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各位,用标记物对蛋白质进行标记时常用EDC和NHS,有文献标记方法如下:1、先配标记液 标记物+EDC+NHS 2、用标记液对蛋白进行标记。个人现有疑问:EDC作为交联剂,主要使氨基和羧基聚合,如果标记液中EDC过量的话,再用其标记蛋白质,同时应该会使蛋白质自身的氨基和羧基发生聚合反应而降低标记效率,那有什么办法可以消除这种影响呢?希望大家指导!谢谢。顺便有啥好的标记方法请提供参考!再次感谢!
[font=宋体][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统 [/font][font=Calibri](biotin-avidin system[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]BAS)[/font][font=宋体],是[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种常用的生物反应放大系统。它具有高度特异性、敏感性、稳定性的特点,两者的亲和常数([/font][font=Calibri]K=1015 mol/L[/font][font=宋体])比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体([/font][font=Calibri]K=105[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]1011 mol/L[/font][font=宋体])至少高[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]万倍,是目前已知强度最高的非共价作用,这使得生物素标记的蛋白成为研究蛋白质相互作用和筛选抗体或小分子潜力药物的强大工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州开发了丰富的生物素标记蛋白产品,拥有[/font][font=Calibri]Avi-tag[/font][font=宋体]定点标记和化学标记两种类型的生物素标记蛋白,覆盖细胞治疗、抗体药、疫苗等热门靶点。产品具有高批间一致性、高活性等优势,适用于[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Biopanning[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SPR / BLI[/font][font=宋体]等实验。下面为大家提供生物素蛋白标记常见问题及注意事项:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素蛋白标记常见问题:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、什么是生物素标记蛋白[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在生物化学中,生物素化蛋白质就是生物素与蛋白质等大分子物质共价结合的产物。生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素亲和常数至少比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体高一万倍[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质。因此,生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统已被广泛地应用于免疫诊断技术。生物素化蛋白的出现,也为类似于[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]实验简化了流程,提高了效率。此外,由于生物素的小尺寸([/font][font=Calibri]MW = 244.31g / mol[/font][font=宋体]),不太影响蛋白质本身的天然功能。所以它同时具备了高亲和力、高特异性、高灵敏度的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、生物素标记蛋白有哪些应用?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]生物素标记蛋白广泛的应用在生物技术的众多领域。如透析,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液,[/font] [font=宋体]改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。怎么释放所需蛋白呢?这需要非常严苛的条件(例如,[/font][font=Calibri]pH=1.5[/font][font=宋体]的 [/font][font=Calibri]GuHCl[/font][font=宋体]),这种极端条件下的蛋白是会变性的。如果需要分离标记的蛋白质,最好用亚氨基生物素标记的蛋白质。该种生物素在碱性条件下与抗生物素蛋白结合紧密,但是在降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]以后,亲和力降低。因此亚氨基生物素标记蛋白可以通过降低[/font][font=Calibri]pH([/font][font=宋体]约[/font][font=Calibri]pH=4)[/font][font=宋体]从柱子上释放。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫检测中的应用:在常规[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]原理的基础上,结合生物素[/font][font=Calibri](B)[/font][font=宋体]与亲和素[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]间的高度放大作用,而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如抗体等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或抗体[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分子的目的。 这可以用于通过荧光或电子显微镜定位的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]ELISPOT[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]western[/font][font=宋体]印迹和其他免疫分析方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素标记注意事项:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的酸碱性,选择相应的活化生物素和反应条件;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例;生物素:[/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]用量比[/font][font=Calibri](mg/mg)[/font][font=宋体]宜为[/font][font=Calibri]2:1, IgG[/font][font=宋体]应用浓度[/font][font=Calibri]0.5~5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml [/font][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]1~3[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ag[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]3~5[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ab[/font][font=宋体];[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、为减少空间位阻影响,可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite][b]生物素标记蛋白[/b][/url]详情可以参看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite[/font][/font][font=宋体] [/font]
[font=宋体][font=宋体]荧光素异硫氰酸酯([/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体])是一种常用的荧光染料,它可以与蛋白质分子中的氨基、巯基或羟基等基团结合,从而实现对蛋白质的标记。[/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记的蛋白质可以用于免疫荧光、流式细胞术等实验中,具有很高的灵敏度和特异性。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]下面是[/font] [font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记蛋白的一般步骤:[/font][/font][/b][font=宋体]①准备蛋白质溶液:将需要标记的蛋白质溶解在适当的缓冲液中,使其浓度达到适当的标记浓度。[/font][font=宋体][font=宋体]②准备 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]溶液:将 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]溶解在 [/font][font=Calibri]DMSO [/font][font=宋体]中,制成浓度为 [/font][font=Calibri]1mg/mL [/font][font=宋体]的储备液。使用前,将储备液稀释到适当的标记浓度。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③标记反应:将蛋白质溶液和 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]溶液混合,使蛋白质与 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]的摩尔比为 [/font][font=Calibri]1:10 [/font][font=宋体]至 [/font][font=Calibri]1:50[/font][font=宋体]。在反应体系中加入适量的缓冲液,使总体积为 [/font][font=Calibri]100uL [/font][font=宋体]左右。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④反应条件:将反应体系置于室温或 [/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C [/font][font=宋体]下孵育 [/font][font=Calibri]1-2 [/font][font=宋体]小时,以促进标记反应的进行。[/font][/font][font=宋体]⑤终止反应:标记反应结束后,加入适量的终止液(如甘氨酸或硼酸缓冲液),以终止反应。[/font][font=宋体][font=宋体]⑥纯化标记蛋白:为了去除未结合的 [/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体],可以使用凝胶过滤、透析或离心等方法对标记蛋白进行纯化。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]⑦储存标记蛋白:将纯化后的标记蛋白储存于适当的缓冲液中,在 [/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C [/font][font=宋体]下避光保存。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]需要注意的是,[/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记蛋白的效率和特异性可能会受到多种因素的影响,如蛋白质的性质、缓冲液的组成、标记条件等。因此,在进行 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记蛋白实验时,需要对每种蛋白质进行优化,以获得最佳的标记效果。同时,在实验过程中应注意避免荧光染料的淬灭和光漂白,以保证实验结果的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]fitc[/font][font=宋体]标记蛋白常见问题解析:[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]哪些因素可能会影响[/font] [font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记蛋白的效率和特异性?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]①蛋白质的性质:不同的蛋白质具有不同的化学性质,例如等电点、亲水性、分子量等,这些性质可能会影响蛋白质与 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]的结合效率和特异性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②缓冲液的组成:缓冲液的 [/font][font=Calibri]pH [/font][font=宋体]值、离子强度、添加剂等都会影响蛋白质与 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]的结合效率和特异性。[/font][/font][font=宋体]③标记条件:标记反应的温度、时间、摩尔比等条件也会影响标记效率和特异性。[/font][font=宋体][font=宋体]④未结合的 [/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]:未结合的 [/font][font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]可能会与蛋白质发生非特异性结合,从而影响标记的特异性。[/font][/font][font=宋体]⑤荧光染料的淬灭和光漂白:荧光染料在光照下容易发生淬灭和光漂白,这可能会影响标记蛋白的荧光强度和稳定性。[/font][font=宋体][font=宋体]因此,在进行[/font] [font=Calibri]FITC [/font][font=宋体]标记蛋白实验时,需要对每种蛋白质进行优化,以获得最佳的标记效果。同时,在实验过程中应注意避免荧光染料的淬灭和光漂白,以保证实验结果的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]fitc[/font][font=宋体]标记蛋白注意事项有哪些?[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①光照控制:整个标记过程应在避光条件下进行,以减少[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]荧光淬灭的可能性。使用黑色或不透明的容器存储和操作试剂,并确保实验室内光线柔和且避免直射阳光。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②温度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调控:在标记反应过程中,严格控制温度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。过高或过低的温度都可能影响[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]与蛋白质的结合效果,而[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的波动也可能导致非特异性结合的增加。因此,应根据实验需求选择合适的反应条件,并进行严格的控制。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③蛋白质稳定性保护:在标记过程中,应采取措施保护蛋白质的稳定性。避免使用可能导致蛋白质变性或降解的试剂和条件,确保蛋白质在标记过程中保持其原有的结构和功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④去除未结合[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]的重要性:未结合的[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]可能导致背景荧光增强,从而影响实验结果的准确性。因此,在标记后应彻底去除未结合的[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]。这可以通过多次透析或离心等方法实现,确保标记后的蛋白质纯净且荧光信号清晰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白服务[/b][/url],更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag][b]重组蛋白标签[/b][/url]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-tag[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]