生李紫艺，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授。工作得到了国家自然科学基金和中国科学院杰出技术人才项目的支持。黄超兰教授的部分工作在前单位中科院国家蛋白质科学中心· 上海完成，特此鸣谢!/pp style="line-height: 16px "img src="/admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif"/a href="http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/b0d2802c-066e-4fdf-86c9-b683f1c317de.pdf" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis.pdf/span/a/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "文章链接：/spana href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" _src="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661/span/a/p