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[align=left][font='times new roman'][size=16px]磷脂分离分析方法[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]及难点[/size][/font][/align]磷脂的极端复杂性和低丰度问题使其可靠的分离带来了一定的困难,进一步深入研究其生物学功能,磷脂仍然是一个重要研究目标。早期的磷脂分析方法常采用络合光度法和比色法对磷脂总量进行检测和质量分析,该方法不能实现单一组分的分析检测。近年来,薄层色谱法(TLC)、高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法(HPLC)和质谱法(MS)等新型分离分析技术用于磷脂的分离分析研究。TLC是最早应用于磷脂分离分析的一种方法,由于具有操作简便和样品处理量大等优势特点一直使用至今。TLC的主要缺点是其仅对同一类别的磷脂具有分离效果,无法对单一类别磷脂中分子种属进行分离分析。在TLC分析过程中,磷脂分子完全暴露在空气中,会导致部分不饱和脂肪酸氧化,使结果产生偏差。HPLC是近年来广泛采用的磷脂分离分析技术,这种分离分析技术能够实现对不同类别和种属关系磷脂的分离,进而对复杂磷脂具有很好的分离效果。在HPLC分离磷脂时,对于不同类的磷脂多采用正相色谱(NPLC);对于同一类不同种属关系的磷脂往往采用反相色谱(RPLC)进行分离。随着HPLC技术的不断发展,二维高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]在磷脂的分离分析中的优势越来越明显,可以通过色谱柱的选择对磷脂的分子类别和种属实现双重分离。例如,Zhang等建立了一种离线二维混合模式结合反相高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法分析复杂样品中脂质的方法。在第一维色谱中,按照中性脂类到极性脂类的洗脱顺序,22种不同的脂类可成功被硅胶色谱柱分离;在第二维色谱中,根据脂酰基链的长度和不饱和程度,采用反相C30色谱柱分离,从而进一步提高了分离效率。HPLC虽然是目前最常采用的磷脂分离技术,但对于磷脂的定性鉴别还存在较大的困难。HPLC与MS联用技术是目前磷脂鉴定最常用的技术,电喷雾电离技术(ESI)是磷脂质谱分析中最常用的离子源。HPLC-ESI-MS技术联用可以有效降低复杂样品中基质的干扰,提高磷脂的定性鉴别能力。例如,Kim等利用二醇基正相色谱柱建立了NPLC-ESI-MS定量和定性分析新方法,可从大鼠心脏和骨骼肌线粒体中检测到7类磷脂,包括PE、PC、PA、PI、PS、心磷脂(CL)和单溶血心磷脂(MLCL),并对除PS以外的所有磷脂进行定量分析,显示出良好的重现性和准确性。[align=left][font='times new roman'][size=16px]1.1.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]磷脂分离分析的难点[/size][/font][/align]首先,磷脂在细胞功能中发挥着细胞屏障、信号传递和能量库等多种功能,细胞脂质非常复杂,有着数以百计的分子物种。细胞脂质在生命活动中也是高度动态的,细胞膜将细胞彼此分离,包围细胞器,并将细胞器细分成更小的隔间。以这种方式,细胞膜在细胞内产生了许多不同的环境,这些环境中发生着不同的生化反应,因此细胞脂质随着细胞所处的环境不断发生着变化。最后,磷脂分子具有多种多样的异构体,这进一步增加了磷脂分离鉴定的挑战性。如图所示,以PC([color=#000000]36:1[/color])为例介绍磷脂可能存在的异构体。PC存在的主要异构体形式包括sn位置同分异构体、双键位置异构体、双键顺反同分异构体和R/S手性对映体。此外,生物样品中磷脂成分复杂、种类多样且含量极低以及磷脂结构中很少存在易电离基团等特性使得磷脂的定量分析存在困难。利用衍生化技术对磷脂进行后修饰,可提高磷脂的离子化效率,使得定量分析效率提高。[align=center][/align][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211162152007402_7183_5389809_3.png[/img][/align][align=center][size=13px]图[/size][size=13px] [/size][size=13px]脂质分子异构体形式[/size][/align][align=center][/align]
[align=center][font='times new roman'][size=16px]磷脂分离分析[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]方法[/size][/font][/align] 2003年,Han等正式提出了脂质组学的概念,即对生物样品中脂质进行全面的系统分析,并以此为依据推测其他与脂质作用的生物分子的变化,进而阐明脂质在各种生命现象中的作用机制。脂质尤其是磷脂,是细胞膜的关键组分,磷脂代谢的改变对细胞膜结构有深远的影响,尤其是癌细胞需要更多的膜来实现快速增殖。因此,膜磷脂的含量、磷脂代谢物水平和磷脂谱的变化[font='times new roman'][sup][size=16px][99][/size][/sup][/font]通常被确定为癌症发展进程的标志,此外,磷脂代谢的改变也与糖尿病、人体衰老与肥胖有关。基于磷脂重要的生理与病理功能,需要快速、准确的分离分析手段实现对其的定性与定量分析,进而阐明其组分变化对机体的影响,为临床诊断和治疗提供重要依据。 磷脂分子是由亲水性头基和亲脂性/疏水性尾基组成,根据亲水性头基的取代基团的不同又可分为PC、PE、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)等。目前,磷脂分离分析面临的主要挑战包括两方面,一方面是磷脂本身复杂和多样的结构信息,包括类别、脂肪酰基种类、脂肪酰基sn-位置和脂肪酰基中的C=C位置/几何形状(即顺式/反式)等,导致其识别与鉴定的难度很大。另一方面是分离分析工具与技术的限制。最初用于脂质组学的分析方法是基于质谱的鸟枪法,即直接将样品注入到质谱仪中,尽管该方法具有简便高效的优点,但是会导致样品中的杂质包括盐、极性代谢物和蛋白质等对脂质的电离造成影响,影响信号的稳定,最终会影响质谱的检测结果。此外,这些杂质也会污染质谱仪。近年来,高灵敏度和特异性的高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱(HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url])法成功弥补了鸟枪法的缺陷。由于在质谱分析之前增加了色谱分离过程,一方面可以有效减少样品中杂质的影响,另一方面基于其分离能力,可以将磷脂按照类别与种类进行初步的分离,减少了后续质谱分析的基质效应和离子抑制效应,大大改善了磷脂的分离分析效果。 色谱固定相作为HPLC的核心组成,发挥着至关重要作用。开发新型色谱固定相是脂质组学的重要研究方向之一。例如,Liang等以半胱氨酸为衍生化试剂,合成了苯乙烯马来酸共聚物色谱固定相Sil-SMA-amino acid,填充Sil-SMA-amino acid色谱柱对于亲疏水性的小分子具有良好的分离性能,同时该色谱柱具有RPLC/HILIC/IEC的混合模式保留机制,成功实现了部分PC和PE标准品的种类分离,并成功应用于胃癌细胞脂质提取物的分离分析,表现出了一定的应用潜力。Liu等以三辛基膦和烯丙基溴为原料合成了膦基离子液体三辛基(烯丙基)溴化膦([P[font='times new roman'][sub][size=16px]888Allyl[/size][/sub][/font]]Br)。以[P[font='times new roman'][sub][size=16px]888Allyl[/size][/sub][/font]]Br为聚合单体,通过点击化学反应合成了聚膦离子液体功能化二氧化硅球(PIL@SiO[font='times new roman'][sub][size=16px]2[/size][/sub][/font])。PIL@SiO[font='times new roman'][sub][size=16px]2[/size][/sub][/font]填充色谱柱表现出RPLC/HILIC混合模式分离特点,可在较短的时间内实现核酸碱基与核苷类、磺胺类、酰胺类和苯胺类物质的快速分离,具有良好的分离选择性。其对于磷脂标准品的分离效果优于商业化的氨基柱,并可用于磷脂类别与种类的同时分离分析。此外,也实现了大豆卵磷脂的快速分离分析。
§19.1概述在实际分析工作中,遇到的样品往往含有多种组分,进行测定时彼此发生干扰,不仅影响分析结果的准确度,甚至无法进行测定.为了消除干扰,比较简单的方法是控制分析条件或采用适当的掩蔽剂.但是在许多情况下,仅仅控制分析条件或加入掩蔽剂,不能消除干扰,还必须把被测元素与干扰组分分离以后才能进行测定.所以定量分离是分析化学的重要内容之一.在痕量分析中,试样中的被测元素含量很低,如饮用水中Cu2+的含量不能超过0.1mg/L,Cr(Ⅵ)的含量不能超过0.65 mg/L等.这样低的含量直接用一般方法是难以测定,因此可以在分离的同时把被测组分富集起来,然后进行测定.所以分离的过程也同时起到富集的作用,提高测定方法的灵敏度.一种分离方法的分离效果,是否符合定量分析的要求,可通过回收率和分离率的大小来判断,例如,当分离物质A时,回收率RA=分离前A的质量/分离前A的质量×100%式中RA表示被分离组分回收的完全程度.在分离过程中,RA越大(最大接近于1)分离效果越好.常量组分的分析,要求RA≥0.99 微量组分的分析,要求RA≥0.95 如果被分离组分含量极低(例如0.001-0.0001%),则RA≥0.95就可以满足要求.如果在分离时,是为了将物质与物质分离开来.则希望两者分离得越完全越好,其分离效果可用分离因数SB/A表示.SB/A=RB/RA式中: SB/A表示分离的完全程度.在分离过程中,SB/A越小,分离效果越好.对常量组分的分析,一般要求SB/A≤10-3 对痕量组分的分析,一般要求SB/A=10-6左右.§19.2试样的处预理一,试样的分解强酸消化,干法灰化后溶于酸,浸取法,氧瓶燃烧法.二,生物试样的保存