定量蛋白质组学

中科院计算所究团队与董梦秋实验室合作，成功开发了定量蛋白质组学数据解析软件，用计算方法排除干扰信号的影响、提高肽段和蛋白质的定量准确度并对每个定量值进行准确性评价。 　　基于质谱的定量蛋白质组学是现代生物学技术的生长点之一，用于测量复杂生物体系中蛋白质及其翻译后修饰在不同条件下的丰度变化，是研究蛋白质功 能和药物作用机制的重要工具。已有的定量软件往往不能有效排除干扰信号，定量值的计算方法有待完善，而且缺乏准确性评价，致使输出结果&ldquo 鱼龙混杂&rdquo ，引起 的假阳和假阴两方面的困扰都比较严重。 　为了更好地解决问题，开发者研究了几百个可疑定量值的原始质谱图和色谱图数据，找原因、攒经验，充分挖掘肽段的质谱、色谱信号特点以及从肽段定量到蛋白 质定量的方法，灵活应用各种组合和统计算法，建立了一整套非常细致的数据分析流程。为了验证软件的性能，董梦秋实验室的同学通过轻重SILAC或 14N／15N标记哺乳动物细胞或细菌，从10：1到1：10按不同比例混合得到14套标准样品，产生了14套测试数据集。 测试结果表明，定量结果的准确性明显超过定量蛋白质组学领域的两个主流软件Census和MaxQuant，主要表现在输出的非数比值数目（即 不能定量的部分）占总比值数目的0.01&ndash 0.5%，远低于Census的MaxQuant的对应比例2.5&ndash 10.7%和 1.8&ndash 2.7%；Census和MaxQuant输出了许多不准确结果，其定量值的标准差是软件的1.3&ndash 2倍；给出了肽段和蛋白质定量比值的置信区 间，而Census和MaxQuant没有准确性评价。目前，该研究工作得到了科技部、基金委、中科院和北京市政府的资助。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

p 　　简介： /p p 　　1999年，Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun)，其基本技术路线是针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶(Trypsin)酶解成肽段混合物，然后对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离和串联质谱分析以及数据库检索，从而确定蛋白质的种类，可同时鉴定成百上千种蛋白质。他们把这种思路称为多维蛋白质鉴定技术，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。与传统的双向电泳技术相比具有灵敏度更高，动态检测范围更广等特点。 /p p 　　鸟枪法(shotgun)可以分析全细胞裂解样品和组织抽提物，也可以分析亚细胞分级组分、分离的细胞器等其他亚蛋白质组。如果样品已经过稳定同位素标记。根据不同标记的信号强度比例就可以精确确定化学上具有均一性的蛋白在不同样品中的相对丰度，这种多重分析可以利用在谱图上产生前后次序的质量标记得以完成。质谱分析以前在样品中加入同位素标记的某种质量校准肽，通过对此肽的相对定量就可以获得绝对定量的信息。实现目的肽段的绝对定量，而这一性质可以被充分应用以提供临床诊断的标准值或阈值。 /p p 　　差异蛋白质的定量研究是基于肽段水平而非完整的蛋白质，成为该技术最大的技术特色，该技术实现了样品分离与鉴定直接联合，完全自动化操作，可以用于各种蛋白质混合物的蛋白质组学分析，如血清、组织、各种体液以及尿液等。 /p p 　　技术路线： /p p 　　鸟枪法为基因组测序，是先将基因组打断，分段测序， 然后利用计算机重组在一起。从而确定一段的基因序列。 /p p 　　鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似，首先将蛋白质混合物酶解成肽段的混合物， 利用质谱进行分析确定该肽段的氨基酸序列，然后计算机根据设定好的运算法则根据肽段的信息在理论蛋白质数据库中检索出这些蛋白质，从而确定该混合物中的蛋白质成分。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.gif" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/130ae366-baaa-4006-9cf4-2c70b8441925.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" 2.gif" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/fe437d70-d969-4f29-a6c9-4e8e1d3e7b65.jpg" / /p p 　　分析目标： /p p 　　寻找差异表达蛋白，并分析蛋白功能。 /p p 　　Gene ontology分析 /p p 　　GO数据库包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG(有向无环图)的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。 /p p 　　对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology功能分析。对差异表达的所有基因向gene ontology数据库的各节点映射。计算每个节点的基因数目，并结合整个数据库的基因作为背景分部，对于每个节点，得到一个2x2的表格，使用超几何分布检验基因在每个GO节点的富集或贫乏程度。 /p p 　　Pathway enrichment分析 /p p 　　找出差异表达基因在生物学通路中的位置，以阐明其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。 /p p 　　1)把差异表达基因定位在生物学通路(Pathway)上。 /p p 　　2)统计分析，确定差异基因可否可以代表某些生物学通路 /p p 　　优点：信息量大，样本量低，检测低丰度蛋白更多，相对定量 /p p 　　应用领域： /p p 　　1)差异蛋白组分析(疾病早期诊断、疗效监测) /p p 　　2)细胞差异性分析(如正义转染vs空载、目标基因RNAi vs空载) /p p 　　3)疾病标志检测(肿瘤标志物，如无血清培养后的分泌蛋白质组) /p p 　　4)治疗检测(术前vs术后) /p p 　　5)药物开发(给药vs对照) /p p 　　6)癌症研究(原位肿瘤细胞系vs转移) /p p 　　Shotgun法可以检测动态范围10000:1内的低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最主要的技术路线。 现已成功应用于中大规模蛋白质的分离鉴定，不再依赖于双向凝胶电泳。 /p p 　　因大部分蛋白质在酶解后总有部分肽段是可用质谱鉴定的，因此，多维蛋白质鉴定技术弥补了碱性、疏水蛋白质、相对分子量极大和极小蛋白质在分离和鉴定方法上的不足。 /p p 　　该方法可达到对低丰度蛋白、极端等电点、分子量、完整膜蛋白具有与其他蛋白有相同的灵敏度。 如鸟枪法可鉴定出10个跨膜域以上的膜蛋白，而2DE仅能检测出2~4个跨膜域的。 /p p 　　Shotgun法可实现自动化、快速、高通量的蛋白组学分析。 /p p 　　但Shotgun法数据冗余复杂，需要专业人员进行分析。 /p p 　　在医学领域，Shotgun技术可用于以下方面： /p p 　　除血清血浆外，还可用于研究体液及组织的蛋白组 /p p 　　分泌蛋白组 /p p 　　大脑皮层神经元细胞蛋白组 /p p 　　新生物标记物的发现 /p p 　　疫苗研究，分析感染源的表面蛋白质，从而发现潜在的抗原。如，在分析人类疟疾致病源plasmodium falciparum时，发现了大量潜在的抗原, 目前这些抗原的特性巳经被评估出来。 /p p 　　发现新的药靶。如，研究发现甲硫氨酸氨基肤酶是肿瘤生长抑制因子bengmide的分子作用靶点。 /p p 　　部分参考文献： /p p 　　1)A proteomics approach to discovering natural products and their biosynthetic pathways, Stefanie B Bumpus, Bradley S Evans, Paul M Thomas, Ioanna Ntai1, Neil L Kelleher, Nature Biotechnology,27,951-956,2009 /p p 　　2)High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes, Paola Picotti, Oliver Rinner, Robert Stallmach, Franziska Dautel, Terry Farrah, Bruno Domon, Holger Wenschuh, Ruedi Aebersold, Nature Methods 7, 43-46 (6 December 2009) /p p 　　3)Large-scale analysis of the yeast proteome by means of multidimensional protein identification technology, M.P. Washburn, D. Wolters and J. R. YatesNature Biotechnology, 19, 242-247, 2001 /p p 　　4)Comparison of alternativeanalyticaltechniques for the characterisationof thehuman serumproteomein HUPO Plasma ProteomeProject, XiaohaiLi, Xiaohong Qian etc. Proteomics, 5, 3423–3441,2005 /p p 　　5)An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics, Dirk A. Wolters, Michael P. Washburn, and John R. Yates, Anal. Chem., 73 (23), 5683-5690, 2001 /p p & nbsp /p