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大家好最近在做DNA点突变的研究,由于基因很大,有七十几个外显子,如果一一扩增测序的话成本和时间上都不划算.所以在考虑能否用质谱的方法,或者其他什么分析的方法先进行下初筛。和标样比较,如果看到了某个峰有异常的话,再专门扩增这个外显子去测序外显子一般200-300bp。想请教大家,不知道用质谱的方法可不可以?另外,国内有哪里用质谱进行DNA序列的研究的吗?我知道用MALDI-TOF-TOF这个进行SNP的研究,但是对于我们这个200-300bp来说量程上就太小了。期待大家的回答~~~~
基因定点突变,顾名思义,就是把目的基因上的一个碱基有目的的替换为另一个碱基。体外定点突变时目前分子生物学领域中一种快速有效地手段。产生定点突变操作及所需仪器简单,随着技术的发展,方法也越来越快捷简便。定点突变除了可以生成点突变,多点突变外,还可以人为产生碱基删除和添加等。体外基因定点突变是实验室中优化改造基因,研究基因功能的常用方法之一。通过改造基因序列,可以对相应氨基酸序列进行改变,进而影响蛋白质的结构和功能,探讨突变氨基酸位点在蛋白结构和功能中所起的作用。在我多年的实验中,体外基因定点突变是其中一项重要的内容。在这里,我与大家分享一下我的实验方法和心得体会。多年来,我所采用的基因定点突变的方法主要有三种,这可能也包括了目前所有的定点突变的方法。基因定点突变使用的主要仪器就是PCR扩增仪(biometra),而这是每一个分子生物学实验室的必需品,也就是大家吃饭的家伙。下面从繁到简对我所采用的突变方法进行一下简单描述。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212032022_409068_1306303_3.jpg我所使用过的定点突变方法简单的说就是三步,两步和一步PCR法。三步PCR法是我早期在实验室使用的定点突变方法。利用三步PCR法构建一个点突变,需要4条PCR引物:L1,L2,R1和R2。L1和R1是目的基因5‘和3‘端的引物,分别包含起始和终止密码子。突变点设计在引物L2和R2的正中间位置,L2和R2是完全互补的两条PCR引物,长度一般在28-40 bp之间,推荐长度31-35 bp,这样可以保证突变的两边有效搭在一起。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212032026_409072_1306303_3.jpg三轮PCR均采用常规PCR反应条件,第一轮分别以L1和R2,L2和R1扩增获得目的片段L和R。第二轮PCR,不需要引物,仅加入模板L和R各100 nmol,进行约20 轮的PCR反应,获得产物m1。第三轮PCR以m1为模板,L1和R1为引物进行PCR扩增。最终得到目的产物m。得到的PCR产物进行克隆转化得到进一步扩增,便获得了突变的目的基因。在随后的实验中,我将三步PCR法简化为两步法PCR。两步法PCR和三步法PCR一样,需要引物四条,引物设计也与三步法相同,只是在第一轮PCR获得产物L和R之后不再单独进行第二轮PCR,而直接在PCR体系中加入等mol的产物L和R
8 kb)的原理我上面已经说了,只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话,那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务,大约是改一个点1000元左右。