显微镜原理

Park纳米科学原子力显微镜系列讲座培训一原子力显微镜在纳米研究中的应用：AFM的成像原理2021年5月25日(周二)北京时间下午3:30-4:30原子力显微镜(AFM)作为扫描探针显微镜家族的一员，具有纳米级的分辨能力，其操作容易简便，是目前研究纳米科技和材料分析的最重要的工具之一。此外原子力显微镜还具有摩擦性能，纳米机械性能和电学性能等高级性能。 在本研究中，我们将讨论接触模式、非接触模式和轻敲模式等原子力显微镜使用中的不同操作模式；内容将概括到从原子力显微镜测量中常用的原子相互作用的基本理论，到原子力显微镜的主要硬件组成。本讲座还将讨论各模式的关键点(如设定值、反馈)。 在接触模式下，系统会给探针恒定的力作为设定的基准点也就是设定点来物理接触样品。扫描期间为了维持这个设定点而进行反馈。在三种模式中，原理相对简单。然而，由于接触模式很容易对针尖和样品造成损伤。相比之下，非接触模式允许在不接触表面的情况下进行形貌测量。因此，可以很好地保护针尖和样品。轻敲模式与非接触模式原理相似，在扫描过程中，探针轻触样品表面，以获得测量材料属性分布的额外信息(例如模量分布)。 本次讲座主要针对AFM原理的基础知识，帮助大家了解探针和样品之间的相互作用。由三种模式测出的图像对比也将在讲座中呈现。报告人 : Park原子力显微镜应用科学家Chris Jung Chris Jung, is an Application Scientist for Park Systems Korea - Research Application Technology Center (RATC) department. He received his Master’s degree in Physics from the Kyung Hee University, and his Bachelor’s degree in Physics from Dankook University in South Korea. His major project includes Evaluation of Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM) at the perspective of resolution.Park原子力显微镜系列讲座列表（5月-9月） 想了解更多详情，请关注微信公众号：Park原子力显微镜 400电话：400-878-6829 Park官网：parksystems.cn

这里是TESCAN电镜学堂第三期，将继续为大家连载《扫描电子显微镜及微区分析技术》(本书简介请至文末查看)，帮助广大电镜工作者深入了解电镜相关技术的原理、结构以及最新发展状况，将电镜在材料研究中发挥出更加优秀的性能！第四节 各种信号与衬度的总结前面两节详细的介绍了扫描电镜中涉及到的各种电子信号、电流信号、电磁波辐射信号和各种衬度的关系，下面对常见的电子信号和衬度做一个总结，如图2-36和表2-4。图2-36 SEM中常见的电子信号和衬度关系表2-4 SEM中常见的电子信号和衬度关系第五节 荷电效应扫描电镜中还有一种不希望发生的现象，如荷电效应，它也能形成某些特殊的衬度。不过在进行扫描电镜的观察过程中，我们需要尽可能的避免。§1. 荷电的形成根据前面介绍的扫描电镜原理，电子束源源不断的轰击到试样上，根据图2-6，只有原始电子束能量在v1和v2时，二次电子产额δ才为1，即入射电子和二次电子数量相等，试样没有增加也没减少电子，没有吸收电流的形成。而只要初始电子束不满足这个条件，都要形成吸收电流以满足电荷的平衡， i0= ib+is+ia。要实现电荷平衡，就需要试样具备良好的导电性。对于导体而言，观察没有什么问题。但是对于不导电或者导电不良、接地不佳的试样来说，多余的电荷不能导走，在试样表面会形成积累，产生一个静电场干扰入射电子束和二次电子的发射，这就是荷电效应。荷电效应会对图像产生一系列的影响，比如：① 异常反差：二次电子发射受到不规则影响，造成图像一部分异常亮，一部分变暗；② 图像畸变：由于荷电产生的静电场作用，使得入射电子束被不规则偏转，结果造成图像畸变或者出现阶段差；③ 图像漂移：由于静电场的作用使得入射电子束往某个方向偏转而形成图像漂移；④ 亮点与亮线：带点试样经常会发生不规则放电，结果图像中出现不规则的亮点与亮线；⑤ 图像“很平”没有立体感：通常是扫描速度较慢，每个像素点驻留时间较长，而引起电荷积累，图像看起来很平，完全丧失立体感。如图2-37都是典型的荷电效应。图2-37 典型的荷电效应§2. 荷电的消除荷电的产生对扫描电镜的观察有很大的影响，所以只有消除或降低荷电效应，才能进行正常的扫描电镜观察。消除和降低荷电的方法有很多种，这里介绍一下常用的方法。首先，在制样环节就要注意以便减小荷电：1） 缩小样品尺寸、以及尽可能减少接触电阻：这样可以增加试样的导电性。2）镀膜处理：给试样镀一层导电薄膜，以改善其导电性，这也是使用的最多的方法。常用的镀膜有蒸镀和离子溅射两种，常用的导电膜一般是金au和碳，如果追求更好的效果，还可使用铂pt、铬cr、铱ir等。镀导电膜不但可以有效的改善导电性，还能提高二次电子激发率，而且现在的膜厚比较容易控制，一定放大倍数内不会对试样形貌产生影响。不过镀膜也有其缺点，镀膜之后会有膜层覆盖，影响样品的真实形貌的，严重的话还会产生假象，对一些超高分辨的观察或者一些细节（如孔隙、纤维）的测量以及eds、ebsd分析产生较大影响。如图2-38，石墨在镀pt膜后，产生假象；如图2-39，纤维在镀金之后，导致显微变粗，孔隙变小。图2-38 石墨镀金膜之后的假象图2-39 纤维在镀金前（左）后（右）的图像除了制样外，还要尽可能寻找合适的电镜工作条件，以消除或减弱荷电的影响：3） 减小束流：降低入射电子束的强度，可以减小电荷的积累。4） 减小放大倍数：尽可能使用低倍观察，因为倍数越大，扫描范围越小，电荷积累越迅速。5） 加快扫描速度：电子束在同一区域停留时间较长，容易引起电荷积累；此时可以加快电子束的扫描速度，在不同区域停留的时间变短，以减少荷电。6） 改变图像采集策略：扫描速度变快后，图像信噪比会大幅度降低，此时利用线积累或者帧叠加平均可以减小荷电效应同时提升信噪比。线积累对轻微的荷电有较好的抑制效果；帧叠加对快速扫描产生的高噪点有很好的抑制作用，但是图像不能有漂移，否则会有重影引起图像模糊。如图2-40，样品为高分子球，在扫描速度较慢时，试样很容易损伤而变形，而快速扫描同时进行线积累的采集方式，试样完好且图像依然有很好的信噪比。图2-40 高分子球试样在不同扫描方式下的对比7）降低电压：减少入射电子束的能量（降至v2以内）也能有效的减少荷电效应。如图2-41，试样是聚苯乙烯球，加速电压在5kV下有明显的荷电现象，降到2kV下荷电基本消除。不过随着加速电压的降低，也会带来分辨率降低的副作用。图2-41 降低加速电压消除荷电影响8）用非镜筒内二次电子探测器或者背散射电子探测器观察：在有大量荷电产生的时候，会有大量的二次电子被推向上方，倒是镜筒内二次电子接收的电子信号量过多，产生荷电，尤其在浸没式下，此时使用极靴外的探测器，其接收的电子信号量相对较少，可以减弱荷电效应，如图2-42；另外，背散射电子能量高，其产额以及出射方向受荷电的影响相对二次电子要小很多，所以用bse像进行观察也可以有效的减弱荷电效应，如图2-43，氧化铝模板在二次电子和背散射图像下的对比。图2-42 镜筒内（左）和镜筒外（右）探测器对荷电的影响图2-43 SE（左）和BSE（右）图像对荷电的影响9） 倾转样品：将样品进行一定角度的倾转，这样可以增加试样二次电子的产额，从而减弱荷电效应。 除此之外，电镜厂商也在发展新的技术来降低或消除荷电，最常见的就是低真空技术。低真空技术是消除试样荷电的非常有效的手段，但是需要电镜自身配备这种技术。10）低真空模式：低真空模式下可以利用电离的离子或者气体分子中和产生的荷电，从而在不镀膜或者不用苛刻的电镜条件即可消除荷电效应。不过低真空条件下，原始电子束会被气体分子散射，所以分辨率、信噪比、衬度都会有一定的降低。如图2-44，生物样品在不镀导电膜的情况下即可实现二次电子和背散射电子的无荷电效应的观察。图2-44 低真空BSE（左）和SE（右）的效果对比福利时间每期文章末尾小编都会留1个题目，大家可以在留言区回答问题，小编会在答对的朋友中选出点赞数最高的两位送出本书的印刷版。奖品公布上期获奖的这位童鞋，请您关注“TESCAN公司”微信公众号，后台私信小编邮寄地址，我们会在收到您的信息并核实后即刻寄出奖品。【本期问题】低真空模式下，空气浓度高低对消除荷电能力的强弱有什么影响？（快关注微信去留言区回答问题吧~）简介《扫描电子显微镜及微区分析技术》是由业内资深的技术专家李威老师（原上海交通大学扫描电镜专家，现任TESCAN技术专家）、焦汇胜博士（英国伯明翰大学材料科学博士，现任TESCAN技术专家）、李香庭教授（电子探针领域专家，兼任全国微束分析标委会委员、上海电镜学会理事）编著，并于2015年由东北师范大学出版社出版发行。本书编者都是非常资深的电镜工作者，在科研领域工作多年，李香庭教授在电子探针领域有几十年的工作经验，对扫描电子显微镜、能谱和波谱分析都有很深的造诣，本教材从实战的角度出发编写，希望能够帮助到广大电镜工作者，特别是广泛的TESCAN客户。↓ 往期课程，请关注微信查阅以下文章：电镜学堂丨扫描电子显微镜的基本原理(一) - 电子与试样的相互作用电镜学堂丨扫描电子显微镜的基本原理(二) - 像衬度形成原理

格拉斯哥大学和赫瑞瓦特大学的物理学家团队利用一种被称为Hong-Ou-Mandel（HOM）的量子现象来生成图像，在传统光学显微镜失效的情况下生成精细显微图像。相关研究成果发表在《自然-光子学》上。　　该技术可用于量子传感，在分光器的输出端和光电探测器之间放置一个透明的表面，为光子被检测的时间引入一个轻微的延迟，该延迟可为精密分析提供一些细节。格拉斯哥团队将其应用于显微镜，使用单光子敏感相机来测量成束和反成束的光子，分析微观图像。他们使用装置生成高分辨率的图像，这些图像被喷在显微镜载玻片上的透明亚克力上。　　研究团队表示，传统显微镜中的样本需保持完全静止，微小的振动都可能导致图像模糊。然而，HOM技术只需要测量光子，对稳定性的需求较低。

自1965年第一台商品扫描电镜问世以来，经过50多年的不断改进，扫描电镜的分辨率已经大大提高，而且大多数扫描电镜都能与X射线能谱仪等附件或探测器组合，成为一种多功能的电子显微仪器。在材料领域中，扫描电镜发挥着极其重要的作用，可广泛应用于各种材料的形态结构、界面状况、损伤机制及材料性能预测等方面的研究，如图1所示的纳克微束FE-1050系列场发射扫描电镜。图1 纳克微束FE-1050系列场发射扫描电镜场发射扫描电镜组成结构可分为镜体和电源电路系统两部分，镜体部分由电子光学系统、信号收集和显示系统以及真空系统组成，电源电路系统为单一结构组成。1.1 电子光学系统由电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。1.2 信号收集检测样品在入射电子作用下产生的物理信号，然后经视频放大作为显像系统的调制信号。1.3 真空系统真空系统的作用是为保证电子光学系统正常工作，防止样品污染，一般情况下要求保持10-4~10-5Torr的真空度。1.4 电源电路系统电源系统由稳压，稳流及相应的安全保护电路所组成，其作用是提供扫描电镜各部分所需的电源。图3为扫描电镜工作原理示意图，具体如下：由电子枪发出的电子束在加速电压（通常200V～30kV）的作用下，经过两三个电磁透镜组成的电子光学系统，电子束被聚成纳米尺度的束斑聚焦到试样表面。与显示器扫描同步的电子光学镜筒中的扫描线圈控制电子束，在试样表面的微小区域内进行逐点逐行扫描。由于高能电子束与试样相互作用，从试样中发射出各种信号（如二次电子、背散射电子、X射线、俄歇电子、阴极荧光、吸收电子等）。图3 扫描电镜的工作原理示意图这些信号被相应的探测器接收，经过放大器、调制解调器处理后，在显示器相应位置显示不同的亮度，形成符合人类观察习惯的二维形貌图像或者其他可以理解的反差机制图像。由于图像显示器的像素尺寸远大于电子束斑尺寸，且显示器的像素尺寸小于等于人类肉眼通常的分辨率，显示器上的图像相当于把试样上相应的微小区域进行了放大，而显示图像有效放大倍数的限度取决于扫描电镜分辨率的水平。早期输出模拟图像主要采用高分辨照相管，用单反相机直接逐点记录在胶片上，然后冲洗相片。随着电子技术和计算机技术的发展，如今扫描电镜的成像实现了数字化图像，模拟图像电镜已经被数字电镜取代。扫描电镜是科技领域应用最多的微观组织和表面形貌观察设备，了解扫描电镜的工作原理及其应用方法，有助于在科学研究中利用好扫描电镜这个工具，对样品进行全面细致的研究。转载文章均出于非盈利性的教育和科研目的，如稿件涉及版权等问题，请立即联系我们，我们会予以更改或删除相关文章，保证您的权益。

人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，我们是怎么一步步地看见细菌、病毒，乃至蛋白质结构的呢？这背后离不开这群“强迫症”。采访专家：张德添（军事医学科学院国家生物医学分析中心教授）“我非常惊奇地看到水中有许多极小的活体微生物，它们如此漂亮而动人，有的如长矛穿水而过，有的像陀螺原地打转，还有的灵巧地徘徊前进，成群结队。你简直可以将它们想象成一群飞行的蚊虫。”1675年，一名荷兰代尔夫特市政厅的小公务员给英国皇家学会写了这样一封信，向学会的会员们描述自己用自制的显微镜观察到的奇妙景象。作为给当时欧洲最富盛名的学术组织寄去的一封学术讨论信件，这名公务员并没有进行大篇幅严谨却枯燥的科学论证，而是用朴实的语言，在字里行间留下了自己发现新事物时那种孩童般的惊奇与喜悦。这位当时默默无闻的小公务员，正是大名鼎鼎的微生物学和显微镜学先驱者—安东尼范列文虎克。在50年的时间里，列文虎克用制作的显微镜观察到了细菌、肌纤维和精细胞等微观生物，并先后给英国皇家学会寄去了300多封信件来讨论他的新发现。正是在列文虎克的不懈坚持下，人类观察世界的眼睛终于来到了微生物层面。初代显微镜：拨开微生物世界的迷雾列文虎克能发现色彩斑斓的微生物世界，主要得益于他在透镜制作方面的天赋。他一生中制作了多达400多台显微镜，与今日我们熟知的显微镜存在很大不同，列文虎克的显微镜绝大多数属于单透镜显微镜，仅由一个小黄铜板构成，使用时需要仰身将这个铜板面向阳光进行观察。列文虎克凭借他的一系列惊人发现迅速成为当时科学界的“网红级”人物。然而真正奠定显微镜学理论基础的，则是同时期的英国科学家罗伯特胡克。在列文虎克还在钻研透镜制作技艺时的1665年，在英国皇家学会负责科学试验的胡克，就制作了一台显微镜，与列文虎克使用的单透镜显微镜不同，这是一台复式显微镜，其工作原理和外形已经很接近现代的光学显微镜了。胡克用这台显微镜观察一片软木薄片，发现了密密麻麻的格子状结构，酷似当时僧侣居住的单人房间，因此胡克就用英语中单人间一词“cell”来命名这种结构，而这个单词在当代被翻译为“细胞”。不久，胡克写就了《显微图谱》一书，将这一重要观察成果写入书中。胡克的研究成果很快引起了列文虎克的注意，他曾研究过胡克的显微镜，但最后还是使用了自制的单透镜显微镜来进行观察。原因就在于胡克显微镜存在严重的色差问题。所谓色差，就是在光线经过透镜时，不同颜色的光因折射率不同，会聚焦于不同的点上，使得样品的成像被一层色彩光斑所包围，严重影响清晰度。列文虎克提出的解决方案也很简单，就是在透镜研磨的精细程度上下功夫，将单透镜制成小玻璃珠，并将之嵌入黄铜板的细孔内，这样在放大倍数不低于胡克显微镜的基础上，最大程度避免色差对成像的干扰。但代价是，由于观察时是需要对着阳光，对观测者的眼睛伤害很大。除了色差，早期显微镜还存在着球面像差问题，即光线在经过透镜折射时，接近中心与靠近边缘的光线不能将影像聚集在一点上，使得成像模糊不清。自显微镜诞生之日起，色差和球面像差就成为“与生俱来的顽疾”，一直制约着人们向微观世界进军的步伐。直到19世纪，光学显微技术才在工业革命的助力下完成了一次实质性蜕变，从而在根本上解决了这两个难题。挑战色差与球面像差：逐渐清晰的微观视角首先是1830年，一个名为李斯特的英国业余显微镜学爱好者首先向球面像差发起挑战，他创造性地用几个特定间距的透镜组，成功减小了球面像差影响。此后，改进显微镜的主阵地很快转移到了德国，其中1846年成立的蔡司光学工厂，更是在此后一个世纪里成为领头羊。1857年蔡司工厂研制出第一台现代复式显微镜，并成功打入市场。不过在研制和生产过程中，蔡司也深受色差之苦：当时通行的增加透镜数量的做法，虽能提升显微镜的放大倍数，却仍无法消除色差对成像清晰度的干扰。1872年，德国耶拿大学的恩斯特阿贝教授提出了完善的显微镜学理论，详细说明了光学显微镜的成像原理、数值孔径等科学问题。蔡司也迅速邀请阿贝教授加盟，并研制出一批划时代的光学部件，其中就包括复消色差透镜，一举消除了色差的影响。在阿贝教授的技术加持下，蔡司工厂的显微镜成为同类产品中的佼佼者，很快成为欧美各大实验室的抢手货，并奠定了现代光学显微镜的基本形态。不久，蔡司又拉来了著名化学家奥托肖特入伙，将其研制的具有全新光学特性的锂玻璃应用在自家产品上。1884年，蔡司更是联合阿贝与肖特，成立了“耶拿玻璃厂”，专为显微镜生产专业透镜。显微镜技术的突飞猛进也让各种现代生物学理论不断完善，透过高分辨率的透镜，微观世界中各种复杂的结构逐步以具象的形式呈现在人类眼前。由于微观层面的生物结构大多是无色透明的，为了让他们在镜头下变得清晰可见，当时的科学家普遍将生物样品染色，以此提高对比度方便观察。这一方法最大的局限在于，染料本身的毒性往往会破坏微生物的组织结构，这一时期染剂落后的材质，也无法实现对某些特定组织的染色。直到1935年荷兰学者泽尼克发现了相衬原理，并将之成功应有于显微镜上。这种相衬显微技术，利用光线穿过透明物体产生的极细微的相位差来成像，使得显微镜能够清晰地观察到无色透明的生物样品。泽尼克本人则凭借此次发现斩获了1953年的诺贝尔物理学奖。军事医学科学院国家生物医学分析中心教授，长期致力于电子显微镜领域研究的张德添向记者介绍道：“人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，而光学显微镜的分辨本领可以达到0.2微米（1毫米=1000微米）的水平，能够看到细菌和细胞。但由于光具有波动性，衍射现象限制了光学显微镜分辨本领的进一步提高。”二战结束后，随着各种新理论新技术的不断应用，光学显微镜得到了长足进步，但也是在这一时期，光学显微镜的潜力已经被发掘到了极限。为蔡司工厂乃至整个显微镜学立下汗马功劳的阿贝教授就提出了“分辨率极限理论”，认为普通光学显微镜的分辨率极限是0.2微米，再小的物体就无能为力了—这一理论又被称为“阿贝极限”，这就好像一层屏障将人类的探索目光阻隔在更深度的微观世界大门之前，迫使科学家们另寻他途。电子显微镜：另辟蹊径，重新发现既然可见光存在这样的短板，那么能否利用其他波长较短的光束来实现分辨率的突破呢？张德添进一步介绍道：“1924年后，人们从物质领域内找到了波长更短的媒质—电子，从而发明了电子显微镜，其分辨本领达到了0.1纳米的水平。”1931年，德国科学家克诺尔和他的学生鲁斯卡在一台高压示波器上加装了一个放电电子源和三个电子透镜，制成了世界首台电子显微镜，就此为人类探索微观世界开拓了一条全新的思路。电子显微镜完全不受阿贝极限的桎梏，在分辨率上要远远超越当时的光学显微镜。鲁斯卡在次年对电子显微镜进行了改进，分辨率一举达到纳米级别（1微米=1000纳米）。在这个观测深度，人类终于亲眼看到了比细菌还要小的微生物—病毒。1938年，鲁斯卡用电子显微镜看到了烟草花叶病毒的真身，而此时距离病毒被证实存在已经过去了40年时间。对于电子显微镜技术的发明，张德添这样评价道：“电子显微镜是人们认识超微观世界的钥匙和工具，它解决了光学显微镜受自然光波长限制的问题，将人们对世界的认识从细胞水平提高到了分子水平。” 从肉眼只能观察到的毫米尺度，到光学显微镜能够达到的微米尺度，再到电子显微镜能进一步下探到纳米尺度，显微成像技术正在迅速突破人类对微观世界的认知极限。不过电子显微镜本身的缺憾也愈加明显。由于电子加速只能在真空条件下实现，在真空环境之下，生物样品往往要经过脱水与干燥，这意味着电子显微镜根本无法观测到活体状态下的生物样品，此外电子束本身又容易破坏样品表面的生物分子结构，这就导致样品本身会丢失很多关键信息。这一顽疾在此后又困扰了科学家多年。直到1981年，IBM苏黎世实验室的两位研究员宾尼希与罗雷尔，用一种当时看起来颇有些“离经叛道”的方法，首先解决了电子束损害样品结构的问题。他们利用量子物理学中的“隧道效应”，制作了一台扫描隧道显微镜。与传统的光学和电子显微镜不同，这种显微镜连镜头都没有。在工作时，用一根探针接近样品，并在两者之间施加电压，当探针距离样品只有纳米级时就会产生隧道效应—电子从这细微的缝隙中穿过，形成微弱的电流，这股电流会随着探针与样品距离的变化而变化，通过测量电流的变化人们就能间接得到样品的大致形状。由于全程没有电子束参与，扫描隧道显微镜从根本上避免了加速电子对生物样品表面的破坏。扫描隧道显微镜在今天也被称为“原子力显微镜”，“在微米甚至纳米水平，动态观察生物样品表面形貌结构的变化规律，原子力显微镜是有其独特优势的”，张德添向记者解释说，“如果条件允许，还可以检测生物大分子间相互作用力的大小，为结构与功能关系研究提供便利。”1986年，宾尼希和罗雷尔凭借扫描隧道显微镜，获得当年的诺贝尔物理学奖，有趣的是，与他们一起分享荣誉的，还有当初发明电子显微镜的鲁斯卡，当时的他已是耄耋老人，而他的恩师克诺尔也早已作古。新老两代电子显微镜技术的里程碑人物同台领奖，成为当时物理学界的一段佳话。老树新芽：突破“阿贝极限”的光学显微镜电子显微镜在问世之后的几十年间，极大拓展了人类对生物、化学、材料和物理等领域认知疆界。而无论是鲁斯卡，还是宾尼希和罗雷尔，他们所作的贡献不仅让自己享誉世界，还助力其他领域的学者登上荣誉之巅。比如英国化学家艾伦克鲁格凭借对核酸与蛋白复杂体系的研究获得1982年度诺贝尔化学奖，而他的科研成果正式依靠高分辨电子显微镜技术和X光衍射分析技术而取得的。在克鲁格获奖的当年，以色列化学家达尼埃尔谢赫特曼更是使用一台电子显微镜，发现了准晶体的存在，并独享了2011年的诺贝尔化学奖。目前，电子显微镜已经成为金属、半导体和超导体领域研究的主力军。但在生物和医学领域，电子显微镜本身对生物样品的损害，依旧是难以逾越的技术难题。于是不少科学家开始从两条路径上寻求解决之道：一条是研发冷冻电镜技术，这种技术并不改变电子显微镜整体的工作模式，而是从生物样品本身入手，对其进行超低温冷冻处理。这样状态下，即使处在真空环境中，样品也能保持原有的形态特征与生物活性。“由于观测温度低，生物样品也处于含水状态，分子也处于天然状态，样品对辐射的耐受能力得以提高。我们可以将样品冻结在不同状态，观测分子结构的变化。”张德添向记者解释道。瑞士物理学家雅克杜波切特、美国生物学家乔基姆弗兰克和英国生物学家理查德亨德森凭借这项技术分享了2017年度诺贝尔化学奖。新冠疫情暴发后，冷冻电镜技术又为人类研究和抗击疫情做出了突出贡献。2020年，西湖大学周强实验室就利用这种技术，首次成功解析了此次新冠病毒的受体—ACE2的全长结构，让人类对新冠病毒的认识向前迈出了关键性一步。另一条路径是从传统的光学显微镜入手。在电子显微镜的黄金时代，不少科学家就开始着手研制超高分辨率光学显微镜，甚至开始尝试突破一直以来困扰光学显微镜的“阿贝极限”，而“荧光技术”就成为实现这一切的关键。早在19世纪中叶，科学家们就发现：某些物质在吸收波长较短而能量较高的光线（比如紫外光）时，能将光源转化为波长较长的可见光。这种现象后来被定义为“荧光现象”。荧光现象在自然界是普遍存在的，这一现象背后的原理也在20世纪迅速被应用在光学显微镜上。1911年，德国科学家首次研制出荧光显微镜装置，用荧光色素对样品进行荧光染色处理，并以紫外光激发样品的荧光物质发光，但成像效果不佳，而且把荧光物质当作染色剂，和早期的染色剂一样，本身的毒性会伤害活体样品。直到1974年，日本科学家下村修发现了绿色荧光蛋白，其毒性远弱于以往的荧光物质，是对活体标本进行荧光标记的理想材料——这一发现成为日后科学家突破“阿贝极限”的有力武器。时间来到1989年，供职于美国IBM研究中心的科学家莫尔纳首次进行了单分子荧光检测，使得光学显微镜的检测尺度精确到纳米量级成为可能。随后在莫尔纳的基础上，美国科学家贝齐格开发出一套新的显微成像方法：控制样品内的荧光分子，让少量分子发光，借此确定分子中心和每个分子的位置，通过多次观察呈现出纳米尺度的图像。通过这种方法，贝齐格轻而易举地突破了光学显微镜的阿贝极限。几乎在同时，德国科学家斯特凡赫尔在一次光学研究中突发奇想：根据荧光现象原理，如果用镭射光激发样品内的荧光物质发光，同时用另一束镭射光消除样品体内较大物体的荧光，这样就只剩下纳米尺度的分子发射荧光并被探测到，不就能在理论上得到分辨率大于0.2微米的微观成像了吗？他随即开始了试验，并制成了一台全新显微镜，将光学显微镜分辨率下探到了0.1微米的水平。困扰光学显微技术百年的阿贝极限难题，就这样历经几代科学家的呕心沥血，终于在本世纪初被成功攻克。莫尔纳、贝齐格和赫尔三位科学家更是凭借“超分辨率荧光显微技术”分享了2014年度的诺贝尔化学奖。时至今日，在探索微观世界的征途上，光学显微镜和电子显微镜互有长短、相得益彰。当然在实际应用中，科学家越来越依赖于将多种显微成像技术结合使用。比如今年5月，英国弗朗西斯克里克研究所就依托钙化成像技术、体积电子显微技术等多种显微成像技术，成功获得了人类大脑神经网络亚细胞图谱。在未来，多种显微成像技术相结合，各施所长，将进一步完善我们在生物、医学、化学和材料等领域的知识结构，把这个包罗万象的奇妙世界更完整地呈现在我们眼前。

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 2018年11月14日，太原市宜达科技服务有限公司受太原理工大学的委托，在中国政府采购平台对“太原理工大学多功能聚焦离子显微镜”招标项目进行国内公开招标采购，拟以850万元的预算金额采购1套多功能聚焦离子显微镜。开标时间为12月6日。 /p table style=" width: 646px " width=" 745" cellspacing=" 0" cellpadding=" 0" border=" 1" tbody tr style=" height:27px" class=" firstRow" td style=" border: 1px solid black padding: 1px " width=" 38" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 序号 /span /p /td td style=" border-color: black black black currentcolor border-style: solid solid solid none border-width: 1px 1px 1px medium border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 154" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 货物名称 /span /p /td td style=" border-color: black black black currentcolor border-style: solid solid solid none border-width: 1px 1px 1px medium border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 45" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 数量 /span /p /td td style=" border-color: black black black currentcolor border-style: solid solid solid none border-width: 1px 1px 1px medium border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 47" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 单位 /span /p /td td colspan=" 2" style=" border-color: black black black currentcolor border-style: solid solid solid none border-width: 1px 1px 1px medium border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 265" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 功能及主要技术指标 /span /p /td td style=" border-color: black black black currentcolor border-style: solid solid solid none border-width: 1px 1px 1px medium border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 47" valign=" top" height=" 27" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 备注 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 38" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 1 /span /p /td td style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 154" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 多功能聚焦离子显微镜 /span /p /td td style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 45" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 1 /span /p /td td style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 47" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 套 /span /p /td td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 265" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 所购置的设备需包含电子束成像系统、离子切割系统，同时配置能谱、电子背散射衍射仪、飞行时间二次离子质谱等附件，具备纳米微观形貌观察、切割加工、元素分布与成分分析、晶体结构微观表征、刻蚀、沉积等多项功能，此外还需配置纳米机械手，可进行透射电镜样品制备，特别是搭载原位分析平台和飞行时间二次离子质谱仪后，设备成为集三维分析、原位分析、透射电镜制样、全部“轻”元素分析、同位素分析、材料加工的综合显微分析平台。 /span /p /td td style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 47" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 进口产品 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 是否允许代理商投标 /span /p /td td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 93" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 是 /span /p /td td style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 208" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 是否接受联合体投标 /span /p /td td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 104" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 否 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 具备法律、行政法规规定的其他条件 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 无 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 特殊要求 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 无 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 交货时间 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 自合同签订之日起 span 180 /span 日历天内完成运输、安装、调试、培训，达到验收标准。 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 交货地点 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 太原理工大学明向校区 span ( /span 山西省晋中市榆次区大学街 span 209 /span 号 span ) /span 物电楼，运费包含送货上门及上楼费用。 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 款项支付方式 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 货到验收合格后一次性支付全款。 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 履约保证金 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 按合同约定执行。 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 执行标准与验收标准 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 执行标准：该采购设备属于近 span 10 /span 年研制推出，国内尚未制定相关国家 span / /span 地方标准，扫描电镜部分符合国家标准《射线衍射仪和荧光分析仪防护标准》，该设备不涉及放射源 span /span /span /p p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 验收标准：整机调试后，清点验收附属零配件，并检查、验证仪器性能是否达到合同规定的技术指标。 /span /p /td /tr tr style=" height:25px" td colspan=" 2" style=" border-color: currentcolor black black border-style: none solid solid border-width: medium 1px 1px border-image: none 100% / 1 / 0 stretch padding: 1px " width=" 192" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 服务要求 /span /p /td td colspan=" 5" style=" border-color: currentcolor black black currentcolor border-style: none solid solid none border-width: medium 1px 1px medium padding: 1px " width=" 405" height=" 25" p style=" text-align:left line-height:30px text-autospace:ideograph-numeric" span style=" font-size:16px font-family:宋体 color:black" 详见招标文件内商务、技术要求。 /span /p /td /tr /tbody /table p 　　 strong 采购信息如下表： /strong /p p 　　 strong 采购人基本信息 /strong /p p 　　单位名称：太原理工大学 /p p 　　单位地址：山西省太原市迎泽西大街79号 /p p 　　项目联系人：崔老师 /p p 　　联系电话：0351-6010320 /p p 　　邮箱：cuisx1964@163.com /p p 　　 strong 采购代理机构基本信息 /strong /p p 　　单位名称：太原市宜达科技服务有限公司 /p p 　　单位地址：太原市高新区创业街11号天和科技大楼5层 /p p 　　项目负责人：王玮萍、王勇 /p p 　　联系电话：0351-7030399，13327511715 /p p 　　邮箱：ydgdzs@126.com /p

2022年的春节已接近尾声，科研的小伙伴已经开始忙碌起来了，对于新学期是不是也有新的计划，发一篇sci的文章顺利毕业，脱单flag，头发多一点点，细胞养好，科研项目进展顺利，老师能给买台心仪已久的显微镜；你想知道选择什么种类的显微镜，正置还是倒置，宽场显微镜、超高分辨率显微镜、激光共焦显微镜等等，小本本备好，我们开始了。1不同成像原理，不同分辨率的显微镜如何选择显微镜作为生命科学领域研究的必须工具，其结构复杂，配置繁多，根据不同的配置和结构，相应的价格有很大的差异。那很多用户在实际采购过程中，看到长串的配置不知如何去选择，怎么用合理的价格去买到一个完全能够满足自己实验需求的显微镜呢？从今天这期推文开始，将会着重介绍选择显微镜的几个关键核心问题，目的是让用户能够在自己的预算范围内选择出符合自己实验需求的显微镜。首先要知道显微镜从开始诞生发展到现在，主要通过分辨率来划分，分为宽场显微镜、超高分辨率显微镜、激光共焦显微镜以及电镜。这一系列显微镜的分辨率从光镜的200纳米到超高与共聚焦的100多到几十纳米再到电镜的0.2纳米。并不是说显微镜的分辨率越高，就越适合我们的研究。分辨率越高，意味着其价格和操作的难度系数是逐级增长的。那我们如何去选择一个适合我们的显微镜呢？要根据老师和用户自己样品的大小去选择。2不同机型的选择我们在根据样品的大小和观察的实验需求，确定了某一类型的显微镜之后。我们需要根据实验样品去选择相对应的合适机型。显微镜的主要机型，根据其光路设计的不同，主要分为体视显微镜、正置显微镜和倒置显微镜。体视显微镜：体视显微镜，是一种具有正像立体感的显微镜，被广泛应用于材料宏观表面观察、失效分析、断口分析等工业领域。以及生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。因为体视显微镜的光路设计，符合人体眼睛夹角的偏角，所以通过体视显微镜观察物体时，类似于我们眼睛的成像光路，这样会让我们看到立体的图像呈现。正是由于此设计，体视显微镜的分辨率要远低于传统的正置或倒置显微镜。体视显微镜更多的是观察小物体的宏观表象，而不是更为精细的细节。正置显微镜：正置显微镜作为最早诞生的机型它更多的是要配合玻片来对样品实现显微观察。如何来定义正置显微镜呢？显微镜物镜朝下，观察的样品在物镜的下方，这样的显微镜我们称之为正置显微镜。一般适用于的观察样品为：透明样品、薄的样片、生物切片、涂片等。但由于正置显微镜的机械设计，样品位于载物台与物镜中间。低倍物镜齐焦时，与载物台之间的距离大约为三厘米左右。像无法切割的厚样品，类似矿石、零件或者是在孔板、培养皿、培养瓶中培养的细胞，就无法在正置显微镜下进行观察，那由此人们设计了倒置显微镜。倒置显微镜：顾名思义，倒置显微镜与正置显微镜正好相反，那么定义也是相反的，物镜朝上，要观察的样品在物镜的上方，此类显微镜我们称之为倒置显微镜。我们可以看到倒置显微镜，物镜和载物台之间不再放观察的样品，样品是放于载物台的上面，所以样品的厚度就不会受到载物台与物镜之间距离的限制。因此倒置显微镜主要用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察。介绍了三种不同形式的显微镜，相信我们的老师和用户对自己的样品适用于什么类型的显微镜已经有了一个大体的判断。当我们更多的去观察样品的立体结构，对细节和分辨率没有更高追求的时候，我们通常会选择体视显微镜。当我们的样品无法制成玻片或者不能放在玻片上时，我们就去选择倒置显微镜。如果能制成玻片就选择正置。为什么说能制成玻片就去选择正置呢？因为对于倒置显微镜来说，正置显微镜的高倍数观察更方便，比如60X和100X的油镜。同时，因为它的光路要比倒置更短，搭配高分辨率聚光器后分辨率更高，对比度更好。通过我们这期推文的介绍，老师对于选择哪种分辨率水平的显微镜，以及什么类型的显微镜会有一个较为清楚的了解。这些只是我们采购或选择显微镜的第一步，就是我们确定显微镜的类型。针对不同的观察样品，又会有其更为适应的观察方式，又有不同的光源，不同品质的物镜，供我们去选择。欲知后事如何，且听下回分解。｜申请试用｜ECHO 显微镜可以申请试用哦！关注“深蓝云生物科技”公众号，点击“云活动”→“试用中心”即可。

日期和时间：6月28日 上午10点-11点整主讲人： 帕克公司资深售后服务工程师&应用专家，AFM从业经验8年针尖-样品相互作用的力值量测 力-距离(F-D)曲线是一种分光镜检查技术，在Z轴扫描仪伸缩的同时，测量针尖与样品表面间的垂直相互作用。直接测量针尖与样品间的相互作用力时，对比悬臂偏转功能与压电扫描仪延伸，反映表面的力学性能。原子力显微镜包含各种各样的扫描模式可以到样品的形貌图或其他对应的特性分析图， 而这其中的力和距离曲线在表面科学，纳米技术，生物科学和许多其他研究领域中也扮演了非常重要角色。 在帕克的每一台设备的基本配置中都包含力和距离光谱分析。它不需要一些特殊的辅助模块进行操作，只是在探针和样品接触后分离的状态下，去获得相应点的力曲线。但是看似简单地操作， 却也涉及到了很多难点，想探针的选择，参数的设定，悬臂的校准等等。并且，液下力曲线，力曲线成像，更如PinPoint模式也都是这个领域的延伸。 而对于特殊材料进行力曲线分析，如细胞等，探针的改良也是一种保护样品不被破坏的途径，并能够让测量变成更容易的几何运算。它也是一种力曲线分析的难点之一。 这些信息都会在本次研讨会上进行讨论和分析。请参考友情链接，进入官网免费申请听取网络讲堂！

自然界中一些最基本的过程发生在微观尺度上，远远超出了我们肉眼所能看到的极限，这推动了技术的发展，使我们能够超越这个极限。早在公元4世纪，人们发现了光学透镜的基本概念，并在13世纪，人们已经在使用玻璃镜片，以提高他们的视力和放大植物和昆虫等对象以便更好地了解他们。随着时间的推移，这些简单的放大镜发展成为先进的光学系统，被称为光学显微镜，使我们能够看到和理解超越我们感知极限的微观世界。今天，光学显微镜是许多科学和技术领域的核心技术，包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检测、法医学等等。在这篇文章中，我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上，我们将讨论当今常用的一些更高级的光学显微镜形式，并比较它们在不同应用中的优缺点。　　　　什么是光学显微镜?　　光学显微镜用于通过提供它们如何与可见光相互作用(例如，它们的吸收、反射和散射)的放大图像来使小结构样品可见。这有助于了解样品的外观和组成，但也使我们能够看到微观世界的过程，例如物质如何跨细胞膜扩散。　　显微镜的部件以及光学显微镜的工作原理　　从根本上说，显微镜包括两个子系统：一个用于照亮样品的照明系统和一个成像系统，该系统产生与样品相互作用的光的放大图像，然后可以通过眼睛或使用相机系统进行观察。　　早期的显微镜使用包含阳光的照明系统，阳光通过镜子收集并反射到样品上。今天，大多数显微镜使用人造光源，如灯泡、发光二极管(LED)或激光器来制造更可靠和可控的照明系统，可以根据给定的应用进行定制。在这些系统中，通常使用聚光透镜收集来自光源的光，然后在聚焦到样品上之前对其进行整形和光学过滤。塑造光线对于实现高分辨率和对比度至关重要，通常包括控制被照亮的样品区域和光线照射到它的角度。照明光的光学过滤，使用修改其光谱和偏振的光学过滤器，可用于突出样品的某些特征。图1：复合显微镜的基本构造：来自光源的光使用镜子和聚光镜聚焦到样品(物体)上。来自样品的光被物镜收集，形成中间图像，该图像由目镜再次成像并传递到眼睛，眼睛看到样品的放大图像。　　成像系统收集与样品相互作用的照明光，并产生可以查看的放大图像(如上图1)。这是使用两组主要的光学元件来实现的：首先，物镜从样品中收集尽可能多的光，其次，目镜将收集的光中传递到观察者的眼睛或相机系统。成像系统还可包括诸如选择来自样品的光的某些部分的孔和滤光器之类的元件，例如仅看到已从样品散射的光，或仅看到特定颜色或波长的光。与照明系统的情况一样，这种类型的过滤对于挑出某些感兴趣的特征非常有用，这些特征在对来自样本的所有光进行成像时会保持隐藏。　　总的来说，照明和成像系统在光学显微镜的性能方面起着关键作用。为了在您的应用中充分利用光学显微镜，必须充分了解基本光学显微镜的工作原理以及当今存在的变化。　　简单复合显微镜　　单个镜头可以用作放大镜，当它靠近镜头时，它会增加物体的外观尺寸。透过放大镜看物体，我们看到物体的放大和虚像。这种效果用于简单的显微镜，它由单个镜头组成，该镜头对夹在框架中并从下方照明的样品进行成像，如下图2所示。这种类型的显微镜通常可以实现2-6倍的放大倍率，这足以研究相对较大的样本。然而，实现更高的放大倍率和更好的图像质量需要使用更多的光学元件，这导致了复合显微镜的发展(如下图3)。图2：通过创建靠近它的物体的放大虚拟图像，将单个镜头用作放大镜。图3：左：简单显微镜。右：复合显微镜。　　在复合显微镜中，从底部照射样品以观察透射光，或从顶部照射样品以观察反射光。来自样品的光由一个由两个主要透镜组组成的光学系统收集：物镜和目镜，它们各自的功率倍增，以实现比简单显微镜更高的放大倍率。物镜收集来自样品的光，通常放大倍数为40-100倍。一些复合显微镜在称为“换镜转盘(nose piece)”的旋转转台上配备多个物镜，允许用户在不同的放大倍数之间进行选择。来自物镜的图像被目镜拾取，它再次放大图像并将其传递给用户的眼睛，典型的目镜放大率为10倍。　　可以用标准光学显微镜观察到的最小特征尺寸由所使用的光学波长(λ)和显微镜物镜的分辨率决定，由其孔径数值(NA)定义，最大值为NA =1空中目标。定义可区分的最小特征尺寸(r)的分辨率极限由瑞利准则给出：　　r=0.61×(λ/NA)　　例如，使用波长为550nm的绿光和典型NA为0.7的物镜，标准光学显微镜可以分辨低至0.61×(550nm)/0.7≈480nm的特征，这足以观察细胞(通常为10µm大小)，但不足以观察较小生物的细节，例如病毒(通常为250-400nm)。要对更小的特征成像，可以使用具有更高NA和更短波长的更先进和更昂贵的物镜，但这可能不适用于所有应用。　　在标准复合显微镜(如下图4a)中，样品(通常在载玻片上)被固定在一个可以手动或电子移动以获得更高精度的载物台上，照明系统位于显微镜的下部，而成像系统高于样本。然而，显微镜主体通常也可以适应特定用途。例如，立体显微镜(如下图4b)的特点是两个目镜相互成一个小角度，让用户可以看到一个略有立体感的图像。在许多生物学应用中，使用倒置显微镜设计(如下图4c)，其中照明系统和成像光学器件都在样品台下方，以便于将细胞培养容器等放置在样品台上。最后，比较显微镜(如下图4d)常用于法医。图4：复合显微镜。a)标准直立显微镜指示(1)目镜，(2)物镜转台、左轮手枪或旋转鼻镜(用于固定多个物镜)，(3)物镜、调焦旋钮(用于移动载物台)(4)粗调，(5)微调，(6)载物台(固定样品)，(7)光源(灯或镜子)，(8)光阑和聚光镜，(9)机械载物台。b)立体显微镜。c)倒置显微镜。　　光学显微镜的类型　　下面，我们将介绍一些当今可用的不同类型的光学显微镜技术，讨论它们的主要操作原理以及每种技术的优缺点。　　亮视野显微镜　　亮视野显微镜(Brightfield microscopy，BFM)是最简单的光学显微镜形式，从上方或下方照射样品，收集透射或反射的光以形成可以查看的图像。图像中的对比度和颜色是因为吸收和反射在样品区域内变化而形成的。BFM是第一种开发的光学显微镜，它使用相对简单的光学装置，使早期科学家能够研究传输中的微生物和细胞。今天，它对于相同的目的仍然非常有用，并且还广泛用于研究其他部分透明的样品，例如透射模式下的薄材料(如下图5)，或反射模式下的微电子和其他小结构。图5：亮视野显微镜。左图：透射模式-在显微镜下看到的石墨(深灰色)和石墨烯(最浅灰色)薄片。在这里，图像上看到的亮度差异与石墨层的厚度成正比。右图：反射模式-SiO2表面上的石墨烯和石墨薄片，小的表面污染物也是可见的。　　暗视野显微镜　　暗视野显微镜是一种仅收集被样品散射的光的技术。这是通过添加阻挡照明光直接成像的孔来实现的，这样只能看到被样品散射的照明光。通过这种方式，暗场显微镜突出显示散射光的小结构(如下图6)，并且对于揭示BFM中不可见的特征非常有用，而无需以任何方式修改样品。然而，由于在最终图像中看到的唯一光是被散射的光，因此暗场图像可能非常暗并且需要高照明功率，这可能会损坏样品。　　图6：亮视野和暗视野成像。a)亮视野照明下的聚合物微结构。b)与a)中结构相同的暗视野图像，突出显示边缘散射和表面污染。c)与a)和b)相似的结构，被直径为100-300nm的纳米晶体覆盖。仅观察到纳米晶体散射的光，而背景光被强烈抑制。　　相差显微镜　　相差显微技术(Brightfield microscopy，PCM)是一种可视化由样品光路长度变化引起的光学相位变化的技术.这可以对在BFM中产生很少或没有对比度的透明样品进行成像，例如细胞(如下图7)。由于肉眼不易观察到光学相移，因此相差显微镜需要额外的光学组件，将样品引起的相移转换为最终图像中可见的亮度变化。这需要使用孔径和滤光片来操纵照明系统和成像系统。这些形状和选择性地相移来自样品的光(携带感兴趣的相位信息)和照明光，以便它们建设性地干涉眼睛或检测器以创建可见图像。图7：人类胚胎干细胞群落的相差显微图像。　　微分干涉显微镜　　与PCM类似，微分干涉显微镜(differential interference contrast microscopy，DICM)通过将由于样品光路长度变化引起的光学相位转换为可见对比度，从而使透明样品(例如活的未染色细胞)可视化。然而，与PCM相比，DICM可以实现更高分辨率的图像，并且减少了由PCM所需的光学器件引入的清晰度和图像伪影。在DICM ，照明光束被线性偏振器偏振，其偏振旋转，使其分裂成两个偏振光束，它们具有垂直偏振和小(通常低于1µm)间隔。穿过样品后，两束光束重新组合，从而相互干扰。这将创建一个对比度与图像成正比的图像差在两个偏振光束之间的光相位，因此命名为“差”干涉显微镜。DICM产生的图像出现与采样光束之间的位移方向相关的三维图像，这导致样品边缘具有亮区或暗区，具体取决于两者之间的光学相位差的符号(如下图8)。图8：微分干涉对比显微镜。左：DICM的原理图。右图：通过DICM成像的活体成年秀丽隐杆线虫(C.elegans)。　　偏光显微镜　　在偏振光显微镜中，样品用偏振光照射，光的检测也对偏振敏感。为了实现这一点，偏振器用于控制照明光偏振并将成像系统检测到的偏振限制为仅一种特定的偏振。通常，照明和检测偏振设置为垂直，以便强烈抑制不与样品相互作用的不需要的背景照明光。这种配置需要一个双折射样品，它引入了照明光偏振角的旋转，以便它可以被成像系统检测到，例如，观察晶体的双折射以及它们的厚度和折射率的变化(如下图9)。图9：偏光显微镜。橄榄石堆积物的显微照片，由具有不同双折射的晶体堆积而成。整个样品的厚度和折射率的变化会导致不同的颜色。　　荧光显微镜　　荧光显微镜用于对发出荧光的样品进行成像，也就是说，当用较短波长的光照射时，它们会发出长波长的光。示例包括固有荧光或已用荧光标记物标记的生物样品，以及单分子和其他纳米级荧光团。该技术采用了滤光片的组合，可阻挡短波长照明光，但让较长波长的样品荧光通过，因此最终图像仅显示样品的荧光部分(如下图10)。这允许从由许多其他非荧光颗粒组成的样品中挑出和可视化荧光颗粒或已被染料染色的感兴趣细胞的分布。同时，荧光显微镜还可以通过标记小于此限制的粒子来克服传统光学显微镜的分辨率限制。例如，可以用荧光标记标记病毒以显示其位置在生物样品的情况下，可以表达荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白。结合各种新颖形式的样品照明，荧光显微镜的这一优势实现了“超分辨率”显微镜技术，打破了传统光学显微镜的分辨率限制。荧光显微镜的主要限制之一是光漂白，其中标记物或颗粒停止发出荧光，因为吸收照明光的过程最终会改变它们的结构，使它们不再发光。图10：荧光显微镜。左：工作原理-照明光由短通激发滤光片过滤，并由二向色镜反射到样品。来自样品的荧光通过二向色镜，并被发射滤光片额外过滤以去除图像中残留的激发光。右图：有机晶体中分子的荧光图像(晶体轮廓显示为黄色虚线)。由于来自其他分子和晶体材料的荧光，背景并不完全黑暗。　　免疫荧光显微镜　　免疫荧光显微镜是主要用于在微生物的细胞内的生物分子可视化的位置荧光显微镜的具体变化。在这里，用荧光标记物标记或固有荧光的抗体与感兴趣的生物分子结合，揭示它们的位置。(如下图11)图11：免疫荧光显微镜。肌动蛋白丝(紫色)、微管(黄色)和细胞核(绿色)的免疫荧光标记的两个间期细胞。　　共聚焦显微镜　　共聚焦显微镜是一种显微镜技术，它可以逐点成像来自样品的散射或荧光。不是一次对整个样品进行照明和成像，而是在样品区域上扫描源自点状光源的照明点，敏感检测器仅检测来自该点的光，从而产生2D图像。这种方法允许以高分辨率对弱信号样本进行成像，因为来自采样点之外的不需要的背景信号被有效抑制。在这里，所使用的波长和物镜在所有三个维度上都限制了成像光斑的大小。这允许通过将物镜移动到距样品不同的距离，在样品内的不同深度处制作2D图像。然后可以组合这些2D图像“切片”以创建样本的3D图像，这是所讨论的其他宽视场显微镜技术无法实现的，并且还允许以3D方式测量样品尺寸。这些优势的代价是无法一次性拍摄图像，而是必须逐点构建图像，这可能非常耗时并阻碍样本的实时成像(如下图12)。图12：单分子荧光的共聚焦荧光图像。小点对应于单个分子的荧光，而较大的点对应于分子簇。此处的荧光背景比简单的荧光显微镜图像弱得多，如亮点之间的暗区所见。　　双光子显微镜　　双光子显微镜(Two-photonmicroscopy，TPM)是荧光显微镜的一种变体，它使用双光子吸收来激发荧光，而不是单光子激发。在这里，通过吸收两个光子的组合来激发荧光，其能量大约是单个光子激发所需能量的一半。例如，在该方案中，通常由单个蓝色光子激发的荧光团可以被两个近红外光子激发。在TPM中，图像是逐点建立的，就像在共聚焦显微镜中一样，也就是说，双光子激发点在样品上扫描，样品荧光由灵敏的检测器检测。与传统荧光显微镜相比，激发和荧光能量的巨大差异导致了多重优势：首先，它允许使用更长的激发波长，在样品内散射较少，因此穿透更深，以允许在其表面下方对样品进行成像并创建3D样品图像。同时，由于激发能量低得多，光漂白大大减少，这对易碎样品很有用。激发点周围的荧光背景也大大减少，因为有效的双光子吸收仅发生在激发光束的焦点处，因此可以观察到来自样品小部分的荧光(如下图13)。　　TPM的一个缺点是双光子吸收的概率远低于单光子吸收，因此需要高强度照明，如脉冲激光，才能达到实用的荧光信号强度。图13：双光子显微镜。花粉的薄光学切片，显示荧光主要来自外层。　　光片显微镜　　光片显微技术是荧光显微术的一种形式，其中样品被垂直于观察方向的薄“片”光照射，从而仅对样品的薄切片(通常为几微米)进行成像。通过在样品在光片中旋转的同时拍摄一系列图像，可以形成3D图像。这要求样品大部分是透明的，这就是为什么这种技术通常用于形成小型透明生物结构的3D图像，例如细胞、胚胎和生物体。(如下图14)图14：光片显微镜。左：工作原理。右：通过荧光成像用光片显微镜拍摄的小鼠大脑的荧光图像。　　全内反射荧光显微镜　　全内反射荧光(Totalinternal reflectionfluorescence microscopy ，TIRF)是一种荧光显微技术，可通过极薄(约100nm厚)的样品切片制作2D荧光图像。这是通过照明光的渐逝场激发样品的荧光来实现的，当它在两种不同折射率(n)的材料之间的边界处经历全内反射时就会发生这种情况。消逝场具有与照明光相同的波长，但与界面紧密结合。在TIRF显微镜中，激发光通常在载玻片(n=1.52)和样品分散的水介质(n=1.35)之间的界面处发生全内反射。渐逝场的强度随距离呈指数下降来自界面，这样在最终图像中只能观察到靠近界面的荧光团。这也导致来自切片外区域的荧光背景的强烈抑制，这允许拾取微弱的荧光信号，例如在定位单个分子时。这使得TIRF非常适用于观察参与细胞间相互作用的荧光蛋白(如下图15)的微弱信号，但也需要将样品分散在水性介质中，这可能会限制可以测量的样品类型。图15：TIRF图像显示培养的视网膜色素上皮细胞中的蛋白质荧光。每个像素对应67nm。　　膨胀显微镜　　膨胀显微镜背后的基本概念是增加通常需要高分辨率显微镜的样品尺寸，以便可以使用标准显微镜技术(尤其是荧光显微镜)对其进行成像。这适用于保存的标本，例如生物分子、细胞、细菌和组织切片，可以使用下图16中所示的化学过程在所有维度(各向同性)均匀扩展多达50倍。扩展样本可以隔离感兴趣的个别特征通常是隐藏的，可以使它们透明，从而可以对它们的内部进行成像。图16：膨胀显微镜的样品制备。细胞首先被染色，然后连接到聚合物凝胶基质上。然后细胞结构本身被溶解(消化)，使染色的部分随着凝胶各向同性地膨胀，从而使染色的结构更详细地成像。　　光学显微镜中的卷积　　除了使光学系统适应特定用例之外，现代光学显微镜还利用了数字图像处理，例如图像去卷积。该技术通过补偿光学系统本身固有的模糊，可以提高空间分辨率以及光学显微镜拍摄图像的定位精度。这种模糊可以在校准步骤中测量，然后可以用于对图像进行去卷积，从而减少模糊。通过将高性能光学元件与先进的图像处理相结合，数字显微镜可以突破分辨率的极限，以更深入地观察微观世界。(如下图17)图17：图像解卷积。左：原始荧光图像。右：解卷积后的图像，显示细节增加。　　光学显微镜与电子显微镜　　光学显微术通常使用可见光谱中的光波长，由于瑞利准则，其空间分辨率固有地限制为所用波长的大约一半(最多约为200nm)。然而，即使使用具有高NA和高级图像处理的物镜，也无法克服这一基本限制。相反，观察较小的结构需要使用较短波长的电磁辐射。这是电子显微镜的基本原理，其中使用电子而不是可见光照亮样品。电子具有比可见光短得多的相关波长，因此可以实现高达10000000倍的放大倍数，甚至可以分辨单个原子。(如下图18)　　图18：同心聚合物结构中纳米晶体放大15000倍的扫描电子显微镜图像，即使是细微的细节，例如基材的孔隙，也能分辨出来。　　总结与结论　　光学显微镜是一种强大的工具，可用于检查各种应用中的小样本。通过调整用于特定用例的照明和成像技术，可以获得高分辨率图像，从而深入了解样品中的微观结构和过程。文中，我们讨论了各种光学显微镜技术的特点、优势和劣势，这些技术在光线照射和收集方式上有所不同。显微镜种类优点技术限制典型应用亮视野显微镜结构相对简单，光学元件很少低对比度、完全透明的物体不能直接成像，可能需要染色对彩色或染色样品和部分透明材料进行成像暗视野显微镜显示小结构和表面粗糙度，允许对未染色样品进行成像所需的高照明功率会损坏样品，只能看到散射图像特征细胞内颗粒成像，表面检测相差显微镜实现透明样品的成像复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗跟踪细胞运动，成像幼虫微分干涉对比显微镜比PCM更高的分辨率复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗活的、未染色的细胞和纳米颗粒的高分辨率成像偏光显微镜来自样品非双折射区域的强背景抑制，允许测量样品厚度和双折射需要双折射样品成像胶原蛋白，揭示晶体中的晶界荧光显微镜允许挑出样品中的单个荧光团和特定的感兴趣区域，可以克服分辨率限制需要荧光样品和灵敏的检测器，光漂白会减弱信号成像细胞成分、单分子、蛋白质免疫荧光显微镜使用抗体靶向可视化特定的生物分子大量样品制备，需要荧光样品，光漂白识别和跟踪细胞和蛋白质共聚焦显微镜低背景信号，可以创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统3D细胞成像，荧光信号较弱的成像样品，表面分析双光子显微镜样品穿透深度、背景信号低、光漂白少成像速度慢，需要复杂的光学系统和大功率照明神经科学，深层组织成像光片显微镜图像仅样品的极薄切片，可通过旋转样品创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统细胞和生物体的3D成像全内反射荧光显微镜强大的背景抑制，极精细的垂直切片成像仅限于样品的薄区域，需要复杂的光学系统，样品需要在水介质中单分子成像，成像分子运输膨胀显微镜提高标准荧光显微镜的有效分辨率需要对样品进行化学处理，不适用于活体样品生物样品的高分辨率成像　　参考：　　1. Rochow TG, Tucker PA. A Brief History of Microscopy. In: Introduction to Microscopy by Means of Light, Electrons, X Rays, or Acoustics. Springer US 1994:1-21. doi:10.1007/978-1-4899-1513-9_1　　2. Smith WJ. Modern Optical Engineering: The Design of Optical Systems.

成果名称 光子力显微镜研制 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 成果成熟度 &radic 研发阶段 □原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 无接触高空间分辨扫描探测微米尺度物质的几何与力学性质（如刚度、应变、弹性、粘性，作用势，作用力等）一直是科学工作者期望的目标。以光镊束缚和操控的纳米小球为探针，结合高精度的散射光干涉位置探测技术，可构成一种成新型扫描探针显微镜，即光子力显微镜。 2009年，北京大学信息科学技术学院叶安培教授申请的&ldquo 光子力显微镜关键技术研究&rdquo 项目获得首届&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金支持，通过大量关键部件，如显微镜镜头、光学扫描振镜、光电二极管、数据采集卡等的购置，使得叶安培教授这一国际先进关键技术的前期探索研究得以及时启动和顺利开展。 叶安培教授课题组已开展了多项光子力显微镜研制中的关键技术研发，包括：（1）高稳定囚禁探针粒子的激光光源的研制；（2）实时精确测量纳米探针粒子三维位置的高灵敏光电位置探测器的研制；（3）亚皮牛顿（＜10-12 N）力的精度测量；（4）对光阱力标定与探针粒子受力的三维图像显示的应用系统软件的开发。 应用前景： 该技术具有纳米精度的空间分辨，能以亚皮牛量级的作用力解析度和微秒量级的时间解析度进行动态实时观测，探测微环境的二维甚至内部三维结构。该技术仅有欧洲个别实验室刚刚开始研究，尚没有商品化产品，国内类似的研究尚未开始。

扫描电子显微镜，作为实验室必备工具，其功能如同照相机一样，让我们清晰的观察到材料的微观形貌，放大的尺度可以达到微米级甚至是纳米级别。扫描电子显微镜原理图一 扫描电子显微镜图片（左）和EDX图片（右）扫描电子显微镜的原理是利用电子束轰击样品产生二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光等信号，这些信号会被不同功能的探头分别接收，成像得到相对应的图片。比如二次电子信号获得的图片是材料的微观形貌，这个图像是灰度图，如图一（左）。特征X射线的图片则反应了材料的成分表征，但这个图片相比于二次电子形貌图，它是一张彩色图片，如图一（右）。由于扫描显微图片是二维的，是无法直观的获得Z方向的高度值。但样品表面的实际形貌是三维的，或许获得一个三维图像，可以更加准确的得到真实形貌。我们测试一个铝合金的断口，利用Hitachi Map 3D和SU5000的五分割BSE探头的外环四象限，分别获取图片并最终形成一张三维图片，再获取EDX的成分表征结果，两者叠加，可以得到一张彩色的三维形貌成分图，如图二所示。不仅可以在X，Y，Z方向准确的观察样品材料，同时获得三维成分信息分布的情况。图二 3D形貌EDX图片日立多功能自动化热场扫描电子显微镜SU5000，不仅配置有多个高性能探头，还可以对其增加多种扩展附件及软件，如EDS，EBSD，拉伸台，压缩台，加热台，制冷台，冷冻传输，真空转移，纳米操作手等，也可以进行光镜与电镜联用，原子力显微镜联用，拉曼联用， 3view超薄切片等，甚至可以多附件的联合使用，真正实现了一机多能。图三 SU5000及5分割BSE探头公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

日本研究人员日前利用新开发的显微镜，首次在世界上观测到了活细胞内的线粒体等非常微小的器官。 　　日本原子能研究开发机构和奈良女子大学研究人员说，他们联合开发出的新型显微镜称为“激光等离子体软X线显微镜”，它利用了波长比紫外线短但是比X射线长的电磁波“软X线”，无需使用荧光物质，就能观测到90纳米(1纳米是十亿分之一米)的微小结构。 　　原理上，光学显微镜的清晰度最多只能达到数百纳米，无法观察到制造细胞活动所需能量的线粒体，电子显微镜虽然清晰度高，但只能观察脱水干燥的死细胞。“软X线”具有难以被水吸收的特征，可以观察带水分的活细胞。 　　研究人员向金箔表面发射高强度激光产生等离子体，制造出“软X线”。然后将“软X线”照射感光材料上培养的细胞0.6纳秒(一纳秒是十亿分之一秒)，就拍摄下了线粒体。 　　新研究成果将于8月21日在美国举行的一个国际研讨会上正式发表。日本原子能研究开发机构研究员加道雅孝说，这是一款能够看到细胞内部变化的“梦幻显微镜”，有望应用于癌症研究等领域。

生命科学是从微观层面观察和研究生命过程，从而揭示生命的物质基础和基本现象。显微成像是观察微小物体的重要手段，但其分辨能力受光学成像系统的限制（即衍射极限），无法满足现代生命科学研究要求的更高解析度、更准确的成像需求。熵智科技作为中国原创3D视觉创业公司第一梯队，横跨机器视觉与微纳光学两大领域，深刻认识到微纳光学在生命科学研究领域中的巨大价值。9月23日，熵智科技在西安发布自研的超分辨及共聚焦显微成像分析系统。该系统易用、性价比高，相较于国内外显微成像产品，不仅突破了光学成像系统的限制，轻松实现纳米尺度的2D/3D动态图像解析能力，还将共聚焦+超分辨+后处理分析完美融合，软件结合场景模块化。无论新手用户还是专家用户，只需通过一套界面即可获取一流的超高分辨率图像及分析结果。熵智科技超分辨及共聚焦显微成像分析系统工作原理超分辨显微成像分析系统采用结构光照明显微成像术（英文Structured Illumination Microscopy, 简称SIM），突破传统显微镜的阿贝衍射极限，实现生物组织、细胞、神经元等活动样本的快速超分辨率成像，为生命科学、生物工程等领域提供创新的超分辨率成像技术产品，几乎可集成于任何荧光显微镜。共聚焦显微成像分析系统的软硬件均采用模块化设计，硬件集成SIM超分辨模块、软件支持多种后处理功能，从而提供精确的2D/3D成像，以及动态过程的成像。目前，共聚焦和超分辨光路共用了光源准直部分、物镜部分、聚焦成像部分。主要功能超分辨及共聚焦显微成像分析系统视野超10倍扩展，达1mm，拥有精确的多微细胞结构生物显微影像分析功能，实现双光路同时，宽场、共聚焦、超分辨三种模式自由切换。大视野拼图：多种不同的图像获取方式、可实现500um*500um视场上图片进行拼接。图像增强及处理：可对采集到荧光图像进行增益调节、对比度调节、亮度调节以及色阶调节。反卷积处理：在原有采集到图像基础上，对图像数据做实时清晰度优化，达到消除背景噪声，有用信息表达更精准的作用，处理速度10ms以下，速度快；可进一步结合DNN方法，提高应用场景的鲁棒性。特征统计分析：对于识别出的细胞，对其强度、直径、周长等15个属性做数值量化。特征标记分类：可对细胞的特征进行标记和分类。单细胞定量分析：可以准确分割出相互重叠的细胞，精度更高，在专业单细胞识别的基础上，结合深度学习AI算法，可以精确识别互相挤压重叠的细胞核，而且对于细胞轮廓边界识别更加准确。亚细胞结构分析：可以定位某种蛋白或者某个基因表达产物在细胞的具体存在部位，如细胞核，胞浆内，结合AI图像分析方法，以表格和数据统计输出结果。细胞亚群圈选分析：筛选特定的感兴趣细胞亚群，进行了10余种参数分析。特殊细胞/结构识别：提供特殊细胞如脂肪细胞的识别和数量统计。多重荧光染色：实现细胞核、细胞质、细胞膜的各种形态和染色，精确寻找目的细胞及其结构。细胞寻找及跟踪：实现特定细胞的动态识别和跟踪。核心参数激光共聚焦超分辨显微参数配置普通光纤激光器激光405nm、488nm、561nm、640nm扩展HC-PCF激光器920nm探测器 PMT3个；波长：400-750nm，GaAsP最大拍摄速度8fps@512×512像素；2fps@1024×1024像素；4096×4096最高；更多可配置；扫描方式X-Y, X-Y-Z, X-Y-T分辨率250nm in x, y and 550nm in z 共聚焦120 nm in x, y and 320nm in z (488nm wavelength) 超分辨共焦视场Φ18mm-Φ25mm 内接正方形成像深度100μm灵敏度提升4倍相对信噪比 SNR优良级 50dB显微镜电动显微镜奥林巴斯 倒置IX73显微镜，具备明场、微分干涉、荧光等观察方式物镜奥林巴斯或Mitutoyo平场复消色差物镜（防腐蚀陶瓷表面以及红外色差矫正）选型载物台奥林巴斯 电动IX3-SSU 扫描精度优于0.7μm光学放大1.0X；1.5X；3.2X；20X 适配/转换器共聚焦/超分辨率光路切换（电动）、6位电动物镜转换器荧光装置配荧光光阑*相机（lattice）SCMOS，分辨率2048×2048，100fps@全幅面，位深12bit工作站Windows10 Pro 64 bit；硬盘≥1TB；内存16GB软件控制软件：图像采集及2D/3D/4D处理；共聚焦和超分辨配置；*成像分析：细胞自动识别、单细胞定量分析、亚细胞结构分析、细胞亚群圈选分析等防震台频率范围（5～30Hz）：≤30μm/s均方根；频率范围（＞30Hz）： ≤60μm/s均方根增配双光子成像激光生成组件、高速扫描头、前置补偿单元应用场景超分辨及共聚焦显微成像分析系统可应用于基础生物学、临床医学、病毒学、精准药物筛选等领域，为活细胞超分辨率智能成像提供解决方案。基础生物学：皮肤病例研究、类器官培养观察、微生物形态研究、胚胎发育成像、组织结构三维重构。如通过斑马鱼胚胎发育过程的成像，研究血管疾病和血管药物的新兴模型，从而更好解决人类血管疾病；通过光学切片, 确定其复杂的内部结构与组织功能之间的关系。临床医学：细胞形态结构鉴定、病理显微成像、异常细胞跟踪检测、组织形态学观察。利用计算机进行图像处理, 不仅可观察固定的细胞、组织切片, 还可对活细胞的结构、分子等进行实时动态观察和检测。通过它可以直接观测细胞形态学的组织、细胞之间的相互作用、组织微环境、伤口的愈合等成像，有助于了解病理机制，以开发疾病治疗方法从而促进人体健康有重要的意义。病毒学：植物病毒研究、动物病毒研究、医学病毒研究、环境病毒研究、噬菌体研究。采用超分辨技术，可以实现病毒感染细胞及复制、组装、释放等动态过程的研究。药物筛选：药材显微鉴别、载药微粒结构、药物扩散跟踪、制药成型和释药研究、药理药效研究。通过药物筛选确定干预的潜在治疗方法，加速早期药物的研发和确定疾病的模型。利用显微镜观察植（动）物药材内部的细胞、 组织构造，从而达到鉴定药材的目的。选择合适的药物靶分子，针对高分辨率成像的固定样品及活细胞进行分析，从而满足不同实验的需求。关于熵智科技熵智科技是国家级高新技术企业，拥有底层成像系统和算法开发能力，软硬件一体化，致力于通过高性能的成像技术解决机器人柔性化、微纳级检测与测量等问题。熵智科技自2018年成立至今，先后获得字节跳动、拓金资本、松禾资本、远望资本、华控资本等投资。深圳、武汉、西安三地联合办公，目前研发和工程团队70余人，核心技术人员均硕士及以上学历，博士6人。未来，熵智科技将继续深耕微纳光学领域，以更优的产品与服务回馈广大合作伙伴及客户。

原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）是一种具有原子级别高分辨率的新型表面分析仪器，它不但能像扫描隧道显微镜（STM）那样观察导体和半导体材料的表面现象，而且能用来观察诸如玻璃、陶瓷等非导体表面的微观结构，还可以在气体、水和油中无损伤地直接观察物体，大大地拓展了显微技术在生命科学、物理、化学、材料科学和表面科学等领域中的应用，具有广阔的应用前景。1 原子力显微镜的工作原理1.1 基本原理AFM 进行表面分析的基本原理如下：AFM 中有一由氮化硅片或硅片制成的对微弱力极敏感的弹性臂，微悬臂顶端有一硅或碳纳米管等材料制成的微小针尖，控制这一针尖，使其扫描待测样品的表面，这一过程是由压电陶瓷三维扫描器驱动的。当针尖与样品表面原子做相对运动时，作用在样品与针尖之间的力会使微悬臂发生一定量的形变。通过光学或电学的方法检测微悬臂的形变，转化成为图像输出，即可用于样品表面分析。简单地说，原子力显微镜是通过分析样品表面与一个微弱力敏感元件之间的相互作用力来呈现材料表面结构的。1.2 工作模式（一）接触工作模式扫描时如果控制针尖一直与样品表面原子或分子接触，那么这种工作模式称为接触模式。在这一过程中，针尖原子与样品表面原子之间力的作用主要表现为是两者相接触原子间的互斥力（大小约为10-8-10-11 N）。接触模式下工作的原子力显微镜可得到稳定的、高分辨率的样品表面图像。但是这种工作模式也有它的不足之处：当研究易变形的样品（液体样品）、生物大分子等的时候，由于针尖与样品原子直接接触，会使样品表面的原子移动、粘附于针尖或者发生较大形变，从而造成样品损坏、污染针尖或者结果中出现假象。（二）非接触工作模式扫描时如果控制针尖一直不与样品表面的原子或分子接触，那么这种工作模式称为非接触模式。非接触工作模式下由于扫描样品时针尖始终在样品上方5-20 nm 距离范围内，针尖与样品间的距离较接触模式远，所以获得的样品表面图像分辨率相对接触模式较低。但正是这一距离也克服了接触模式的不足之处，不再会造成样品的损坏、针尖污染等问题，灵敏度也提高了。（三）间歇接触工作模式扫描时如果控制针尖间歇性的与样品表面的原子或分子接触，那么这种工作模式称为间歇接触模式，也称为轻敲模式，常通过振动来实现针尖与样品的间歇性接触。该模式下微悬臂的振动是由磁线圈产生的交流磁场直接激发的，针尖与样品表面原子作用力主要是垂直方向的，不再受横向力的影响。间歇接触工作模式集合了接触与非接触模式的优点，既减少了剪切力对样品表面的破坏，又适用于柔软的样品表面成像，因此特别适合于生物样品研究。2 原子力显微镜的组成AFM 的硬件系统由力检测部分、位置检测部分和反馈控制系统三部分组成。图1 所示为AFM 的工作原理图，从图中可以看出，AFM 就是通过集合以上三个系统来将样品的表面特性反映出来的：在AFM的工作系统中，使用由微小悬臂和针尖组成的力检测部分来感应样品与针尖间的作用力；当微悬臂受力形变时，照射在微悬臂末端的激光会发生一定程度的偏移，此偏移量反射到激光检测器的同时也会将信号传递给反馈控制系统；反馈控制系统根据接受的调节信号调节压电陶瓷三维扫描器的位置，最终通过显示系统将样品表面的形貌特征以图像的形式呈现出来。3 样品制备3.1 样品要求原子力显微镜研究对象可以是有机固体、聚合物以及生物大分子等，样品的载体选择范围很大，包括云母片、玻璃片、石墨、抛光硅片、二氧化硅和某些生物膜等，其中最常用的是新剥离的云母片，主要原因是其非常平整且容易处理。而抛光硅片最好要用浓硫酸与30%双氧水的7∶3 混合液在90 ℃下煮1h。利用电性能测试时需要导电性能良好的载体，如石墨或镀有金属的基片。试样的厚度，包括试样台的厚度，最大为10 mm。如果试样过重，有时会影响Scanner的动作，请不要放过重的试样。试样的大小以不大于试样台的大小（直径20 mm）为大致的标准。稍微大一点也没问题。但是，最大值约为40 mm。如果未固定好就进行测量可能产生移位。请固定好后再测定。3.2 样品制备粉末样品的制备：粉末样品的制备常用的是胶纸法，先把两面胶纸粘贴在样品座上，然后把粉末撒到胶纸上，吹去为粘贴在胶纸上的多余粉末即可。块状样品的制备：玻璃、陶瓷及晶体等固体样品需要抛光，注意固体样品表面的粗糙度。液体样品的制备：液体样品的浓度不能太高，否则粒子团聚会损伤针尖。（纳米颗粒：纳米粉末分散到溶剂中，越稀越好，然后涂于云母片或硅片上，手动滴涂或用旋涂机旋涂均可，并自然晾干）。4 原子力显微镜的应用4.1 在材料科学及化学中的应用目前，AFM 在材料科学中主要应用于材料的表面结构、表面重构现象以及表面的动态过程（例如扩散现象）等方面的研究，表面科学的中心内容是研究晶体表面的原子结构，例如从理论上推算出的金属表面结构往往不如实际复杂，借助原子力显微镜可以直观地观察材料的表面重构现象，有助于理论的进一步完善。4.1.1 在探测材料样貌方面的应用利用原子力显微镜来观测材料的样貌进行成像的时候，材料与探针之间出现相应作用力改变能够很好的反映出材料表面的三维图像。可以通过数值分析出材料表面的高低起伏情况，因此，在利用原子力显微镜对材料进行图像分析的时候，可以有效地发现材料表面的颗粒程度、粗糙程度、孔径分布以及孔的结构等。可以利用这种成像的方式把材料表面的情况形成三维图像进行模拟显示，促使形成的图像更加利于人们观察。4.1.2 在粉体材料中的应用在对粉体材料进行分析和研究的时候，可以利用原子力显微镜来逐渐分析原子或者分子中尺度，从而保证可以准确观测晶体以及非晶体的位置、形态、缺陷、聚能、空位以及不同力之间的相互作用。一般来说，粉体材料基本上都是使用在工业中的，但是现阶段有关于检测粉体材料的方法还是十分少的，研制样品也相对比较困难。原子力显微镜实际上是一种新兴的检测方式，具有操作方便、制样简单等特点。很多专家学者认为，人们使用化学方式研制出了SnS粉末，利用原子力显微镜把涂在硅基板上的材料进行成像，从图像上我们很容易发现此类材料具有分布均匀的特点，每一个大约15nm。4.1.3 在晶体材料中的应用专家学者经过不断研究和分析得到了很多晶体生长的模型，但是经过更加深入的分析和研究发现这些理论模型和实际情况是否相同还是具有一定差异，也逐渐成为学者讨论和研究的重点，所以人们希望通过显微镜来监测和观察生长过程。虽然，使用传统的显微镜已经观测出一定的成果，但是由于这些光学显微镜、激光全息干涉技术等存在分辨率不是十分高、实验条件不是很好以及放大不足等问题，使得研究过程出现很大困难，导致不能观测纳米级的分子等。原子力显微镜的发展，为科学家们研究纳米级分子或者原子提供了依据，也成为了专业人士研究晶体过程的重要方式。利用这种显微镜具有的能够在溶液中观察以及高分辨率等特点，可以保证科学家们能够很好的观测到晶体生长过程中的纳米级图像，从而不断分析和掌握材料的情况。4.2 在生物学中的应用AFM 能在气体、液体中无损伤地直接观察物体，可对生物分子在近生理条件下进行检测，是生命科学研究中的有力工具。目前，在生命科学中AFM 主要应用于对细胞、病毒、核酸、蛋白质等生物大分子的三维结构和动态结构信息进行研究。4.2.1 对细胞膜表面形态的研究细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。AFM 能够观察到细胞膜表面的超微结构，因此它可以用来观察正常细胞与病变细胞的细胞膜，发现两者的异同，为临床病理诊断提供新的视角和方法。4.2.2 测定细胞弹性以及力学性质病变这一生理过程与细胞的形态和力学性质有关。细胞形态学的变化会影响和反映细胞性质、功能以及细胞微环境的改变。健康细胞与病理状态的细胞在机械性能上是完全不同的。抓住这一点，可以利用AFM 测量出的细胞弹性性质识别癌细胞，以及辅助诊断红细胞相关的各种疾病等，从细胞层面上对各种疾病进行早期诊断和治疗。4.2.3 检测活细胞间相互作用AFM 也可以对细胞间的相互作用进行观察。将一种细胞连接在AFM 扫面探针的尖端，使针尖功能化，对另一种单层排列的细胞进行扫描就可以进行细胞间相互作用的研究。4.2.4 观察动态生物过程AFM也是观察细胞生物过程非常有效的工具。研究痘病毒和活细胞，得到了痘病毒感染活细胞全过程的AFM 图。通过活着的细胞观察子代病毒颗粒，并用AFM 在水溶液环境中在分子水平分辩出有规则重复的烙铁状结构和准有序的环状结构。观察中发现: 在感染前后最初几小时，细胞并无显著变化 子代病毒粒子沿细胞骨架进入细胞内部，还有胞吐、病毒颗粒聚集等现象。通过AFM 图像可以看出哑铃状小泡逐渐形成、消失并在细胞膜表面形成凹陷的全过程。4.2.5 观察生物大分子之间相互作用在生物体内，DNA 与蛋白质间的相互作用有着同样举足轻重的地位。在转录、翻译的过程中，DNA 与特定的蛋白质如解旋酶、聚合酶、启动因子等的结合就决定着生命活动的开启。Gilmore 等利用AFM 以每500 ms 拍摄1 次的速度，清晰地观察到了蛋白质在DNA 上的结合情况。因此，AFM 可以真正帮助我们深入地“看到”生命活动的本质。4.2.6 测定细胞电学性质细胞不论在静止状态还是活动状态，都会产生与生命状态密切相关的、有规律的电现象，生物电信号包括静息电位和动作电位，其本质是离子的跨膜流动。因此，研究细胞的电生理学也成为了生命科学领域一个重要的分支。在AFM 系统中增加了导电模块，在迎春花细胞、酵母菌细胞等样品和探针之间加一个偏压，在扫描的过程中，同时获得样品的表面形貌和电流像，且在成像的同时检测探针和细胞样品之间的电流，得到样品表面形貌和局域电流分布及两者之间的对应关系，从而实现AFM 在纳米尺度上对细胞样品电学特性的分析检测。参考文献[1]高翔.原子力显微镜在材料成像中的应用[J].化工管理,2015(08):67.[2]王明友,王卓群,焦丽君.原子力显微镜在表面分析中的应用[J].邢台职业技术学院学报,2015,32(01):75-78.[3]万旻亿.原子力显微镜的核心技术与应用[J].科技资讯,2016,14(35):240-241.[4]鞠安,蒋雯,许阳,杨升,常宁,王鹏,顾宁.原子力显微镜在生命科学领域研究中的应用进展[J].东南大学学报(医学版),2015,34(05):807-812.

来自美国霍华德休斯医学研究所，Janelia研究园的科学家们，借助其发展的新光学超分辨率成像技术，在前所未有的高分辨率条件下研究了活体细胞 内的动态生物过程。他们的新方法显著的提高了结构光照明显微镜(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率， 一种最适合活体超分辨成像的技术。 　　 　　新技术所拍摄的视频生动地展现了细胞内蛋白质的运动和相互作用。它们帮助生物学家理解细胞是怎样改变它们之间的依存结构，以及重整细胞膜结构使得细胞 外的分子可以被吸收到细胞内。来自Janelia研究园的研究员EricBetzig博士，李栋博士后*和他们的同事们基于原有的SIM显微镜原理新发展 了两种新的超分辨率成像技术。超分辨率光学显微成像技术能够跨越理论的分辨率极限，在极高的分辨率下展现细胞内的精细结构。但是，到目前为止，超分辨率显 微镜技术却依然不能进行有效的活体细胞成像。 　　“这些方法设立了超分辨率光学显微镜的成像速度和非侵入特性的新标准，它们使得超分辨率活体细胞成像成为现实。”Betzig博士说道。在传统的 SIM显微镜中，物镜下的物体被非均匀的结构光(类似于条纹码)所照明。在实验中，几束不同的结构光用来照明物体，它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔 条纹被相机依次采集。然后计算机提取摩尔条纹编码的信息并将其解码生成三维的高分辨率图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨 率。 　　Betzig博士和其他两位科学家因为发展超分辨率荧光显微镜而被授予2014年诺贝尔化学奖。他说道，SIM显微镜技术之所以没有得到像其它方法那 样多的关注，是因为其它技术能够提供比两倍更高的分辨率改进效果。但是，他强调SIM拥有两大其它的超分辨率方法所没有的优势。这些其它方法包括了两种去 年获得诺贝尔奖表彰的技术：他和同事HaraldHess博士于2006年开发的光激活定位显微镜 (photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激辐射耗尽 (stimulatedemissiondepletion，STED)显微镜。但是，这两种技术都需要过多或过强的光来照明样品，以至于荧光蛋白很快被 漂白，细胞样品很快被损害，从而不可能长时间进行成像。然而，SIM在这些方面不一样，“我爱上了SIM，因为它的速度很快，而且它所需的照明光强度远远 小于其它方法。”Betzig博士说道。 　　Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久开始与SIM相关的研究。Gustafsson博士是SIM技术的先驱之 一，生前也是Janelia的研究员。Betzig博士那时已经深信SIM有潜力为解析细胞内部的工作机理提供重要的见解，如果SIM的空间分辨率可以被 提高，它对于生物研究的可用性将被大大增强。 　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego发展了一种利用饱和耗尽(saturateddepletion)的非线性SIM技 术，但这种技术在改进分辨率的同时需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的优势。Betzig博士想到了一种可以避免这些缺陷的方法。 　　饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开关过程中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生图像的过程是，首先把所有的荧光蛋白分子激活到 可发光的状态(亮态)，然后用一束结构光把大部份的亮态分子反激活到暗态。通过结构光反激活之后，仅有少数处于结构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些 光调控过程提供了物体的高空间频率信息，从而让图像更加清晰。这一过程需要重复25或更多次才能产生最终的高分辨率图像。Betzig博士说道，这一原理 非常类似于STED或另一种与其相关的叫做RESOLFT的超分辨率技术的原理。 　　这一技术并不适合于活体成像，因为激活和反激活荧光蛋白需要很长的时间。另外，反复的光照明会对细胞和荧光蛋白本身造成损伤。Betzig博士说道， “这一技术的问题在于你首先用光激活了所有的荧光蛋白分子，然后你马上又用另一束光反激活了大部份分子。这些被反激活的分子对最终的图像没有任何贡献，但 却被你用光“油炸”了两次。你让分子承受了很大“压力”，并且花了很多你并没有的时间，因为这段时间内细胞在运动。” 　　解决方法其实很简单，Betzig博士说道：“没有必要激活所有的分子。”在Betzig研究小组新发展的结构光激活非线性SIM的技术中，一开始用 结构光只激活样品里的一部分荧光蛋白分子。“这一结构光激活过程已经给你一些高分辨率的信息了。”Betzig博士解释道。另外一束结构光用于反激活分 子，额外的信息可以在反激活的过程中同时被读出。两个结构光叠加的效应给与最终图像62纳米的分辨率，这一结果好于原始的SIM，并且把由光波长决定的传 统分辨率极限改进了三倍。 　　“我们能够做到快速地超高分辨率成像。”Betzig博士说道。这很重要，他补充道，因为对于动态过程，单纯提高空间分辨率而没有相应地提高成像速度 是没有意义的。“如果细胞内部有的结构以1微米每秒的速度运动，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒内采集图像。但如果我有1/10微米的分辨率， 那么我就必需在1/10秒内采集图像，不然图像将变得模糊。”Betzig博士解释道。 　　结构光激活非线性SIM可在1/3秒内采集25幅原始图像，并从中重建出一幅高分辨率图像。它的图像采集很高效，只需用较低的照明光强，并且收集每一 个亮态荧光蛋白分子所携带的信息。从而有效地保护了荧光分子，使得显微镜能够进行更长时间的成像，让科学家们可以观测到更多的动态活动。 　　Betzig博士的团队利用结构光激活非线性SIM获得了在细胞运动和改变形状的过程中骨架蛋白的解体和自身再组装过程，以及在细胞膜表面的叫做caveolae的微小内吞体动态过程的影像。 　　在Science论文里，Betzig博士的团队也利用了已经商业化的高数值孔径物镜将传统SIM的空间分辨率提高到84纳米。高数值孔径限制了被光 照明的样品范围，从而降低了光对细胞以及荧光蛋白分子的损伤。这一方法可以同时对多个颜色通道进行成像，使得科学家们可以同时跟踪几种不同蛋白质的活动。 　　通过高数值孔径的方法，Betzig博士的团队观测了多个骨架蛋白质在形成粘着斑(链接细胞内外的物理链)过程中的运动和相互作用。他们也追踪了 clathrin修饰的内吞体的成长和内吞过程(内吞体将细胞外的分子转移到细胞内)。他们的定量分析回答了几个不能被以往的成像技术所解决的问题，例 如，内吞体的分布，以及内吞体尺寸和寿命之间的关系。最后，通过结合高数值孔径方法和结构光激活非线性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨 率条件同时追踪两种蛋白质的活动。 　　Betzig博士的团队在进一步提高他们的SIM技术。他们也急切地盼望和生物学家一起探索潜在的应用并进一步改进这一技术的可用性。 　　现在，科学家们可以通过现在，科学家们可以通过JaneliaJanelia的高级成像中心利用这些新的的高级成像中心利用这些新的SIMSIM技 术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，技术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，BetzigBetzig博士说道， 使得博士说道，使得SIMSIM成为能够被其他实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”成为能够被其他 实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”

想象你的一生只能在看见黑色和白色的世界中度过，然后第一次看见一瓶彩色的玫瑰花。这便是利用电子显微镜首次拍摄下细胞多色彩照片的科学家拥有的感觉。　　电子显微镜可将一个物体放大到1000万倍，从而使研究人员得以窥视细胞或蝇眼的内部工作原理。但迄今为止，他们看到的只有白色和黑色图像。最新进展利用了 3种被称为镧系元素的不同稀土金属。它们被分层叠放在显微镜载片上的细胞上方。显微镜能探测到每种金属何时失去电子并且用人工色素记录下每一次过程。迄今为止，研究人员仅能产生3种颜色——红色、绿色和黄色。他们在日前出版的《细胞化学生物学》杂志网络版上报告了这一成果。　　不过，这种利用不同颜色的能力创造了灰度图像无法实现的鲜明对比。比如，该团队能更详细地看见一连串蛋白挤过细胞膜，而这是科学家此前从未做到的。随着进行更多微调并加入金属离子，研究人员希望再添加三四种其他颜色并且改善图像的分辨率。

显微镜是生物实验室中必备的设备，但显微镜的类型和配置众多，需求和配置如何相互对应？又该如何去选择适合自己实验室的显微镜？让我们跟随深蓝云一起，看看显微拍摄的设备需求吧。问题1:我经常需要观察细胞，应该用什么样的显微镜？回答：细胞种类众多，但是大多数活细胞观察时都是未染色细胞。未染色的细胞为透明状态，普通明场显微镜观察不到，这种情况下，需要使用相差的观察方式。相差模式将光波通过细胞折射率和厚度不同的各部细微结构产生的相位变化变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。问题2：我们课题组即需要对病理切片进行观察，也需要对培养的细胞进行观察，这两种方式需要什么样的设备？回答：切片类型的样本建议采用正置观察方式，即物镜位于载物台上部，而细胞一般放置于培养瓶、培养皿中，所需要的空间更大，更适合使用倒置观察方式。因此对常规显微镜就需要一台正置显微镜、一台倒置显微镜。不过ECHO正倒置一体显微镜，既可以正置也可以倒置，一台就可以满足两种需求啦。问题3：既需要明场拍摄也需要荧光拍摄需要怎么选？回答：▲荧光产生原理图▲ 荧光光路示意图单色相机拥有更高的灵敏度以及光通量，而彩色相机拥有更好的对比度和色彩还原能力。荧光观察时需要用特定波长的激发光激发材料产生荧光，并通过滤色片最终得到特定波长的荧光，而这种荧光一般较弱，观察时需要高灵敏度的相机，因此配置采用单色相机。单色相机无法识别真实颜色，不适合进行明场拍摄，因为明场拍摄需要更好的对比度，彩色相机才可以满足此需求。如果想获得最好的荧光与明场观察效果，最佳的选择是搭配双相机系统。这里说一下哦，ECHO正倒置一体显微镜突破了常规显微镜的设计，同时配置了双相机系统，自动切换，保证无论明场还是荧光都可以获得最佳的观察效果，同时满足您的多种需求。问题4：市面上荧光显微镜的光源多种多样，我该选择哪种？回答：大多数荧光显微镜的光源波长需求都在可见光范围内，在这个范围内，LED光源要明显优于其他光源，其在不同波长范围可以做到光强一致，且寿命更长，无需预热和冷却，作为冷光源，其可以做到随开随用，且光毒性低，适合大多数实验室配置。问题5：可供选择的荧光通道那么多，我该如何选择荧光通道？回答：对于荧光通道的选择，需要根据用户想要观察的荧光波长来进行确定，如用户后续需要DAPI染色，需要进行GFP蛋白的观察，这些观察都有其对应的荧光波长范围，符合该波长范围的荧光通道就可以选择，如DAPI通道，FITC通道。问题6：物镜该如何选择？荧光观察配置什么物镜？回答：▲ 物镜物镜的分类方式很多，这里先说一个根据色差校正进行的分类，色差校正能力由高到低分别是复消色差显微镜，半复消色差显微镜（萤石物镜），消色差物镜，消色差能力越强，带来的最直观提升是NA值越高，因此分辨率更好。半复消色差物镜的校正范围为400-500，是常见荧光发射光的波段，适合进行荧光观察，因此对于荧光显微镜，一般配置半复消色差物镜。以上是一些关于如何选择和配置显微镜的常见问题，后续我们还会更新一些更加深入的信息。部分图源：来自网络，侵删。

成果名称 超小型在体荧光显微镜系统的研制 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 成果成熟度 □研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 荧光显微镜技术是生物学和医学的重要研究手段，随着生物技术中荧光分子标记物的大量涌现，荧光显微镜技术在观察细胞活动方面日益显现出重要的作用。然而，传统意义上荧光显微镜是一种大尺寸和高费用的设备，很难实现对自由活动动物进行大脑神经活动成像研究，这大大制约了科学家对生物科学的中心问题&mdash &mdash &ldquo 行为的神经环路基础&rdquo 进行深入研究的可能。 北京大学生命科学学院张晨课题组运用微集成技术结合神经科学、微光学和半导体光电学等技术，研制了一种具有完全自主知识产权的可用于自由活动动物的&ldquo 超小型在体荧光显微镜系统&rdquo ，实现了在单个神经细胞分辨率水平高速追踪神经传导，并对清醒、自由运动的动物进行大脑神经环路活动实时探测的功能，从而使得对动物自由行为时大脑神经网络的研究成为可能。这项工作获得了第四期&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金的支持。在基金的有力支持下，申请人完成了关键配件的购置和重要材料的加工，其工作得以顺利开展，克服了镜体小型化、CMOS芯片和光学胶合病毒粒子的封装等关键技术瓶颈，取得了良好的成果。目前该项目已顺利结题，并有多项专利申请，其成果获得第七届北京大学实验技术成果一等奖，相关工作处于产业化进程中。 应用前景： 荧光显微镜技术是生物学和医学的重要研究手段，随着生物技术中荧光分子标记物的大量涌现，荧光显微镜技术在观察细胞活动方面日益显现出重要的作用，应用前景广阔。

温故知新，从历史刊物文章中学习早期电镜产品技术历程，以下内容摘自《Popular Electronics》1959年11月刊（Vol. 11, No. 5），文章题目“The Amazing Electron Microscope”，作者Morris M. Rubin。（由“RF Cafe”网收录）光学显微镜的分辨率受到光波长的限制。天文学家William Dawes首先提出了一种量化的方法，这种方法基于视觉上分辨距离较近的恒星的能力。被称为道斯极限，4.56/D弧秒的值是由经验确定的(D是仪器的孔径，单位是英寸)。任何具有完美光学系统的光学系统的放大倍数的理论上限在2000左右。正如这篇1959年《Popular Electronics》上这篇文章所描述，电子显微镜通过发射一束半径远小于可见光波长的电子，并测量其反射，从而消除了这种分辨极限。图像必然是“假色”，因为我们无法感知到电子束所显示的表面的真实波长/颜色。《Popular Electronics》1959年11月刊封面与目录整理译文如下，以飨读者。“惊人的电子显微镜作者：Morris M. Rubin在光学显微镜分辨率达到极限后很久，电子显微镜的分辨率还在继续提高……高达 20万倍。从第一位伟大的显微镜设计师安东列文虎克（Antony van leeuwenhoek）时代起，科学家们就将显微镜作为他们的主要工具之一。年复一年，随着光学玻璃制造技术的改进，新的更好的显微镜使科学家能够看到越来越微小的物体。随后，大约在1890年，光学显微镜分辨率的提升似乎已经走到了尽头。超过大约 2000 倍的放大倍数，即使是最精细、设计最完美的显微镜也只能看到一个模糊的斑点。光本身的基本特征阻碍了更强大显微镜的发展。与声音类似，光以可测量长度的波传播。例如，在可见光谱的中，波的长度约为 6/250000 英寸。为了让光波区分物体上的两个点，两点之间的距离必须是光波长度的三分之一，即6/ 250000英寸以上，小于约半波长的物体无法被光学显微镜清晰放大，无论其透镜多么完美。科学家们推断，既然根本的瓶颈是“普通”光的波长相对较长造成，那么如果有可能使用某种波长较短的光，就可以实现更有效的放大。于是，人们探索了这种可能性，并利用紫外光(其波长约为可见光的三分之一)，设计出可以放大到5000倍的显微镜，放大倍数达到可见光显微镜极限的两倍多。此时，光学显微镜达到了其设计能力的天花板。如果科学家想要更大的放大倍数，他们必须找到一种新的方法。电子的“营救”电子显微镜的理论在20世纪20 年代提出。实验表明，当电子受到高压场加速时，它们会获得可测量的特征波长。电压越高，电子速度越大，表观波长越短。此外，已经证明电子可以被磁场弯曲或折射，类似光可以被光学透镜弯曲和折射。因此，光学显微镜的分辨率极限，就可以通过使用更短波长电子流替代光，从而获得更高放大倍数，这似乎是合乎逻辑的。有了这样的重要概念，科学家们开始着手设计电子显微镜。到20世纪30年代后期，实验型的电镜已经在欧洲、加拿大和美国投入使用。随后，在1940年，RCA公司推出美国第一台商用电子显微镜。虽然按照目前的标准，这些最初的电镜产品设计还比较落后，但相比有史以来最好的光学显微镜则要优越的多。甚至紫外线显微镜的放大倍数也仅限于 5000 倍，而这些早期的电子显微镜却能够放大 10万 倍。今天的模型放大倍数超过 20万倍——足以看到人类头发直径百万分之一的物体——并且通过照相技术进一步放大图像，可以将直径放大至100万倍以上。电子取代光。与光学显微镜的原理类似，电子显微镜使用一系列镜头逐步放大样品。但是，虽然光学显微镜使用玻璃透镜来弯曲光线，而电子显微镜的“透镜”是线圈——类似于电视机的偏转线圈——可以弯曲和偏转电子流。电子显微镜与普通光学显微镜的比较。基本原理是一样的，但是电子显微镜使用线圈来磁偏转和聚焦电子束，而不是用玻璃透镜来弯曲和折射光线。电子枪发射的电子通过聚光透镜，聚光透镜将电子束集中在样品上。由于样本被制样切成部分透明的薄片，在任何一点上，电子通过它的数量都随标本的密度而变化。这样就产生了一种不同电子密度变化的图案。虽然这种图案肉眼是看不见的，但可以通过在标本下方放置荧光屏来显示。然而，在实际操作中，电子通过物镜，这是进行放大的第一步。就在它们到达投影镜头之前，一个“展开”的密度图案就形成了，中心区域随后被投影镜头进一步放大。放大的标本可以直接在荧光屏（其外观和工作方式类似于电视屏幕）上查看，或者可以通过特殊相机拍摄图像（通常内置于电子显微镜中）。放大所得照片可以进一步放大样品。关于价格。除了光学系统，电子显微镜还必须有超稳定的高压电源和高效率的真空系统。这种复杂性导致了当今电子显微镜的高昂价格——从 12000 美元到40000 美元不等，具体取决于所需的放大倍率、品牌等。以上展示了两种最广泛使用的电子显微镜。左边是RCA EMU-3，可以放大20万倍。右边是Norelco EM100B，放大到90000倍。Norelco（荷兰飞利浦）和 RCA（美国无线电公司）是这些装置的最大生产商。德国和日本的制造商也活跃在该领域。俄罗斯人也参与其中，生产了一种电子显微镜，该显微镜似乎是 1940 年 RCA 模型的改编版。首台RCA电子显微镜的共同发明者，James Hillier博士，左边显示的是RCA的EMB模型，在1940年上市。局限性。尽管电子显微镜可能有用，但它仍然有其局限性。由于高压电子对生物体是致命的，电子显微镜不能用于观察活的细菌、病毒等。另外，电子束不能穿透超过 1/25000 英寸，所以电子显微镜不能用于观察更厚的物体——例如苍蝇的翅膀。后一个问题的解决方案是开发特殊设备，这些设备可以切割出足够薄以允许电子通过的待观察物体的切片。这种“切片机”如何处理较软的材料我们很容易想到，但我们如何切下一层 1/25000 英寸厚的钢？这个问题的答案非常简单。钢材表面的“复制品”是在柔软的材料上制成的，例如蜡。复制品很容易切片，当它安装在非常薄的透明膜上时，它会取代显微镜中的原始物体。重要性。现在全国各地的实验室都在使用大约一千台电子显微镜。它们是寻找疾病（尤其是癌症）原因的研究中的宝贵工具，同时，它们在解决各种工业问题方面也很有用。例如，可以通过仔细检查电子显微镜照片来判断橡胶轮胎的磨损质量，从而无需进行漫长而繁琐的路试。最近在纽约举行的苏联展览上展出的一个1959年的俄罗斯电镜但是，电子显微镜最令人兴奋的应用是在细胞研究中。细胞通过蛋白质合成过程生长、滋养和再生。在电子显微镜的帮助下，科学家们第一次能够看到这些过程——这才是真正的“生命的秘密”。人类是一种永不满足的好奇生物。电子显微镜是满足人类求知欲和理解力的最有效手段之一。你能认出这些图片吗？所有这些都是在电子显微镜的帮助下拍摄的（答案在页面底部）。答案1. (a) 总放大倍数 160,000X；飞利浦电子公司提供2. (c) 总放大倍数 425,000X；由法兰西学院和 RCA 提供3. (c) 总放大倍数 112,000X；由麻省理工学院 CE Hall 博士提供4. (d)；总放大倍数 68,000X；由 Esso Research & Engrg 公司提供5. (c) 总放大倍数 14,680X；由陶氏化学公司和 RCA 提供”

据最新一期《自然》杂志发表的研究，以色列魏茨曼科学研究所的研究人员开发了一种新型扫描探针显微镜，即量子扭转显微镜（QTM），它可以创造出新的量子材料，同时观察其电子最基本的量子性质。这项研究为量子材料的新型实验开辟了道路。　　大约40年前，扫描探针显微镜的发明彻底改变了电子现象的可视化方式。尽管当今的探针可在空间的单个位置获取各种电子特性，但迄今为止扫描显微镜无法实现的是，在多个位置直接探测电子的量子力学存在，并提供对电子系统的关键量子特性的直接存取。　　QTM原理涉及两层原子般薄的材料相互“扭曲”或旋转。事实证明，扭转角度是控制电子行为的最关键参数：仅将其改变十分之一度，就可将材料从奇异的超导体转变为非常规的绝缘体，但这个参数在实验中也是最难控制的。　　基于独特的范德华尖端，QTM可创建原始的二维异质结，这为电子隧穿进入样品提供了大量相干干涉路径。由于在针尖和样品之间增加了一个连续扫描的扭转角，这种显微镜可沿着动量空间的一条线探测电子，类似于扫描隧道显微镜沿着真实空间的一条线探测电子。　　实验演示证明了针尖的室温量子相干性，研究人员还施加了较大的局域压力，观察扭曲的双层石墨烯的低能带逐渐平坦化。　　研究人员称，新工具可直接将量子电子波可视化，可观察它们在材料内部表演的量子“舞蹈”，其还为科学家提供一种新“透镜”来观察和测量量子材料的性质。　　如此深入地窥探量子世界，可帮助揭示关于自然的基本真相。未来，QTM将为研究人员提供前所未有的新量子界面光谱，以及发现其中量子现象的新“眼睛”。

|作者：彭金波1,2,† 江颖3,4,††(1 上海交通大学 李政道研究所 )(2 上海交通大学物理与天文学院 )(3 北京大学物理学院 量子材料科学中心 )(4 北京大学轻元素先进材料研究中心 )本文选自《物理》2023年第3期摘要：扫描探针显微镜主要包括扫描隧道显微镜和原子力显微镜，其利用尖锐的针尖逐点扫描样品，可在原子和分子尺度上获取表面的形貌和丰富的物性，改变了人们对物质的研究范式和基础认知。近年来，qPlus型高品质因子力传感器的出现将扫描探针显微镜的分辨率和灵敏度推向了一个新的水平，为化学结构、电荷态、电子态、自旋态等多自由度的精密探测和操控提供了前所未有的机会。文章首先简要介绍原子力显微镜的发展历史和基本工作原理，然后重点描述qPlus型原子力显微镜技术的优势及其在单原子、单分子和低维材料体系中的应用，最后展望该技术的未来发展趋势和潜在应用。关键词：扫描探针显微镜，原子力显微镜，qPlus力传感器，高分辨成像，原子分辨01原子力显微镜的诞生显微镜是人类认识微观世界的最重要工具之一。光学显微镜的诞生让人们第一次看到了细菌、细胞等用肉眼无法看到的微小物体，从而打开了崭新的世界。然而，由于光学衍射极限的限制，光学显微镜的空间分辨率一般局限于可见光波长的一半左右(约300 nm)，很难用于分辨纳米尺度下更细微的结构，更无法用于观察物质最基本的原子结构排布。要想进一步提高探测的空间分辨率，一种途径是减小探测波的波长，比如扫描电子显微镜就是利用波长更短的电子波来进行成像。另一种途径是采取近场的局域探测，比如近场光学显微镜及其他基于局域相互作用探测的扫描探针显微镜。可以想象，要想获得更高的空间分辨率，就需要对样品的探测更加局域，即“探针”尖端足够尖，最好只有探针和样品最接近的几个原子能够发生相互作用，“感受”到彼此。这种相互作用可以是电子波函数的交叠或者原子作用力等。1981年，Binnig和Rohrer发明了扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM)，STM是基于探测针尖和样品之间的隧道电流来进行空间成像的工具。由于隧道电流正比于针尖尖端几个原子与衬底原子的电子波函数的交叠，对针尖与样品之间的距离非常敏感，因此可以获得原子级的空间分辨率。STM的发明，使得人们可以在实空间直接观察固体表面的原子结构，因此荣获1986年的诺贝尔物理学奖[1]。然而，STM依赖于隧道电流的探测，无法用于扫描绝缘样品，因此使用范围受到了极大的限制。有趣的是，在早期的STM实验中，研究人员发现当针尖和样品比较近而出现隧道电流时，会同时产生较强的相互作用力。Binnig意识到通过测量针尖与样品原子之间的相互作用力也可用来对样品表面成像。1986年，他提出了基于探测针尖和样品之间原子作用力的新型显微镜——原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)[2]，并随后与Quate和Gerber搭建出了第一套可以工作的AFM[3]。三人于2016年获得了Kavli纳米科学奖。AFM是基于针尖与样品之间原子作用力的探测，不需要样品具有导电性，因而可以用于研究包括金属、半导体、绝缘体等多种材料体系，大大弥补了STM的研究局限。此外，AFM还可以在大气和液体环境中工作，具有很好的工况条件和生物体系兼容性。这些优势使得AFM成为纳米科学领域使用最广泛的成像工具之一。然而，AFM并不像STM那样在发明之初就获得了原子级分辨率，而是直到5年之后(1991年)，惰性固体表面的原子分辨成像才得以实现[4，5]。近年来，由于qPlus力传感器的引入，AFM的空间分辨能力得到了极大的提升。通过针尖修饰，人们可以更加容易地获得原子级成像，甚至实现氢原子和化学键的超高分辨成像。接下来，本文将简要介绍常见AFM的基本工作原理，然后着重介绍基于qPlus力传感器的AFM(简称qPlus-AFM)及其在各种体系中的应用，最后展望qPlus-AFM在物理和其他领域的潜在应用和面临的挑战。02常规AFM的原理和工作模式介绍2.1 AFM工作的基本原理目前使用最为广泛的是激光反射式AFM，其典型的结构示意图如图1(a)所示[6]。最核心的部分是力传感器，它一般是一个由微加工技术制备的可以振动的悬臂(常用的材料是硅或者氮化硅)，悬臂的末端有一个与悬臂梁一体的尖锐针尖，悬臂的背面镀有一层金属以达到镜面反射。当一束激光照射到悬臂上，光斑被反射到一个对光斑位置非常敏感的光电探测器上。当针尖扫描样品表面时，由于针尖与样品之间存在相互作用力，悬臂将随样品表面形貌的起伏而产生不同程度的弯曲形变，因而反射光斑的位置也会发生变化。通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。图1 AFM工作的基本原理[6] (a)典型激光反射式AFM的结构示意图；(b)超高真空下针尖与样品的相互作用力Fts及各成分力与针尖—样品距离z的关系2.2 原子力的分类在超高真空环境中，针尖与样品之间的相互作用力(Fts)与针尖—样品距离z之间典型的关系曲线如图1(b)所示。Fts大致可以分为长程力和短程力，长程力通常包括范德瓦耳斯力和静电力等，其衰减长度一般为几纳米或者几十纳米。短程力主要包括来自针尖和样品之间形成化学键的作用力和由于针尖—样品电子云交叠产生的泡利排斥力，其衰减长度一般约为0.1 nm左右。长程力对距离不敏感，很难分辨较小的表面起伏，要想获得较高的空间分辨率，需要让短程力的贡献占主导。在特殊的环境下，针尖和样品之间的相互作用力还包括机械接触力、毛细力、磁场力、卡西米尔力、水合力等。2.3 AFM的主要工作模式AFM有多种工作模式，通常分为静态模式和动态模式，后者包括非接触模式和轻敲模式两种(图2(a))。在静态模式下，针尖以拖拽的形式在样品表面扫描并记录表面的形貌起伏变化，因此也叫接触模式。悬臂的形变量为q=Fts/k (k为悬臂的劲度系数)，为了提高力探测的灵敏度，一般使用较软(k较小)的悬臂。为了避免较大的吸引力引起针尖发生“突跳”现象，静态模式主要工作在短程的排斥力区间(图2(b))，因此空间分辨率较高。但这种模式下针尖和样品之间的相互作用力较大，容易对较软的样品产生破坏。图2 AFM的工作模式[6] (a)接触模式、非接触模式和轻敲模式的示意图；(b)不同模式的大致工作范围(区分并不严格)；(c)悬臂在频率调制和振幅调制模式下的共振曲线。人们也经常把振幅调制模式称为轻敲模式，把频率调制模式称为非接触模式在动态模式下，悬臂被压电陶瓷励振器驱动以共振频率振动，当振幅A足够大使得回复力k∙Amax(Fts)时可以避免“突跳”现象的发生。动态模式有轻敲模式和非接触模式两种。轻敲模式类似于盲人使用手杖行走，其振幅比较大，一般从几纳米到一百多纳米，主要的力的贡献来源于针尖距离样品很近甚至接触的时候。这种模式对样品的损坏小，适用于不同的材料，是目前AFM使用最为广泛的模式。但是这种模式由于包含较多的长程力贡献，因此一般较难获得原子级分辨。此外，由于轻敲模式下振幅较大，测量振幅变化的信噪比较高，这种模式一般使用幅度调制(amplitude modulated，AM)，即以固定频率和振幅的激励信号来驱使悬臂振动，针尖和样品的作用力会引起悬臂振幅(及相对于激励信号的相位)的变化，将测量的振幅(或相位)的变化作为反馈信号可以获取样品表面的形貌信息(图2(c))。非接触模式的振幅一般是几纳米或埃的量级，针尖在振动过程中不会接触样品，因此可以避免对样品的扰动或者破坏。非接触式AFM除了可以使用AM模式外，还能以频率调制(frequency modulated，FM)模式工作。这其实与收音机的AM和FM模式原理类似，只是工作的频段不同。在FM模式下，悬臂保持相位和振幅不变，针尖和样品的作用力引起悬臂振动频率的变化，测量振动频率的变化可以得到样品表面形貌的信息(图2(c))。AM和FM模式下悬臂的共振频率变化的响应时间[7，8]分别约为τAM=Q/(πf0)，τFM=1/(2πf0)，其中Q是悬臂的品质因子，f0为悬臂的本征振动频率。由此可见，AM模式的响应时间会随Q因子的增加而线性变大，而FM模式的响应时间不受Q因子的影响。在超高真空低温环境中，悬臂的Q因子会比大气环境下增加几十倍，这使得AFM对力的敏感度及信噪比会有很大提升，但也会使得AM模式下AFM的响应时间大幅延长，导致扫描成像需要很长的时间。因此，AM模式(轻敲模式)主要被用于大气或者液体环境中。Q因子的增加对FM模式下AFM的响应时间没有影响，所以FM模式是超高真空环境下被广泛使用的工作模式，即保持高Q因子的同时还能保证较高的扫描速度。2.4 影响频率调制AFM噪音大小的因素在FM模式下，AFM直接探测的信号是针尖—样品相互作用力引起的悬臂频率偏移∆f，利用公式[9]可进一步转化为相互作用力Fts。频率偏移对应的相对噪音，因此可以用δkts的形式来表示FM模式下AFM测量中4种主要的噪音来源，分别为[10]热噪音：力传感器信号探测的噪音：AFM悬臂振荡的噪音：漂移噪音：其中kB为玻尔兹曼常数，T是温度，B是与扫描速度对应的带宽，nq是悬臂偏转信号探测的噪音密度，r 是频率的漂移速率，N是扫描图像的像素数。由上述式子可知，k越小，4种噪音都更小，因此在满足k∙Amax(Fts)的前提下，选择的k越小越好；Q越大，会使得第一和第三种噪音更小，但过大的Q会使得悬臂在FM模式下的稳定起振难以维持；振幅A越大，前三种噪音都更小，但A太大会引起短程力贡献大幅减小的问题(见下节)。03基于qPlus力传感器的非接触式AFM3.1 振幅对非接触式AFM分辨率的影响在FM模式下，AFM探测的频率偏移∆f，可以转化为权重函数w(z,A)和针尖—样品相互作用力的梯度的卷积[11]。如图3所示，w(z,A)是与振幅A和距离z相关的半椭圆，kts是力Fts与z曲线的梯度，也呈现为勺子形，只是最低点对应的距离z有所不同。可见，当振幅较大时，长程力对频率偏移的贡献占主导；随着振幅减小，短程力的贡献变大。当振幅与短程力的衰减长度(亚埃级)接近时，更容易得到原子级分辨率[10]。图3 长程力和短程力的贡献与AFM悬臂振幅A的关系[11]3.2 qPlus力传感器的发明传统AFM力传感器一般采用微加工制备的硅或者氮化硅悬臂，其劲度系数较小(约1 N/m)，力的探测灵敏度高。为了能探测短程力从而实现高空间分辨，往往需要让针尖靠近表面，从而导致“突跳”的发生。为了避免“突跳”引起的针尖损坏，需要悬臂在较大的振幅下工作。然而，大的振幅会使长程力的贡献增加，引起AFM的空间分辨率大大降低。图4 石英音叉和qPlus力传感器实物图 (a)，(b)手表中拆出来的石英音叉[12]；(c)第一代qPlus力传感器的实物图(图片来自德国雷根斯堡大学Giessibl课题组)[13]；(d)第四代qPlus力传感器的实物图(图片来自北京大学江颖课题组)[6]要想克服上述矛盾，实现在小振幅下工作的同时而不引起“突跳”的发生，则需要使用劲度系数k较大的悬臂。石英音叉是被广泛用于手表中的计时元件(图4(a)，(b))[12]，劲度系数高，可产生极高精度的振荡频率(一般为32—200 kHz)，且具有很高的Q因子。此外，其悬臂的形变可以利用石英的压电效应以电学的方式来直接探测，不需要激光系统，更容易兼容低温环境。早期，人们一般是在石英音叉的一个悬臂上粘上针尖来作为力传感器使用。然而，两个悬臂(相当于两个耦合的谐振子)由于质量和受力的不对称性导致Q因子大幅度降低，严重降低了AFM的信噪比。1996年，Giessibl将音叉的一个悬臂固定在质量很大的基底上，而在另一个自由的悬臂上粘上针尖以作为AFM力传感器，这样把两个耦合的谐振子变成单个独立的谐振子，可以保持较高的Q因子，且Q因子几乎不受针尖—样品相互作用力的影响。因此，这种力传感器被称为qPlus力传感器[13](图4(c))。目前，qPlus力传感器已经经过了四代的升级和改进，最新的版本是直接设计单个石英悬臂作为力传感器(图4(d))。表1 微加工硅悬臂力传感器与qPlus力传感器典型参数的对比[6]典型的qPlus力传感器与广泛使用的微加工硅悬臂力传感器的主要参数对比见表1。可以看到，qPlus力传感器悬臂的劲度系数高得多(一般约1800 N/m)，因此其力灵敏度一般情况下低于硅悬臂。然而，qPlus力传感器可以在非接触模式下，以极小的振幅(约100 pm)近距离扫描样品，而不会出现“突跳”现象。由于qPlus-AFM的振幅可以与短程力的衰减长度接近，因此短程力的贡献非常大，更加容易获得超高的空间分辨率。最近，田野等通过优化设计qPlus力传感器，将Q因子提升到140000以上，最小振幅小于10 pm，最小探测力小于2 pN，从而将qPlus力传感器的性能推向了一个新的水平[14]。此外，使用导电针尖，并通过单独的导线把经过针尖的电流提取出来，可以很容易地将qPlus-AFM与STM集成在一起，以同时发挥STM和AFM的功能。关于qPlus-AFM更为系统的介绍见综述[10，11]。3.3 获得超高空间分辨率的关键如前所述，针尖与样品间的相互作用越局域，空间分辨率越高。换言之，要想获得超高的空间分辨率，需要减小长程力的贡献，凸显短程力的贡献。要实现这一点，有两点非常关键：一是使用与短程力衰减长度接近的亚埃级的小振幅工作(详见3.1节)；二是让针尖更加尖锐，减少长程的范德瓦耳斯力的贡献。对于AFM成像来说，针尖末端几纳米的部分尤其是针尖末端的几个原子扮演着最重要的角色。为了让针尖末端更尖锐，常用办法是让金属针尖轻戳金属衬底或对针尖进行原子或者分子修饰，使得短程的泡利排斥力、化学键力或者高阶静电力占主导。3.3.1 短程的泡利排斥力当针尖与样品的距离足够近时，二者的电子云会发生交叠，产生很强的短程泡利排斥力。大部分时候，泡利排斥力是对固体及分子体系成像获得原子级分辨率的关键。2009年，Gross等[15]发现对针尖修饰一氧化碳(CO)分子后，可以实现对单个并五苯分子的化学键和结构(图5(a))的超高分辨成像(图5(c))，其分辨率已经超过了STM图像(图5(b))。这种超高空间分辨率的成像主要起源于CO针尖“尖锐”的p轨道与并五苯分子之间电子云交叠所导致的短程泡利排斥力。这种针尖修饰方法简单易行，成像分辨率高，使得qPlus-AFM成像技术迅速获得了广泛的应用。除了CO分子修饰外，人们还可以对针尖修饰其他种类的原子或者分子，以提高空间分辨率或者实现其他特定功能，例如Cl离子[16]和Xe分子[17]修饰的针尖以及CuO针尖[18]等。图5 基于泡利排斥力的单分子化学键成像[15] (a)并五苯分子的结构图；用 CO 分子修饰的针尖得到的 STM 图(b)和AFM图(c)3.3.2 短程的化学键力当针尖和衬底的化学活性都较强时，在近距离扫描过程中，二者可以形成局域的化学键，基于这种短程的化学键力，也可以获得超高的空间分辨率。典型的例子是半导体表面的AFM高分辨成像。例如，Giessibl等[19]发现在用AFM扫描Si(111)-(7×7)样品时，针尖会从样品上吸起一些Si团簇而被修饰，因此在扫描时容易与样品表面带悬挂键的Si原子形成共价键，而得到原子级分辨率。然而，这种成像方式对表面结构扰动较大，不适用于弱键和分子体系。3.3.3 短程的静电力通常所说的静电力主要来源于低阶静电力，比如点电荷与点电荷或者电偶极之间的静电力，其大小分别正比于r -2和r -3(r是二者作用的距离)，是较长程的相互作用力，因此空间分辨率较低。而在某些特殊的情况下，高阶静电力的贡献会起主要作用，而且是更加短程的，因此会导致分辨率的显著提升。一个典型的例子是对离子晶体(如NaCl，MgO，Cu2N等)的原子分辨成像。离子晶体表面周期性的正负电荷排布产生指数衰减的短程静电势分布[20]，针尖与离子晶体表面的短程静电力作用可以得到原子级分辨的成像[21]。图6 基于高阶静电力的水分子高分辨成像 (a)CO针尖示意图(上)及DFT计算得到的CO针尖的电荷分布(下)，呈现出明显的电四极矩特征[16]；(b)水四聚体的原子结构图(上)和AFM图(下)[16]。白色箭头和弧线分别指示水分子中氧原子和氢原子的位置；(c)Au(111)上双层二维冰的原子构型(上)和AFM图像(下)，其中可以分辨平躺(蓝色箭头)和直立(黑色箭头)的水分子[23]；(d)Au(111)表面由Zundel类型水合氢离子(黑色箭头)自组装形成的单层结构图(上)和AFM图像(下)[14]另一个例子是利用CO针尖对强极性分子的高分辨成像。彭金波等[16]利用CO修饰的针尖(图6(a)上图)扫描水分子四聚体时，发现即使在针尖距离较远时也能获得亚分子级的分辨率(图6(b))，且图像的形貌与水分子四聚体的静电势分布极其接近，从中可识别水分子OH键的取向。通过理论计算得知，CO修饰的针尖具有电四极矩(图6(a)下图)，与水分子电偶极之间存在高阶静电力相互作用，这是一种更为短程的静电力(正比于r -6)，因此能够在未进入泡利排斥区域时获得超高空间分辨。这种基于微弱的高阶静电力的成像技术可以区分水分子中氢、氧原子的位置和氢键的取向并且扰动极小。近年来，这个技术已被成功应用于亚稳态水分子团簇[16]、盐离子水合物[22]、二维冰[23](图6(c))及单层水中的水合氢离子[14]的非侵扰高分辨成像(图6(d))，将水科学的研究推向了原子尺度。04超高分辨qPlus-AFM的应用相对于传统的AFM，qPlus-AFM可以很方便地与STM集成在一起，并兼容超高真空和低温环境，而且可获得原子级甚至单个化学键级的超高空间分辨率。这些优势使得qPlus-AFM获得了广泛的应用，大大促进了表面科学和低维材料研究领域的快速发展。下面我们简要介绍qPlus-AFM在高分辨结构成像、电荷态和电子的测量、原子力的测量和操纵等方面的应用和最新进展。4.1 高分辨结构成像qPlus-AFM在高分辨结构成像方面得到了最为广泛的应用。Gross等[15]通过对AFM针尖进行CO修饰，首次实现对有机分子的化学结构的直接测量(图5)，触发了一系列后续研究，包括：分子之间的氢键相互作用[24]、分子化学键键序[25]、铁原子团簇[26]、化学反应产物识别[27]等。近年来，人们通过控制有机分子前驱体的表面化学反应可以精确制备低维纳米材料，如石墨烯、石墨烯纳米带等。STM虽然被广泛用于表征其电子态，但是难以直接确定其原子结构、局域缺陷和边界构型等。qPlus-AFM对原子结构的敏感及超高的空间分辨率，可以很好地解决这些问题。例如，Gröning等[28]利用扫描隧道谱成像观测到了石墨烯纳米带末端的拓扑末端态(图7(a)右)，并通过AFM成像确定了拓扑非平庸的石墨烯纳米带的原子构型(图7(a)左)。图7 qPlus-AFM在低维材料高分辨成像中的典型应用 (a)表面合成的石墨烯纳米带的AFM图(左)和0.25 V偏压下的dI /dV 图(右)[28]，四角较亮部分指示拓扑边缘态；(b)利用磁性针尖得到的绝缘反铁磁NiO表面的AFM图像(左)及沿[100]方向相邻两个Ni原子不同自旋取向对应的高度轮廓线(右)[34]此外，qPlus-AFM开始被用于绝缘体表面原子结构的高分辨成像，如KBr[29]，CaF2[30erif font-size:14px "[51] Schirhagl R，Chang K，Loretz M et al. Annu. Rev. Phys. Chem.，2014，65：83

显微镜技术经过长期发展，加之近年来物理学界接二连三出现的重大科研进展，终于，在2008年，显微镜发展史上的新成果&mdash &mdash 超高分辨率荧光显微镜为科学家所研制出。人们预言，它定会成为生物学家的好帮手。 　　Stefan Hell打破了物理学界的传统看法 　　自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。 　　罗马尼亚物理学家Stefan Hell，现任德国马克斯· 普朗克生物物理化学研究院(Max Planck Institute of Biophysical Chemistry)主任。 　　早在上世纪80年代中期，当时师从德国海德堡大学(University of Heidelberg)一位低温固态物理学家的Stefan Hell就已经发现，如果不是像常规那样使用一个透镜聚焦，而是将两个大孔径的透镜组合在一起聚焦，就可以提高光学显微镜的分辨率。Stefan Hell是首位发现这一现象的研究人员。 　　Hell于1990年顺利完成了他的博士学业，但同时，这也意味着他将无法再凭借奖学金的资助进行研究了。Hell最终决定独自一人继续在家研究以上的发现，并最终成功发明了4Pi显微镜。 4Pi显微镜，超高分辨率成像中的一个步骤 　　时任美国马萨诸塞州坎布里奇市哈佛大学(Harvard University)化学系教授的Sunney Xie遇到了Hell，当他了解了Hell发明的4Pi高分辨率显微镜时，Xie对Hell勇敢地对传统物理学观点提出挑战的精神表示赞许。 　　随后，Hell带着他的发明来到了位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)，并获得了德国科学基金会提供的奖学金。1991年，Hell在该实验室开始他的博士后研究工作。 　　起初，许多科学家，包括那些声名显赫的物理学家都认为Hell的工作对于提高光学显微镜的分辨率没有太大的意义。他们认为，Hell仅用他那少得可怜的科研经费来从事这项研究简直就是在冒险。但Hell却始终坚信他能够打破衍射极限。 　　Hell的努力没有白费，他的冒险终于获得了回报。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率显微镜证明了他的确能将传统光学显微镜的分辨率提高3~7倍。然而，尽管Hell提高了Z方向的分辨率，他还是没能突破衍射极限的限制。 　　此后不久，Hell又在芬兰土尔库大学(University of Turku)得到了他的第二个博士后职位。一个星期六的早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有关光学量子理论的书，突然，灵光一闪，Hell脑海里浮现了一个想法：如果使用一种合适的激光，仅激发一个点的荧光基团使其发光，然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有一个点发光并被观察到了。Hell给他的这项发明取名STED，即受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion)。有了这个想法后，Hell立即行动，冲进实验室进行相关实验。每当回想起当时的心情，Hell都会觉得那是他科研生涯中最激动的时刻。 　　曾在EMBL与Hell共事，并共同研发4Pi显微镜的Pekka Hanninen指出，Hell在土尔库大学进行研究工作时非常刻苦。那时，他经常被许多问题困扰。尽管如此，研究过程中还是有许多快乐萦绕着他们。Hell不仅是一名严谨的科学研究者，还是一名音乐爱好者，每当工作至深夜时，实验室走廊总会回响起Hell吹奏萨克斯风的动听乐声。 由共聚焦显微镜(左图)和STED(右图)成像的一个神经元。 　　1994年，Hell在《光学快报》(Optics Letters)上发表了他关于STED的理论文章。不过直到多年以后，这项理论才得以在实践中被证实。在那段时间里，Hell一面继续研究工作，一面四处奔走筹集科研经费，还卖掉了他4Pi 显微镜的专利。 　　但是那个时候Abbe的衍射极限理论仍然在学界占统治地位，许多物理学家对Hell的理论都持怀疑甚至批评态度，因此他们也都将研究重点放在其它的成像技术上。尽管如此，Hell还是在1997年与马普生物物理化学研究所签订了一份长达5年的合同，以继续他的STED研究。 　　1999年，Hell将他的研究成果分别投给了《自然》(Nature)杂志和《科学》(Science)杂志，不过都被退稿。当时两位杂志的主编都没有意识到他的研究成果将会改变整个显微镜领域。 　　直到2000年，事情才终于有了转机&mdash &mdash 《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表了Hell的科研成果。采用 Hell的STED技术，人们第一次得到了纳米级的荧光图像。Hell的工作由此获得了广泛的肯定，2002年，他获得了马普研究所的终身职位。从此，Hell一直在马普研究所从事成像技术的研究工作。 　　紧随STED这项开创性工作之后，世界各地实验室等研究机构内陆续出现了一批高分辨率的显微镜技术。例如，由珍妮莉娅法姆研究学院(Janelia Farm Research Campus)的物理学家兼工程师Mats Gustafsson领导的研究团队开发出了结构光学显微镜(structured-illumination microscopy, SIM)。 果蝇卵母细胞内的肌动蛋白的3D SIM成像，该照片拍摄于完整的卵泡内。 　　SIM技术的原理是通过一系列光成像的图案对低分辨率莫尔条纹形式的精细结构进行成像，此类图像是采用其它技术所无法观察到的。然后再由计算机处理、分析这些条纹中包含的信息，最终就可以获得高分辨率的图像。 　　同年，Gustafsson小组得到了HeLa细胞中肌动蛋白细胞骨架的图像，他的图像相比传统显微镜的图像来说，在测向上的分辨率提高了2倍。随后，Gustafsson小组又使用非线性技术将整体分辨率提高了4倍。 　　科研竞赛 　　2006年，超高分辨率显微镜研究行业翻开了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组、Samuel Hess小组以及庄晓威(音译)科研小组几乎同时报道了他们提高显微镜分辨率的科研成果，下面分别介绍这三个小组的研究情况。 　　Eric Betzig、Harald Hess以及Jennifer Lippincott-Schwartz小组 　　2005年夏天，细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz卸下了她在美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院(HIV)暗室里的红色灯泡。Lippincott-Schwartz正在为赋闲在家的两位物理学家Eric Betzig和Harald Hess腾出空间，筹备实验室。正是这两位物理学家研制出了光敏定位显微镜(photoactivated localization microscopy, PALM)，他们的这种新产品能将荧光显微镜的分辨率提升至纳米级水平。 　　接下来的整个冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那间狭小的没有取暖设备的实验室里工作。现在就职于美国弗吉尼亚州阿士伯恩霍华德休斯医学研究所珍妮莉娅法姆研究学院(Howard Hughes Medical Institute&rsquo s Janelia Farm Research Campus in Ashburn, Virginia)的Hess承认，自己与Betzig对生物学的认识都不深。不过近15年来，他们一直都在努力，希望能运用生物学知识获取高分辨率的显微图像，但是没有取得明显进展。然而，当Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年发明的光敏绿色荧光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后，他们知道他们已经找到了解决问题的关键所在。 　　回想起当时的情形，Lippincott-Schwartz指出：&ldquo 他们当时非常激动。我还记得当我们得到第一张显微图像时，你根本无法看出那是什么东西。直到我看到他们将荧光图像和电镜图像叠加之后的结果才相信，我们成功了。我当时觉得这一切真是太神奇了。&rdquo 　　2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小组在《科学》(science)杂志上发表了他们的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到细胞黏着斑和特定细胞器内的蛋白质。 　　Samuel Hess小组 　　Samuel Hess小组是上述三个小组之一。Hess是美国缅因州立大学(University of Maine)物理系的助理教授。2005年夏天，Hess一直在和他们学校的化学工程师和生物学工程师，就如何提高观察活体细胞脂筏结构的分辨率等问题进行交流。 　　2005年的一个夏夜，Hess被邻居家举办舞会的声音吵醒。半睡半醒的Hess走下楼来，随手画了一副设计图，他的这种设计是需要借助荧光标记的蛋白质来显示细胞形态的。第二天早上，当Hess重新翻看这幅非清醒状态绘制的潦草的设计图时，不由得大笑起来。不过令人吃惊的是，他的这幅设计图竟然没有一点问题。于是他把这幅图拿给物理系的同事检查，但同事也没有发现任何问题。 　　接下来，Hess就按照他的设计图开始制作显微镜了。此时，他的科研经费所剩不多，而结题时间转眼就到。因此，Hess等人以最快的速度组装好显微镜，并进行了试验。同时，在不到两天的时间里，缅因州立大学表面科学技术实验室的同事就为Hess制备好供检验显微镜效果的蓝宝石晶体样品。 　　对于同事们的帮助，Hess总是不胜感激。 　　2006年，《生物物理学期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小组的科研成果。他们将这项研究成果命名为荧光光敏定位显微镜(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。2007年，Hess小组证明了FPALM可以分辨细胞膜脂筏上的蛋白质簇。 　　庄晓威科研小组 　　与此同时，另一个研究小组&mdash &mdash 哈佛大学霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Investigator at Harvard University)的研究员庄晓威科研小组也在研究高分辨率成像技术。 　　通过3D STORM观察到的一个哺乳动物细胞内线粒体网状系统。传统荧光成像(左图) 3D STORM成像(中图)，其中，采用不同颜色标记出z的位置 3D STORM成像中xy维图像(右图)。 　　其实，这三个小组都有一个共同的也是非常简单的理念，那就是先获得单分子荧光图像，再将成千上万个单分子图像叠加在一起，获得最终的高分辨率的图像。 　　早在2004年初，庄等人就已经意外发现了有一些花青染料可以用作光敏开关。这也就意味着这些染料既可以被激活发出荧光，也可以被关闭不发光，人们可以使用不同颜色的光束来随意控制这些花青染料的开和关。 　　从那以后，庄等人就一直在研究如何用光敏开关探针来实现单分子发光技术。他们希望能用光敏开关将原本重叠在一起的几个分子图像暂时分开，这样就能获得单分子图像，从而提高分辨率。Eric Betzig小组和Samuel Hess小组也都采用了同样的策略，只不过他们使用的不是光敏开关而是一种可以先被荧光激活继而被漂白失活的探针。 　　2006年，庄的科研成果在《自然-方法》(Nature Methods)杂志上发表，他们将这项成果命名为随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白质复合体分子。 　　此后几年，超高分辨率荧光显微镜又得到了进一步的发展。现在，生物学家已经能够使用超高分辨率荧光显微镜在纳米水平上观察细胞内部发生的生化变化了。以往那些大小在200nm至750nm之间的模糊泡状图像再也无法对他们造成困扰了。尽管早在上世纪80年代，科研机构里就已经出现了超高分辨率显微镜的构思，但只是最近几年里这项技术才伴随着它的商业化进程获得了快速发展。现在，已经有几十家实验室安装了这种最新型的显微镜并投入了使用。正像Lippincott-Schwartz所说的，超高分辨率显微镜正在以飞快的速度被科研界接受，在生物学界更是如此。 　　超高分辨率显微镜的成绩 　　已经开始使用这些显微镜的生物学家对这项技术都表示出了极高的热情。Jan Liphardt这位在美国劳伦斯伯克力国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratory)工作的生物学家，还清楚地记得他2006年第一次在《科学》(science)杂志读到Betzig的那篇有关PALM技术的论文时的激动心情。当他看到那幅线粒体蛋白的图像时立刻想到了该技术可以用于他自己的微生物研究领域。 　　Liphard说道：&ldquo 通常，我们得到的大肠杆菌荧光图像都只有20像素，甚至更低，现在突然有一幅几千像素的图片摆在你面前，你可以想象那是一种什么感觉。&rdquo 　　Liphard现在正与Betzig以及其他一些研究人员一起研究大肠杆菌的趋化现象(chemotaxis)。Liphard还提到：&ldquo 我从没想到这项技术达到的分辨率有这么高，可以如此清楚地看到细胞内单个蛋白质分子的定位，甚至还能定量。而对我来说，每天的工作实际上就是在弄清楚这些蛋白质在什么位置，什么时候存在。而之前我们的研究主要采用间接方法。但超高分辨率显微镜这项新技术是我从事科研工作这么长时间以来，感触最深，获益最大的一项科技成果。&rdquo 　　美国丹佛市科罗拉多州立大学医学院(Medicine at the University of Colorado Denver)的助理教授Nicholas Barry也正在和Betzig合作，他们使用了一台蔡司的全内反射荧光成像系统(total internal reflection fluorescence imaging, TIRF)来研究肾细胞顶端胞膜上的蛋白质簇。 　　Barry指出，只需要一台蔡司显微镜和普通电脑，差不多就足够了。此外，他们还花费3万美元添置了两台激光发射器。现在，Barry等人可以在8分钟内得到一幅图像，这幅图像由10000帧图像合成，每一帧图像上显示10个分子。最后的图像文件大小大约是0.3GB。Barry等人还使用Perl语言自己开发了一套免费程序。Barry表示：&ldquo 这里面包含了每帧图像的资料信息，客户可以根据这些信息进行相关计算。&rdquo Barry充满信心地提到，很快就会有人为NIH的那套免费图像分析软件ImageJ开发出一套运算程序作为插件使用。 　　美国斯坦福大学(Stanford University)化学及应用物理系教授W.E. Moerner曾于1989年第一个在试验中使用光学显微镜得到了单分子图像。W.E. Moerner教授表示，这几年来，超高分辨率显微镜研究领域已经取得了巨大的进展，终于达到了纳米级单分子分辨率。他兴奋地说：&ldquo 经过了近20年对单分子成像课题的研究，我们终于取得了完美的成果。&rdquo 　　展望 　　自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。2008年，Lippincott-Schwartz的研究团队将PALM技术和单颗粒示踪技术(single-particle tracking)结合，成功地观测到活体细胞胞膜蛋白的运动情况。同年，庄小威研究组在《科学》(science)杂志上也发表了他们的3D STORM成像成果，该技术的空间分辨率比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍。论文中，他们展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其它的分子结构图。随后，他们又进一步将该技术发展成了多色3D成像技术(multicolor 3D imaging)。Gustafsson，还有其他一些科研工作者使用3D SIM技术(该技术使用3束干涉光，而不是常见的2束)观察到了共聚焦显微镜(confocal microscopes)无法观测到的哺乳动物细胞核内结构。位于德国的世界知名光学仪器制造公司蔡司公司进一步发展了SIM和PALM技术，不过他们将PALM称为PAL-M。蔡司公司预计将于2009年末推出全新的成像产品。 　　2008年，Hell小组使用STED技术通过抗体标记目标蛋白，观察到了活体神经元细胞中突触小泡(synaptic vesicles)的运动过程。同年稍晚些时候，他们又使用4Pi显微镜和STED技术得到了固定细胞内线粒体的3D图像，分辨率达到了40至50nm。最近，他们又使用超高分辨率显微镜成像技术对脑切片组织中的形态学变化进行了研究，并得到了活体神经元细胞树突棘(dendritic spines)的3D图像。 PALM在哺乳动物细胞内拍摄到的粘附复合物。 　　由于最近几年这些新技术的不断涌现，现在可以对活体细胞进行三维观察了。Gustafsson指出，随着PALM技术和STORM等新技术的出现，以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了。 　　尽管已有许多科学家从这项技术进展中获益，但是仍然可以进一步提高，以使更多的研究人员能够在自己的工作中使用它。到目前为止，那些成功应用此项技术的实验室都采取了正确的技术组合：研究人员可以很好地将物理学与生物学相结合&mdash &mdash 他们将显微镜装配并做适当的调节，然后用它对生物学样品进行检测。Moerner指出，软件的编写也不容小觑：对检测到的光子进行定位和报告需要进行准确计算，从而得到合适的分辨率。 　　仅仅是显微镜的价格就已经限制了它的普及性，Leica&rsquo s TCS STED显微镜高达100万美元。因此，如何获得相应的资金来购置显微镜仍然是摆在研究人员面前的一个难题，位于丹佛市的科罗拉多大学(University of Colorado)光学显微镜组主任Bill Betz这样说道。 　　Betz曾申请用于显微镜购置的资金，但遭到了拒绝。但他表示，他们已经计划再次申请相关资金。而Stefan Hell曾指出，激光领域的技术进展已经可以使得研究人员自己在实验室内构建一个STED平台，花费只需不到10万美元。 　　除了要将这一技术方法普及，使生物学家能够加以利用之外，该项技术的研发人员还表示，他们已经开始致力于研究更宽范围及更多样的荧光探针了。更好的探针当然能够为我们带来更高的分辨率及更快速的图像处理。美国纽约阿尔伯特&bull 爱因斯坦医学院(Albert Einstein College of Medicine)解剖学及结构生物学副教授Vladislav Verkhusha说到：&ldquo 为了对活体哺乳动物细胞进行研究，你就需要有一整套的荧光标记蛋白和可通过光控开关控制的蛋白质。&rdquo 他本人在荧光蛋白领域的研究工作就受益于PALM的出现。 　　庄晓威的众多项目之一便是与Alice Ting及其在麻省理工学院(MIT)的实验室合作，对蛋白标记技术进行研究，希望能够找到一种方法可以将小和明亮的光控开关可控的探针标记于细胞的特异蛋白上，从而可以对活细胞进行成像。她提到：&ldquo 将遗传标记方法与小而明亮且可被光控开关控制的探针结合在一起，将是今后发展分子级别超高分辨率成像的十分理想的一种方法。&rdquo 　　尽管研发人员还将继续努力，以进行相应技术的提高，但是超高分辨率荧光显微镜更加广泛的应用还是毫无疑问地成为新的一年的标志。Harald Hess说：&ldquo 这一技术的确会为生物学家的工作带来很大的帮助。同时，我们也在不断询问，&lsquo 你们想要用它做什么精彩的实验?&rsquo 事实上，我们也得到了许多精彩的答案。&rdquo

前言当我们进行细胞实验的时候，很多时候都会对培养或者消化细胞的数量进行计算，最常规的就是细胞计数了。原始的细胞计数方法是通过对细胞进行染色，在显微镜下人工观察细胞状态判断细胞死活，进行计数。显微观察是细胞计数的基本原理，但是人工细胞计数是一件非常耗时耗力的工作，特别是要面对大量样本的计数需求时，因此就衍生出了细胞计数仪。我们常见的细胞计数仪是这样的：图源：网络，侵删这些自动细胞计数仪的原理又是怎样的呢？它们的底层原理是这样的：图源：网络，侵删其实自动细胞计数仪就是一个简化版的显微镜，然后搭载了对图片进行识别的软件功能，从而实现对细胞的计数。既然自动细胞计数仪可以做到，那么专业显微镜一定可以做得更好。Echo Rebel和传统的细胞计数仪不同，其具有极高的普适性，无需细胞计数仪的专用耗材，无论载玻片还是培养皿都可以进行计数。Echo Rebel的细胞计数仪是这样的：还可以是这样的：与传统的细胞计数仪相比，Echo Rebel细胞计数采用嵌入式设计，与显微镜完美融合，细胞计数时间短，普适性高，无需专用耗材，使用和维护成本低。你以为这就结束了，不，我们还可以这样：

生物课上，一台显微镜、一片菜叶子加上一只青蛙或者鲫鱼，一场生物显微解剖课开场了。各自不免兴奋，显微镜是多么神奇的一个东西!它让我们能够看到流淌江水中的各种微生物，能够知晓细胞内形形色色的细胞器，能够区分出猩猩有24对染色体而人却只有23对。 　　这都要归功于16世纪一个叫Zacharias Jansen的荷兰人，我们不清楚他如何想到将两个镜片叠在一起并放在管子的两头，但是这个奇怪想法催生出的工具，却能够在压缩最小的时候放大3倍，拉到最长时可以放大达到10倍。他在孩童时期的嘻哈把玩，将我们带进了令人瞠目结舌的微观世界。 　　▲玩出来的显微镜 　　很奇怪，做出显微镜的第一人不是生物学家，而是一个观星的人&mdash &mdash 现代物理学与天文学之父伽利略。1609年，在听说了这个孩子的发明后，他不仅研究明白了这些镜片在一起能够放大很多倍的原理，还制造出了一台更为精密的工具，并将其命名为occhiolino(也被称为little eye)。从此，现代意义上的显微镜走进人们的视野。 　　然而，显微镜真正发展成为一个学科，成为窥视微观世界的独门兵器，还是要等到17世纪六、七十年代。列文虎克，这个出生于1632年的荷兰小伙子，在稚嫩的年纪就不得不面对父亲的去世，被迫来到阿姆斯特丹的一家干货商店当学徒，在那里他接触到放大镜，产生极大的兴趣。闲暇之余，他便耐心地磨起了自己的镜片。或许是太无聊，或许是太好玩，他一生中竟然磨制了400多个透镜，放大倍数竟然可以达到300倍!利用自制的显微镜，列文虎克为我们展现了一个全新的微观世界，他第一个发现并描绘了细菌，展现了一滴水中的世界，准确地描述了红细胞，证明了马尔皮基推测的毛细血管层是真实存在的，他成为了微生物学的奠基人。 　　与列文虎克同期的，还有一个叫做罗伯特&bull 胡克，被称为&ldquo 伦敦的莱奥纳多&bull 达&bull 芬奇&rdquo 的英国博物学家。你说对了，&ldquo 胡克定律&rdquo 就是以他名字命名的。他不仅提出了弹性材料的胡克定律，万有引力的平方反比关系，设计了真空泵，还利用自制的显微镜发现了软木中的&ldquo 小室&rdquo ，并将&ldquo cell&rdquo 一词深深地刻进了现代人的脑海中。从此，显微镜的发展进入了快车道，出现了形式多样、拥有不同功能的各色显微镜。 　　▲光学显微镜 　　灯泡的发明让那些狂热的显微镜粉丝们欣喜不已，终于可以在晚上也可以使用高倍镜片来触摸微观世界了。但是当他们将光源经聚光镜投射在被检样本上后，却发现在视野中除了有那些小东西，竟然还发现了灯丝的影像。直到1893年，一个叫柯勒的年轻人，发明了二次成像技术，成功地将热焦点落在了被检样本之外，不仅光线均匀了，而且也不会损伤样本。这种被称为柯勒照明的光源系统，成为了现代光学显微镜的关键部件。 　　显微镜的变革，也使细胞学迎来了最为辉煌的发展时期。细胞器、染色体等细胞染色方法的出现，使人们对于细胞这一生命最基本单位有了相当深入的认识。但是，染色毕竟影响甚至杀死了细胞，跟一堆死细胞玩真是太没意思了!直到20世纪二、三十年代，弗里茨&bull 泽尔尼克在研究衍射光栅的时候，发明了相差显微技术，这一情况才被彻底改变。 　　再后来，出现了各种形形色色的显微镜，按照设计方式的不同，有正立的、倒立的，还有解剖显微镜，按照目镜的个数，有单目镜的、双目镜的，还有直接数码相机采集图像的，有使用偏振光作光源的，还有不将光直接射入样本的暗视野显微镜，还有选定特定波长的光波照射样本，以产生荧光的荧光显微镜。 　　▲瓶颈所在 　　十八世纪，光学显微镜的放大倍数已经可以达到1 000倍，直到现在人们也只能将其提高到1 600倍左右这个极限了。不是因为技术不够，而是因为显微镜的最大分辨率受到光源波长的限制。 　　光在传播途径中，如果碰到的障碍物或者小孔的尺寸远大于光的波长时，就会被反射回去或者穿透过去，可以看作是沿直线传播。但是当物体尺寸与光波差不多甚至还要小的时候，光波就会发生衍射现象并绕过去。不论我们怎样磨镜片，或者使用油镜来提高清晰度，显微镜的分辨率最多也只能达到光波长的一半。而我们肉眼通常能感知的可见光，波长范围在0.39&mu m ~0.76&mu m，即便使用0.39&mu m左右的紫外光，理想状况下，也就能达到0.2&mu m的分辨率。所以，要想提高分辨率，只能改变光源，并且改用仪器来探测放大的图像。 　　▲新时代的骄子 　　当人们意识到用光学显微镜看不到原子般细微的物质，那么就会想法进一步提高显微镜的分辨率，别的办法行不通，那就只能寻找比光波波长还短的光源。还有哪些波的波长比光波还短?当然是电子。注意，是电子，不是家里电线中220 V的电&hellip &hellip 　　1924年，德布罗意提出了波粒二象性的假说，根据这一假说，电子也会具有干涉和衍射等波动现象，这被后来的电子衍射试验所证实。接着汉斯&bull 布什又开创了电磁透镜的理论。这些使人们产生了制作显微镜的新想法：为什么不用具有波动性的电子做&ldquo 光源&rdquo ，再用电磁透镜来放大呢?于是，1932年德国工程师恩斯特&bull 鲁斯卡和马克斯&bull 克诺尔制造出了第一台透视电子显微镜，这是近代电子显微镜的先导，鲁斯卡也因此获得了1986年度的诺贝尔物理奖。 　　电子显微镜有着与光学显微镜相似的成像原理，它的神奇之处在于用电子束代替光源，而电磁场也化身成了透镜：高速的电子束在真空通道中穿越聚光镜再透过样品，带着样品内部的结构信息投射在荧光屏板上，最终转化成可见光影像。另外，由于电子束的穿透力很弱，用于电子显微镜的标本，需要用超薄切片机制成厚50纳米左右的超薄切片，稍微厚一点，电子就可能做无用功。如果给飞奔的电子再来一马鞭，电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，分辨率可以达到纳米级(10-9 m)。 　　用电子束代替光看起来已经是一个反常规的奇妙主意，但让人想不到的还在后面。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家格尔德&bull 宾宁和海因里希&bull 罗雷尔，发明了扫描隧道显微镜，这是一种利用量子理论中的隧道效应探测物质表面结构的仪器。这种显微镜比电子显微镜更激进，它的出现完全抛开了传统显微镜的概念。 　　最神奇的是，扫描隧道显微镜没有镜头!没有镜头也敢叫&ldquo 显微镜&rdquo ?没错，这不是山寨的时候出了问题，它原原本本就是这么设计的。扫描隧道显微镜依靠&ldquo 隧道效应&rdquo 进行工作，如同一根唱针扫过一张唱片。一根有着原子般大小的探针慢慢通过被分析的物体，当探针距离物体表面很近时(大约在纳米级的距离)，电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应改变，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状。所以，当电流经过一个原子，便能极其细致地描绘出它的轮廓，通过绘出电流量的波动，我们就可以得到单个原子的美丽图片。 　　电子显微镜的出现，&ldquo 神马&rdquo 细菌、病毒、DNA、蛋白质大分子、原子核、电子云啥的，都得规规矩矩老实听话，要不，来探针下现个原形? 　　▲未知的微观世界 　　对人来说，安全电压是36 V，可是对于电子显微镜下的观测样品，其接收到的辐射剂量等同于10万吨当量的氢弹在30米远处爆炸的辐射量!当生物标本暴露于电子束中时，细胞结构和化学键将迅速崩溃，所以电子显微镜虽然精妙却无法用于活细胞的观察。 　　麻省理工大学Mehmet教授的研究小组提出，通过使用量子力学的测量技术可以让电子束被约束起来，在稍远的距离感应被观察的物体，一次扫描样品的一个像素，并将这些像素组合起来拼出整个样品的图像，从而避免损坏实验样品。倘若研究成功，它可以使研究人员看到分子在活体细胞内的活动，比如酶在活细胞中的功能或是DNA的复制过程，用以揭示生命和物质的基本问题。 　　看电影，你一定希望看到3D的画面。同样的，长期的2D显微镜成像，也让人们感到审美疲劳，于是3D图像技术如雨后春笋般发展起来。共聚焦显微镜已经能够通过移动透镜系统对一个半透明的物体进行三维扫描，通过计算机系统的辅助，对实验材料从外观到内在、从静态到动态、从形态到功能进行观察。 　　同时，随着数码摄影技术、信息技术和自动化技术的革新，显微镜的外观、舒适性、自动化程度以及方便性都在提高。例如近几年的大屏幕倒置显微镜，直接通过液晶显示器来观察，研究细胞结构就像在电脑上看电影，大大减轻了显微镜观察时的疲劳。

成果名称 多模态光声生物显微镜的研发 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 成果成熟度 □研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 光声显微成像是基于全新影像机制的显微成像模态。它提供了前所未有的生物影像，和CT、MRI或荧光影像的出现一样，它必将对我们认识生命过程、疾病的机制提供了新的工具和角度。与现在广泛应用的基于荧光标记的光学显微成像技术不同，光声显微成像在不依赖于标记和对比剂的情况下，也可以基于生物组织内在的特异性实现无标记活体成像，为研究生命科学开辟了新的思路和方向。目前国际上越来越多的实验室和研究机构开始利用光声显微成像进行从细胞到组织不同尺度的广泛研究，其重要性日益突出。该成像技术正处于从实验室走向产业化的过程，美国和欧洲都大力投入这个领域的研发，未来的市场前景很大。 北京大学工学院李长辉课题组在研究现有光声显微成像技术的基础上，结合其最新设计和与我校其它单位的合作研究的经验，研发了一款可广泛用于科研的新型生物显微镜。其申请的&ldquo 多模态光声生物显微镜的研发&rdquo 项目得到了第三期&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金的支持，获批资金20万元。在基金的帮助下，通过关键配件的购置和研发，课题组完成了包括光路设计与搭建、机械和光学扫描系统的硬件设计和软件控制、光声显微成像和传统光学显微成像图像配准等主要工作，攻克了多种光学系统光路共享、二维扫描振镜和高频脉冲激光结合和图像实时采集等多个技术难题，所研制的样机是一台包括了光声显微成像、荧光显微成像和共聚焦成像的多模态生物显微成像系统，取得了良好的效果。该项目已经顺利结题，其成果已经进行了专利申请和论证发表，并将进一步在我校和其它科研机构中进行推广，应用于生命科学和基础医学研究中。目前，实验室已经和国际上著名显微镜生产厂家&mdash &mdash 麦克奥迪实业集团，开展实质性的密切合作研究，成果转化前景广阔。 研究现有光声显微成像技术的基础上，结合其最新设计和与我校其它单位的合作研究的经验，研发了一款可广泛用于科研的新型生物显微镜。 应用前景： 目前国际上越来越多的实验室和研究机构开始利用光声显微成像进行从细胞到组织不同尺度的广泛研究，其重要性日益突出。该成像技术正处于从实验室走向产业化的过程，美国和欧洲都大力投入这个领域的研发，未来的市场前景很大。

据美国物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校物理学家开发出一种新型X光显微镜，不仅能透视材料内部结构，而且洞察之细微达到了纳米水平。该显微镜有助于开发更小的数据存储设备，探测物质化学成分，拍摄生物组织结构等。研究论文发表在《美国国家科学院院刊》上。 　　X光纳米显微镜不是通过透镜成像，而是靠强大的算法程序计算成像。“这种数学运算方法相当复杂，其原理有点像哈勃太空望远镜，就是让最初看到的模糊图像变得清晰鲜明。”领导该研究的加州大学圣地亚哥分校副教授奥里格夏佩克解释说，X光探测到物质的纳米结构后，会生成衍射图案，计算机按照运算法则将这种衍射图案转化为可辨认的精细图像。 　　为了测试显微镜透视物体的能力和分辨率，研究小组用钆和铁元素制作了一种层状膜。目前信息技术行业多用这种膜来开发高容高速、更微小的内存设备和磁盘驱动器。 　　“这两种都是磁性材料，如果结合成一体，就会自然地形成纳米磁畴。”夏佩克说，在显微镜下面，能看到它们形成的磁条纹。层状的钆铁膜看起来就像一块千层酥，层层褶皱形成了一系列的磁畴，就好像一圈圈指纹的凸起。 　　“这还是第一次能在纳米尺度观察到磁畴，而且不需要任何透镜。”夏佩克解释说，这对开发更小的数据存储设备非常关键，磁比特可以做得更小，也就是说让磁纹变得更细，从而开发出磁畴更小的材料，就能在更小的空间里储存更多数据。 　　“在目前的磁盘表面上，1个磁比特约15纳米大小。我们的显微镜能直接拍摄到比特位，这对拓展未来的数据存储能力打开了新空间。”论文合著者、该校电学与计算机工程教授、磁记录研究中心的埃里克富勒顿说。 　　此外，该显微镜还能用于其他领域。通过调节X光的能量，还能用它来观察材料内部有哪些元素，这在化学上是非常重要的。在生物学领域，用X光给病毒、细胞及各种不同的组织拍照，要比用可见光拍出来的效果好得多。 　　夏佩克说，在计算机工程领域，我们希望能以可控的方式造出新型磁性材料和数据存储设备 在生物和化学领域，能在纳米水平操控物质。要达到这些目标要求，必须从纳米水平理解材料的性质，而X光显微技术让人们真正在纳米水平看到了物质内部。

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是基于共轭焦点技术设计的显微镜类型，即为使激光光源、被测样品和探测器都处于彼此的共轭位置上。基本原理在一般的显微镜中通过将物镜的焦平面与探测器重合使得观测的像平面与相邻的轴平面隔离开来，而在共聚焦显微镜中通过使用衍射受限的光点照亮样品，并在该光点共轭焦点处的收集光路径中使用针孔来过滤杂散光达到产生这种隔离效果从而提高分辨率。激光共聚焦显微镜原理图成像特点—不同的焦平面上生成“z叠层”图像—上图所示结构中，只有在共轭的样品层反射回的光可以通过收集光路径中的小孔，其余无关的样品层反射被小孔阻隔。这可以得到显著的分辨率的提升。如下图所示的是同一厚样品的多维荧光显微镜和共聚焦显微镜的并排比较。当在不同的焦平面上拍摄一系列图像时，可以生成通常被称为“z叠层”的图像，这一图像显示了共聚焦显微镜提供的分辨率和对比度增益以及这些增益的根本原因。可以看到在成像平面位于组织上方的堆栈顶部检查图像可以发现荧光图像中带有大量的散射光，而共聚焦显微镜的图像则显示为黑色。这种轴向上的PSF的减少直接导致了z叠层中间光学界面上观察到的分辨率差异。同一厚样品多维荧光显微镜和共聚焦显微镜成像比较成像特点—光学切片扫描成像—激光扫描共聚焦显微镜的另一个特点是它是一种扫描成像技术，传统的宽场照明技术是将整个样品都照亮，因此可以图像可以直接被肉眼或探测器捕捉，但是LSCM采用一束或多束聚焦光束穿过样品扫描成像，这样得到的图像被称为光学切片，下所示即为传统的宽场照明方式与激光扫描共聚焦照明方式的区别。传统宽场显微镜和激光扫描共聚焦显微镜照明方式区别因此现代共聚焦显微镜的一种实际的工作方式如下图所示，激光发出的激发光通过二向色镜，通过一对振镜在样品x方向和y方向进行扫描，样品激发（或反射）的光通过针孔进入PMT检测器被记录，记录下的扫描图像通过计算机重构出实际的样品图像。一种实际的激光扫描共聚焦显微镜示意图成像特点—分辨率对比宽场照明大幅提升—在荧光显微镜中，单点发射的光强度由点扩散函数（PSF）描述，其图案就是一个艾里斑，荧光系统的分辨率可以由艾里斑的半径来描述，艾里斑的半径可以由物镜的数值孔径和激发光的波长决定：另一种荧光系统分辨率测量方式是半高宽最大值，即强度下降到峰值50%的值，此时宽场荧光照明的横向分辨率为：激光扫描共聚焦显微镜的分辨率为：这表明，共聚焦显微镜的理论最大分辨率比宽场照明提高了倍。下图表示了宽场显微镜与共聚焦显微镜的对比，左图为宽场显微镜得到的图像，右图为共聚焦显微镜得到的图像。宽场显微镜与共聚焦显微镜成像对比主要应用领域—医疗领域

表面分析技术包括飞行时间二次离子质谱，扫描探针显微镜，X射线光电子能谱等技术，在生物医药的生产和研发过程中，对于药物，细胞等表面和一定深度的成份信息的表征具有非常重要的意义，也是生物医药领域必不可少的分析表征手段。基于此，仪器信息网网络讲堂将于2022年9月23日举办“表面分析技术在生物医药领域的应用”网络研讨会，特邀5位专家带来精彩分享，聚焦AFM、XPS等最新应用进展！为相关从业人员搭建沟通和交流的平台，促进相关仪器技术及应用的发展。日程全览，点击报名时间专家09:30韩东（国家纳米科学中心 研究员）主要研究方向：纳米生物医学成像与表征、生命复杂流体与管理、生物力药理学。《生物型原子力显微镜表面分析技术在活体样品上的应用》报告摘要：21年经验，纯干货分享！纳米成像表征技术的源头应用与适应性改造生物活体纳米成像、表征设备功能群针对关键科学问题的新手段、新技术研发关于细胞的力学模型10:00樊友杰（布鲁克 应用工程师）《高速原子力显微镜在生物表面表征中的应用》报告摘要：快速原子力的发展克服了传统原子力速度上的局限，高空间分辨率的同时在毫秒尺度上研究生化动力学过程成为可能。介绍商业化的视频级速度的生物弄原子力显微镜在生物样品领域里的成像，在使用非常小的作用力同时得到亚分子级结构的分辨率。介绍快扫型原子力在探索不同的天然和人工聚合物动力学过程的一些实例，还有原位研究细胞膜表面的动力学过程，及二维光敏蛋白质晶体细菌视紫红质的动态过程。介绍JPK最新的力学成像模式“定量成像模式（QI™ ）”Bruker生物弄原子力的全针尖扫描模式可以从结构上非常好地与现代主流倒置显微镜进行无缝偶合。10:30王化斌(中科院重庆绿色智能技术研究院 研究中心主任/研究员)中国科学院首批岗位特聘研究员，重庆市高分辨三维动态成像检测工程技术研究中心主任；长期从事光谱、成像及力学方面的研究工作。《原子力显微镜在生物样品成像和力学测量中的应用》报告摘要：介绍原子力显微的不同成像模式及应用实例分享原子力显微镜不同力学分析技术及应用情况11:00蔡斯琪（岛津企业管理（中国）有限公司 产品专员）《XPS表面分析技术在生物医药领域中的应用》报告摘要：X射线光电子能谱仪是表面分析领域中一种崭新的分析技术，通过测量固体样品表面约10nm左右被激发出光电子的动能，进而对固体样品表面的元素成分进行定性、定量及价态分析。报告中主要介绍XPS原理、技术特点以及XPS在生物材料及医疗器械等领域的应用，旨在让科研工作者对XPS表面分析技术在生物医用领域的应用有所了解。11:30周江涛（苏黎世联邦理工学院 助理研究员）主要研究兴趣有原子力显微镜及相关显微成像分析技术，在生物纳米纤维材料的形成机理和应用的研究。《原子力显微镜在成像及与光热谐振结合的微纳表面化学分析技术》报告摘要：简要原子力显微镜的原理及应用示例重点介绍原子力显微镜与可见/红外光结合的光热谐振技术，以及他们在纳米尺度的高灵敏度表面化学结构分析点击图片，即可免费参会，和嘉宾线上互动！

p 　　在国家自然科学基金项目等资助下，中国科学院生物物理研究所徐涛院士和纪伟教授级高级工程师在提高光学显微镜分辨率技术领域取得重要进展。相关成果以“Molecular Resolution Imaging by Repetitive Optical Selective Exposure”( 基于重复光学选择曝光的分子分辨率成像技术)为题，于2019年9月9日在Nature Methods(《自然方法学》)杂志在线发表。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-019-0544-2。 /p p 　　该工作提出了一种基于激光干涉条纹定位成像的新技术，并据此研制出新型单分子干涉定位显微镜(Repetitive Optical Selective Exposure, ROSE)，将荧光显微镜分辨率提升至3 nm以内的分子尺度，单分子定位精度接近1 nm，可以分辨点距为5 nm的DNA origami(DNA 折纸)结构。为降低单分子发光时的闪烁和漂白对亮度和定位精度产生的不良影响，研发团队对显微镜光路进行了创造性地设计，分别为：基于电光调制器的干涉条纹快速切换激发光路，基于谐振振镜扫描的6组共轭成像光路，两种光路的同步实现了高达8 kHz的分时成像，确保在相机的单次曝光时间里把每个单分子发光状态均匀分配给6个干涉条纹，有效避免了荧光分子发光能力波动对定位精度的干扰。 /p p 　　研发团队利用该技术对不同荧光位点间距的DNA origami阵列进行验证测试，证明干涉成像分辨率达到了3 nm的分子水平。后续的细胞实验结果显示，该技术在免疫标记的微管、CCP(clathrin coated pits，网格蛋白有被小窝)以及较致密的细胞骨架成像时展现出良好性能，该工作使得超高分辨光学显微镜家族再添新成员，光学显微镜分辨率被进一步突破，将为进一步解析精细亚细胞的组分和生物大分子的纳米结构提供有力工具。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201909/uepic/a05a7f71-279c-47d6-855f-34acf83f1e5f.jpg" title=" tpxw2019-09-19-01.jpg" alt=" tpxw2019-09-19-01.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图. ROSE干涉定位与传统质心定位的原理示意，以及用于DNA origami和细胞微丝成像效果比较 /strong /p

由丁明孝、梁凤霞、洪健、李伯勤、王素霞、朱平领衔主编的《生命科学中的电子显微镜技术》，经过八年编著，于今日正式出版。它凝聚了国内外45位电镜专家的经验和智慧，是一部综合性、实用性、专业性极强的经典著作。本书以促进生物电镜实验水平和制样效率的不断提高为目的，主要介绍了当前各类生物电镜技术，侧重实验技术的难点要点，实验问题和解决途径，强调实验设计理念与具体操作细节。全书共分为8章，包括：常规生物电镜样品制备技术，电镜原位成分分析技术，电镜三维重构技术，光电关联显微成像技术，植物组织的透射电镜样品制备技术，医学电镜超微病理诊断及电子显微镜的结构、原理及操作要点等内容。这部著作凝结着编写组的知识和心血，代表着一代中国电镜工作者的最高水平，将成为我国生命科学电镜技术及电镜教育事业的里程碑。八年来，全国生物电镜工作者一起见证了它的酝酿和诞生。这部著作在当前特殊的国际形势下诞生，具有特别的现实意义和历史意义，是全体电镜人的骄傲。为庆祝这部著作的发行，且应广大读者要求，希望获得领衔作者丁明孝教授的寄语签名，经过与丁老师沟通，中镜科仪将准备100册，由丁老师集中签名。请需要购买的老师尽快在如下链接中进行登记。点击链接填表订书： https://f.wps.cn/fw/N0vNiDmQ/