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蛋白质的翻译后修饰常常会影响蛋白质的结构和功能,反映在生物制药工业上,会对药品的安全性和有效性产生重大影响。翻译后修饰常常表现为电荷变异体,因此电荷异构体的分析成为了质量控制的一个关键项。目前常见的电荷异构体分析方法为IEF/cIEF或iCIEF,可以鉴别生物药,对生物药的纯度进行分析,测定电荷异构体的等电点以及各种异构体的分布。但是,等电聚焦或者毛细管等电聚焦存在很多短板,最明显的就是无法大规模制备异构体。美国基因泰克公司的科学家曾经用一种叫做自由流电泳的工具,高分辨率高通量大规模对单抗的电荷异构体进行分离制备,并结合各种分析手段,对每一个异构体进行了深度表征。现分享论文如下,欢迎大家讨论!
[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E5%8D%95%E5%85%8B%E9%9A%86%E6%8A%97%E4%BD%93&zhida_source=entity&is_preview=1]单克隆抗体[/url]在生产及存储过程中会由于抗体分子自身性质、环境应力、储存方式等因素,而发生复杂的[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E7%BF%BB%E8%AF%91%E5%90%8E%E4%BF%AE%E9%A5%B0&zhida_source=entity&is_preview=1]翻译后修饰[/url],如氧化、脱酰胺、糖基化、C末端赖氨酸切除、N末端[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E7%84%A6%E8%B0%B7%E6%B0%A8%E9%85%B8&zhida_source=entity&is_preview=1]焦谷氨酸[/url]化、降解/聚合等,造成抗体在电荷分布方面高度的异质性。电荷异构体的产生会影响抗体药物的结合能力、生物学活性、免疫原性以及结构稳定性等,进而影响抗体药物的[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E8%8D%AF%E7%89%A9%E4%BB%A3%E8%B0%A2%E5%8A%A8%E5%8A%9B%E5%AD%A6&zhida_source=entity&is_preview=1]药物代谢动力学[/url]、安全性和有效性。电荷变化的复杂性常常给评估完整的电荷变化概况带来巨大的挑战。 目前,有多种方式(IEX-HPLC、FFE、icIEF等)对电荷异构体进行馏分收集,从而进一步对产品进行表征。奕安济世生物药业[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E7%90%86%E5%8C%96%E5%88%86%E6%9E%90&zhida_source=entity&is_preview=1]理化分析[/url]平台具有成熟的IEX-HPLC馏分收集技术,可获得较高的目标收集组分含量,馏分收集纯度1(IEX-HPLC)可达85%以上。收集装置如图1所示,主要是由HPLC和馏分[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E6%94%B6%E9%9B%86%E5%99%A8&zhida_source=entity&is_preview=1]收集器[/url]串联组成。 [img=,564,573]https://pic3.zhimg.com/80/v2-78e01950668b0065dab04fab05ee789c_720w.webp[/img] 图1. IEX-HPLC馏分收集系统 为提高馏分收集效率,前期一般需要在所用原始分析方法(IEX-HPLC)基础上进行优化,在保持主洗脱梯度程序不变的情况下,缩短方法的平衡时间,增加进样质量。其中,在不改变[url=https://zhida.zhihu.com/search?q=%E8%BF%9B%E6%A0%B7%E5%99%A8&zhida_source=entity&is_preview=1]进样器[/url]定量环体积基础上,通过叠加多次进样然后一次洗脱的方式以增加进样质量,可大大提高目标组分的收集效率。图2展示了不同进样质量的CEX-HPLC色谱图,单次进样/洗脱的抗体质量可达9 mg。 [img=,1080,607]https://pic3.zhimg.com/80/v2-46cd62d44d255c528a3f8bcee8f154dc_720w.webp[/img] 图2. 叠加进样及收集区域 为了提高目标组分的收集效率,采用进样9 mg的抗体质量进行馏分收集,收集区域如图2(下)所示。将盲收2得到的馏分样品结合二次精制的方式,再经系列换液、浓缩,最终得到的目标收集组分经CEX-HPLC检测图谱如图3所示,馏分收集纯度见表1。其中第二个碱性峰的(Basic Fraction 2)由于发生N端焦谷氨酸环化,导致其收集纯度降低,其余馏分收集样品纯度可达90%以上。 [img=,1080,514]https://pic3.zhimg.com/80/v2-b788cb0eeea822394cc29c8fa691b362_720w.webp[/img] 图3. 馏分收集样品CEX-HPLC检测结果叠图 表1. 馏分收集纯度 [img=,799,344]https://pica.zhimg.com/80/v2-543c0452a10c60c5842ac68703621d3c_720w.webp[/img] 馏分收集样品的纯度达到后续表征研究要求后,需对其进行储存条件进行稳定性评估。以确保其质量在表征研究过程中,未发生明显改变。馏分收集后的样品将进一步用于表征研究,对CQA评估、工艺变更、产品批次间差异、质量标准制定等具有重要的指导意义。
[b]题目:Using direct CIEF-MS and prep-CIEF for MS-characterization of protein isoforms, [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] analysis, peptide mapping and other techniques日期:2019年10月10日时间:9:00am(北京时间)注册链接:[/b][url=https://view6.workcast.net/register?cpak=1381226141481492&referrer=SelectScience-promo1][b]https://view6.workcast.net/register?cpak=1381226141481492&referrer=SelectScience-promo1[/b][/url][b]演讲人:Neusüß 教授(阿伦大学):分享有关iCIEF-MS在蛋白质异构体表征中的应用Sö nksen博士(Novo Nordisk):使用iCIEF进行组份收集蛋白药物电荷异构体,随后进行肽图和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]分析黄博士(AES Lifesciences):在演讲之前解释运行此类实验所需的仪器装置[img=,591,655]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909281419303948_2613_4004818_3.jpg!w591x655.jpg[/img][/b]