固态检测

11月21日，苏州丽纳芯生物科技有限公司第四代固态纳米孔基因检测仪工程样机发布会在花桥国际创新港举行。据悉，这是国内首个拥有自主知识产权固态纳米孔基因检测仪样机，作为生命科学研究工具及精准医疗进步的基石。丽纳芯首席技术官朱博士讲解新一代检测仪随着半导体工艺技术的飞速发展, 小型化、高速度、大通量的固态纳米孔基因检测芯片的制作已经实现，并使得检测芯片的大规模生产成为可能。近年来在业内被充分公认，低成本、规模化是固态纳米孔测序仪领域未来的发展方向，丽纳芯作为苏州昆山高科技领军人才科技公司，拥有纳米孔芯片的核心工艺、生产技术。据悉，丽纳芯作为中国首个固态纳米孔基因检测仪开创者，在2022年12月发布了国内首个自主研发第四代固态纳米孔基因检测Lsmart-SP1原理样机。2023年3月发布了搭载Lsmart-SP1专有纳米孔芯片 Cell-231 以及配套试剂，研制了第二代Cell -241芯片，作为生命科学研究工具已应用到动物、植物、微生物、环境、人类以及临床等研究中。日前发布的Lsmart-SP1工程样机所对应的目标产品是一款Ipad 大小手持式纳米孔基因检测仪，无需扩增，便可以直接读取结果出具报告，将其应用于生命科学研究工具包括动物、植物、微生物、环境、人类、临床等研究以及临床医学包括肿瘤早筛、伴随诊断、病原微生物检测、疾病预后分析、基因测序等。一经商业化，可打破基因测序仪被国外垄断的局面，成为我国第一台高通量、高集成可广泛应用于生命科学研究及临床医学的固态纳米孔基因检测仪。丽纳芯CEO谭博士表示：“丽纳芯开创了中国固态纳米孔基因检测高通量、集成化、低成本、小型化、移动式、超快速、检测灵敏性代入‘单分子识别’时代。丽纳芯作为国内第一个固态纳米孔基因检测商业化敢为人先的团队，还有很长的路要走。固态纳米孔基因检测仪首先作为生命科学研究的工具，在动物、微生物、植物、环境、人类、临床研究等发挥着高精尖的作用，其次在临床医疗领域包括有精准预防、早期筛查、精准诊断、癌症早筛、病原微生物快速检测，临检快速报告等发挥巨大优势。”在发布会上，丽纳芯首席技术官朱博士对新一代检测仪工程样机的原理、系统构成、检测过程以及检测数据进行了讲解和展示，丽纳芯也共享阶段性数据。该样机能够以“基于电压反馈控制”方式，自动化地完成检测全过程。从现场演示情况来看，整个过程除加入待测样本之外，无需其他人工操作，具有非常高的自动化程度。中国乃至全球，生命经济成为新的经济增长引擎，而生命经济的核心就是基因测序技术，国家级人群基因组学研究是精准医学的基石，直接影响到一个国家在生物医药领域的核心竞争力。第一个人类的基因组，从1990年到2003年，由2000名科学家历时13年，花费38亿美金才完成，图谱中包含了人类染色体的近30亿个碱基对的核苷酸序列，由于高度重复的DNA块组成，当时技术的局限，这份图谱仍留下了约8%的空白区，这部分的测序难度非常大。1975年至今，基因测序技术已经发展到第四代，测序时间从13年缩短到5小时，测序金额从38亿美金降低到1000元人民币，自国际人类基因组计划之后，各国纷纷推出国家级大规模人群基因组测序项目。以英国为例，2012年12月，英国启动10万人基因组计划，历时5年半的时间才完成7万多例全基因组测序。谭博士表示：“二代每台每天能完成60例个人全基因组测序，未来实现国家级大规模人群基因组测序，只需数百元、几小时、高集成、高通量即可完成人类全基因组测序应该不是梦想”。据了解，丽纳芯制定了三步走战略规划，第一步在已推出样机的框架基础上，研发团队进一步的优化开孔电流噪声，电流稳定性，数据分析算法，流体芯片开孔率等问题，将用一年左右的时间，即在2024年7月左右，推出面向生命科学研究市场的国内首款固态纳米孔基因检测仪产品。在此基础之上，再用两1-2年左右的时间，推出面向临床医学市场的高通量、高集成的检测仪，立足于清晰的技术路线，经过后续优化，仪器最终检测准确率可达到99%以上。突破将人类全基因组测序成本降低至百元人民币左右，数小时内完成大规模检测全过程的目标。

从实验室到生产线：固态光源技术在生物成像与工业检测中的性能提升生物医学成像和工业计量的照明系统规格通常集中在光谱、空间和时间的光输出特性上。Lumencor的技术支持总监Iain Johnson和我们分享了固态光源阵列——LED、发光管和激光器组合成的固态光引擎如何实现规格定制，以满足特定应用的照明要求。固态光引擎是一个集中控制的固态光源阵列，其输出合并到一个共同的光学传输系统中（图1）。光源的输出可以并行激活以产生白光（图2），或在需要分离的波长时，也可按顺序进行激活（图3、图4）。光源本身可以采用一种固态照明技术，即LED、光导管或半导体激光器，也可以对这些光源技术进行组合。这可以根据zui终用户的应用对亮度、角度分布和辐照度的要求进行定制。根据这一定义，光引擎输出的光谱分布可以通过加法组合，而这与传统的宽光谱照明设备（电弧放电和白炽灯）形成鲜明对比。传统的照明设备产生的光谱分布在物理上是不变的，只能通过选择性的阻挡和衰减来调整。从工程学的角度来看，固态光源的第二个主要优点是，它的输出可以在强度（图2、图4）和时间（图4、图5）方面进行精确控制。因此，光谱输出单元件的差异很小（图2），这使得光引擎应用于不同成像系统时，所获得的数据质量能保持一致。图1.固态光引擎及其输出光谱的概念图。四个固态光源的输出被合并入一个共同的光路，并通过光导耦合进入纤维及或者图像扫描仪。在实际操作中，光源可以是2-21个，具体数量取决于应用要求。光源可以是LED、光导管或半导体激光器其中的一种或组合。它们的输出可以经过滤波（F）以细化光谱。输出光的一部分会被分离出来，并导向参考光电二极管（rPD），以提供控制反馈。在大多数生物医学成像应用中，不需要持续照明，甚至在某些情况下，会起到反效果，影响实验数据。通常情况下，照明与相机曝光会同步进行。这里有两个重点：首先是光源间的切换速度，其次是脉冲间隔的复现性。相比和机械滤光轮耦合的白光照明器（约50ms的切换时间），光引擎可以做到小于1ms的光源间切换（图4），缩短了获取多色图像Z轴堆叠或者玻片扫描所需的时间。脉冲间的积分不变形（图5）是决定延时图像序列保真度的关键因素。每个脉冲的积分量化了在延时序列中每次曝光所需的照度。脉冲之间的照度差异越小，样品动态行为的敏感度就越能增加，这在图像帧到帧的变化间可以体现。图2.28台SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光谱输出曲线叠加。光引擎的总光输出由光谱曲线所包围的区域来量化。所有28台光引擎的平均输出功率为4558mW，标准差（n=28）为91mW，相当于2%的方差系数（CV）。图3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光谱输出，包括LED、发光管或激光器。发光二极管和光导管的波长规格（nm）代表了中心波长（CWL）/半高全宽（FWHM），已经通过内置的滤光片来改进光源输出。功率（mW）是在光导（连接到显微镜或光学扫描仪）的远端测量得到的。集成三种不同类型的固态光源，可以在整个可见光和近红外波段内提供均匀的功率输出。图4.由TTL触发，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替输出485nm（约0.5ms宽）和560nm（约3ms宽）的脉冲（示波器记录）。图中显示了两条叠加的示波器轨迹，其中485nm的强度通过RS232串行命令从100%调整到55%，而560nm的强度保持不变。485nm和560nm的脉冲时间间隔为0.25ms。图5.模拟光电二极管（APD）检测来自一台5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）发出的5ms光脉冲。图中展示了10个脉冲序列，代表了每次数据采集中记录的150个连续脉冲。计算了150个脉冲序列中每个脉冲的积分光输出。对于555/28 nm输出，150个脉冲的方差系数（CV）在555/28 nm脉冲串中为0.23%，在635/22 nm脉冲序列中为0.20%。其他三个源通道的CV值相似（0.15-0.25%）。除了光谱带宽（图3）以外，固态LED、光导管和激光器之间的主要区别在于其光输出的角度分布；LED和激光器之前的zui大区别如表1所示。对于宽场显微镜应用，LED光源配置为科勒照明产生的均匀照明，辐照度范围为1-100mW/mm2。然而，单分子定位显微镜（SMLM）需要更高的辐照度，通过链接到显微镜临界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），可以在样品表明提供10^4mW/mm2的辐照度（图6）。临界照明的使用是由科勒照明在光学上的低效率所决定的，因为科勒照明并没有覆盖整个光源表面或者发射光的全部角度分布。在临界照明中，光源被直接成像到样品平面上，这种方法更为高效，但对光源输出中的任何空间不均匀性也更为敏感。临界落射照明器的作用是均匀化任何空间上的不均匀性，以产生与典型scmos相机传感器尺寸（~200mm2）相匹配的高辐照度照明场。Light SourcePower(mW)①light guide②Light Guide Cross SectionArea(mm2)NA③Etendue (mm2 sr)④LED500Liquid light guideCircle,3mm dia7.070.302.00Laser800multimode fiberSquare, 0.4*0.4mm0.160.220.02表1. 光源比较①输出功率是在指定光导的远端测量的②使用光导将光源输出耦合到显微镜或光学扫描仪③光导的数值孔径④光通量积决定了光学检测系统有效利用光源输出的能力。当光源的光通量积与光学系统的光通量积紧密匹配时，可以获得zui佳性能。sr=球面弧度。 针对光驱动生物技术以及工业应用，优化光源的选择性需要全面考虑仪器的光谱、空间和时间要求，这些正是需要照明光源来支持的。通常一种技术尽可以满足其中的部分要求，所以zui佳策略即是混合多种技术来满足全部需求。复杂的光引擎可以提供这样一种集成的方法来混合光源，并克服任何给定技术的基本限制，例如，在荧光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“绿色间隙”功率和亮度往往无法满足；或者相对于毫秒级的切换时间，任何弧光灯的开/关不稳定性；又或者广谱光源进行多路复用研究时，谱宽也带来了限制。如今各种固态光源各有优劣，只有仔细评估它们的优点与局限性，才能为光驱动生命和材料科学应用的广泛领域找到zui合适的照面解决方案。图6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通过一根直径800um的光纤耦合到安装在尼康Ti/Ti2显微镜的临界落射照明器上，并产生均匀的荧光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物镜和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相机进行图像捕捉。图表显示了相机沿着标记为红色的对角线所记录的灰度值。右上角的插图展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物镜成像的同一样品。关于昊量光电：上海昊量光电设备有限公司是光电产品专业代理商，产品包括各类激光器、光电调制器、光学测量设备、光学元件等，涉及应用涵盖了材料加工、光通讯、生物医疗、科学研究、国防、量子光学、生物显微、物联传感、激光制造等；可为客户提供完整的设备安装，培训，硬件开发，软件开发，系统集成等服务。

对羟基苯甲酸酯类作为食品防腐剂被广泛应用在各类食品中，其中对羟基苯甲酸甲酯（MP）、对羟基苯甲酸乙酯（EP）、对羟基苯甲酸丙酯（PP）和对羟基苯甲酸丁酯（BP）一直是国家食品安全检测抽查的重点项目，并且MP和EP在酱油和醋中的zui大添加限量（以对羟基苯甲酸计）均为250mg/kg。国标中预处理技术存在的问题现行的《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》（GB 5009.31-2016）中，针对气相色谱法检测的样品预处理技术主要是多次液液萃取+液液洗涤的技术，该方法操作繁琐、检测耗时长、有机溶剂消耗量大（其中包括消耗大量的易制毒化学试剂），且回收率较低、稳定性差，另外净化效果也不佳，往往存在着干扰检测的杂质成分。月旭科技针对固态发酵食醋这种复杂基质食品，开发出了固态发酵食醋中对羟基苯甲酸酯类色谱检测预处理专用方法包，这个方法包所采用的双柱SPE法可实现高效、稳定可靠地从各种复杂基质的固态发酵食醋中提取、分离和净化4种对羟基苯甲酸酯类（对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯），大幅度减少对色谱柱及色谱管路污染、甚至堵塞情况，可以很好地保护色谱系统。提取液：从食醋样品中提取对羟基苯甲酸酯类；提取吸附剂：吸附食醋样品中的大颗粒杂质；萃取液：使对羟基苯甲酸酯类提取液中的杂质沉淀分离；萃取管：管中的吸附剂可吸附萃取时沉淀的杂质；净化专用SPE柱（双柱）：吸附食醋中不同种类的色素；SPE淋洗液：将被SPE柱吸附的杂质淋洗出来；SPE洗脱液：将被SPE柱吸附的目标物洗脱下来。主要操作流程1）食醋样品称量：准确称取5g食醋样品；2）分离提取：使用“提取液”和“提取吸附剂”，振荡分离提取；3）萃取：取试样提取上清液进行萃取，使用“萃取管”和“萃取液”，类似于QuEChERS的操作；4）净化：使用双柱串联的“净化专用SPE柱”，上样用“SPE淋洗液”和“SPE洗脱液”进行SPE操作，洗脱液收集后旋蒸蒸干；5）残留样品用溶剂复溶，过滤后上色谱检测。1） 气相色谱柱分析柱：WM-5色谱柱，柱长30m，内径0.32mm，膜厚0.25μm，月旭科技（货号：03902-32001）；2）进样口：温度260℃，分流比1:10，进样量1μL；3）升温程序：4）检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度：280 ℃；5）载气：氮气，纯度≥99.999 %，流速2.0mL/min；6）检测色谱图：1） 液相色谱柱分析柱：Ultimate® XB-C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm，月旭科技（货号：00201-31043）；保护柱：Ultimate® XB-C18，4.6mm×10mm，5μm，月旭科技（货号：00808-04001）（配不锈钢保护柱柱套，月旭科技，货号：00808-01101）；2）流动相：A相：含1%乙酸的40%乙腈水溶液；B相：含1%乙酸的乙腈；3）梯度洗脱程序：4） 流速：1.0mL/min；5） 检测波长：260nm；6） 柱温：35℃；7） 进样体积：1~20μL（视目标物浓度而定）。8） 检测色谱图：