高级生物显微镜

由中国生物物理学会、中科院生物物理研究所、清华大学和FEI 公司联合主办的第一次中国结构生物学冷冻电镜培训班(Get acquainted with Cryo-Electron Microscopy：First Chinese Workshop for Structural Biologists)于2015 年5 月29 日-6 月3 日在北京顺利举行。本次培训班主任由中科院生物物理所孙飞研究员、清华大学王宏伟教授和美国FEI公司Marc Storms博士担任，讲授队伍来自中科院生物物理所、清华大学、北京大学、中科院上海生化细胞所、中国科技大学、英国剑桥大学LMB实验室和FEI公司等工作在冷冻电镜一线的教授和工程师们，并精心地为学员们准备了包括讲义、课件、学习资料、实习材料和数据在内的教学材料。本次培训班得到了FEI公司的独家赞助和大力支持。　　作为生物大分子结构研究的手段之一，冷冻电子显微镜三维重构技术，尤其是单颗粒三维重构技术(SPA)，近期取得了非常瞩目的成果。近两年来，利用SPA技术解析的重要生物大分子复合体层出不穷，分辨率也日益提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI公司进行合作，利用中科院生物物理研究所和清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微平台，联合发起了此次培训班，旨在为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论和技术的机会，系统地将冷冻电镜前沿技术带给国内的相关研究人员，特别是X射线晶体学、NMR等非电镜领域的专家学者和学生们。这无疑将极大地推动我国冷冻电镜和结构生物学领域的发展。　　培训班为期四天，包括上午讲座报告、下午实际操作和上机实习、以及晚上的答疑讨论会。来自全国百余学员参加了此次培训活动。5月30日上午，北京大学的尹长城教授对冷冻电镜的发展历史、现状进行总结并对未来的发展进行展望，提出电镜技术已经进入&ldquo 黄金时代&rdquo 。随后，清华大学的王宏伟教授和中国科技大学的蔡刚教授分别对负染色和冷冻两种电镜制样方法进行了非常详尽的介绍。5月31日上午，清华大学的雷建林教授详细讲解了透射电子显微镜(TEM)的光学系统、成像原理等关键理论，FEI公司的应用工程师王庆博士则介绍了如何操作电镜，如何进行拍照成像等具体的工作流程。6月1日上午，清华大学的高宁教授介绍了如何评估电镜数据质量，李雪明教授介绍了目前最前沿的直接电子探测相机技术及其相关的motion 校准技术，英国MRC的白晓晨博士分享了解析高分辨率电镜结构涉及到从前期制样到后期图像处理的大量技术细节。利用前三天下午的实习操作时间，学员们不仅零距离看到工程师们现场演示制作电镜样品和电镜操作，而且还亲自练习制样方法并实际操作电镜。6月2日，中科院生物物理所的孙飞研究员、中科院上海生化细胞所的丛尧教授介绍了单颗粒三维重构的基础知识和原理，中科院生物物理所的朱平研究员系统讲解了如何对重构结果进行分析和展示。2日下午学员们在老师们的指导下上机练习了两个冷冻电镜三维重构软件EMAN2和Relion，对三维重构的流程有了更加直观的认识。除此之外，每天晚上的讨论会，学员们都带着问题来的，互动交流的主动性很高，积极发言，深入讨论，将白天所学知识消化掌握，反响很好。　　(中国结构生物学冷冻电镜培训班)　　国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会(International Workshop of Advanced Image Processing of Cryo-Electron Microscopy 2015)由清华大学隋森芳教授担任组委会主席，由清华大学王宏伟教授、中科院生物物理所孙飞研究员共同担任执行主席，于2015 年6月3日-6 月7日在北京顺利举行。教师队伍来自MRC分子生物学实验室(英国)、Brandeis University(美国)、University of Colorado Boulder(美国)、脑科学MPI 研究所(德国)、University of Basel(瑞士)等多所国外大学与研究机构。研讨会为期五天，包括上午讲座报告、下午软件操作与上机实习、及晚上的答疑讨论会，围绕近原子分辨率单颗粒重构技术、三维模型建立与精修、电子断层扫描与sub-tomo平均计算等主要议题，分别就DED图像的信息分析与处理方法、单颗粒锐化及电子密度图校正、低分辨率冷冻电镜图像的模型建立与验证、冷冻电镜图谱原子模型的搭建、近原子分辨率冷冻电镜图谱的结构细化与验证、电子断层扫描技术的理论与原理、电子断层扫描数据采集与处理中重要影响因素、sub-tomo平均计算的流程与应用、及其理论、方法与前景等多项话题展开深入的交流与细节探讨。来自日本、印度、美国等多个国家一百四十余名学员参加了本次研讨会，反响热烈。　　(国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会)　　作为生物大分子结构研究的重要手段之一，冷冻电子显微镜技术近年来取得了非常瞩目的成果，分辨率获得极大提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI等公司进行合作，利用中科院生物物理研究所与清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微镜平台，联合发起中国结构生物学冷冻电镜培训班与国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会，不仅为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论与技术的机会，同时为电镜结构生物学领域青年科学家们系统地介绍冷冻电镜前沿技术与图像处理最新研究方法与进展，积极促进国际交流与合作，极大的推动我国冷冻电子显微镜和结构生物学领域的进步与发展。

来自美国霍华德休斯医学研究所，Janelia研究园的科学家们，借助其发展的新光学超分辨率成像技术，在前所未有的高分辨率条件下研究了活体细胞内的动态生物过程。他们的新方法显著的提高了结构光照明显微镜(structuredilluminationmicroscopy，SIM)的分辨率，一种最适合活体超分辨成像的技术。　　 　　新技术所拍摄的视频生动地展现了细胞内蛋白质的运动和相互作用。它们帮助生物学家理解细胞是怎样改变它们之间的依存结构，以及重整细胞膜结构使得细胞外的分子可以被吸收到细胞内。来自Janelia研究园的研究员EricBetzig博士，李栋博士后*和他们的同事们基于原有的SIM显微镜原理新发展了两种新的超分辨率成像技术。超分辨率光学显微成像技术能够跨越理论的分辨率极限，在极高的分辨率下展现细胞内的精细结构。但是，到目前为止，超分辨率显微镜技术却依然不能进行有效的活体细胞成像。　　“这些方法设立了超分辨率光学显微镜的成像速度和非侵入特性的新标准，它们使得超分辨率活体细胞成像成为现实。”Betzig博士说道。在传统的SIM显微镜中，物镜下的物体被非均匀的结构光(类似于条纹码)所照明。在实验中，几束不同的结构光用来照明物体，它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔条纹被相机依次采集。然后计算机提取摩尔条纹编码的信息并将其解码生成三维的高分辨率图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨率。　　Betzig博士和其他两位科学家因为发展超分辨率荧光显微镜而被授予2014年诺贝尔化学奖。他说道，SIM显微镜技术之所以没有得到像其它方法那样多的关注，是因为其它技术能够提供比两倍更高的分辨率改进效果。但是，他强调SIM拥有两大其它的超分辨率方法所没有的优势。这些其它方法包括了两种去年获得诺贝尔奖表彰的技术：他和同事HaraldHess博士于2006年开发的光激活定位显微镜(photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)，和受激辐射耗尽(stimulatedemissiondepletion，STED)显微镜。但是，这两种技术都需要过多或过强的光来照明样品，以至于荧光蛋白很快被漂白，细胞样品很快被损害，从而不可能长时间进行成像。然而，SIM在这些方面不一样，“我爱上了SIM，因为它的速度很快，而且它所需的照明光强度远远小于其它方法。”Betzig博士说道。　　Betzig博士在2011年MatsGustafsson博士去世后不久开始与SIM相关的研究。Gustafsson博士是SIM技术的先驱之一，生前也是Janelia的研究员。Betzig博士那时已经深信SIM有潜力为解析细胞内部的工作机理提供重要的见解，如果SIM的空间分辨率可以被提高，它对于生物研究的可用性将被大大增强。　　在生前，Gustafsson博士和博士生HesperRego发展了一种利用饱和耗尽(saturateddepletion)的非线性SIM技术，但这种技术在改进分辨率的同时需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的优势。Betzig博士想到了一种可以避免这些缺陷的方法。　　饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开关过程中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生图像的过程是，首先把所有的荧光蛋白分子激活到可发光的状态(亮态)，然后用一束结构光把大部份的亮态分子反激活到暗态。通过结构光反激活之后，仅有少数处于结构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些光调控过程提供了物体的高空间频率信息，从而让图像更加清晰。这一过程需要重复25或更多次才能产生最终的高分辨率图像。Betzig博士说道，这一原理非常类似于STED或另一种与其相关的叫做RESOLFT的超分辨率技术的原理。　　这一技术并不适合于活体成像，因为激活和反激活荧光蛋白需要很长的时间。另外，反复的光照明会对细胞和荧光蛋白本身造成损伤。Betzig博士说道，“这一技术的问题在于你首先用光激活了所有的荧光蛋白分子，然后你马上又用另一束光反激活了大部份分子。这些被反激活的分子对最终的图像没有任何贡献，但却被你用光“油炸”了两次。你让分子承受了很大“压力”，并且花了很多你并没有的时间，因为这段时间内细胞在运动。”　　解决方法其实很简单，Betzig博士说道：“没有必要激活所有的分子。”在Betzig研究小组新发展的结构光激活非线性SIM的技术中，一开始用结构光只激活样品里的一部分荧光蛋白分子。“这一结构光激活过程已经给你一些高分辨率的信息了。”Betzig博士解释道。另外一束结构光用于反激活分子，额外的信息可以在反激活的过程中同时被读出。两个结构光叠加的效应给与最终图像62纳米的分辨率，这一结果好于原始的SIM，并且把由光波长决定的传统分辨率极限改进了三倍。　　“我们能够做到快速地超高分辨率成像。”Betzig博士说道。这很重要，他补充道，因为对于动态过程，单纯提高空间分辨率而没有相应地提高成像速度是没有意义的。“如果细胞内部有的结构以1微米每秒的速度运动，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒内采集图像。但如果我有1/10微米的分辨率，那么我就必需在1/10秒内采集图像，不然图像将变得模糊。”Betzig博士解释道。　　结构光激活非线性SIM可在1/3秒内采集25幅原始图像，并从中重建出一幅高分辨率图像。它的图像采集很高效，只需用较低的照明光强，并且收集每一个亮态荧光蛋白分子所携带的信息。从而有效地保护了荧光分子，使得显微镜能够进行更长时间的成像，让科学家们可以观测到更多的动态活动。　　Betzig博士的团队利用结构光激活非线性SIM获得了在细胞运动和改变形状的过程中骨架蛋白的解体和自身再组装过程，以及在细胞膜表面的叫做caveolae的微小内吞体动态过程的影像。　　在Science论文里，Betzig博士的团队也利用了已经商业化的高数值孔径物镜将传统SIM的空间分辨率提高到84纳米。高数值孔径限制了被光照明的样品范围，从而降低了光对细胞以及荧光蛋白分子的损伤。这一方法可以同时对多个颜色通道进行成像，使得科学家们可以同时跟踪几种不同蛋白质的活动。　　通过高数值孔径的方法，Betzig博士的团队观测了多个骨架蛋白质在形成粘着斑(链接细胞内外的物理链)过程中的运动和相互作用。他们也追踪了clathrin修饰的内吞体的成长和内吞过程(内吞体将细胞外的分子转移到细胞内)。他们的定量分析回答了几个不能被以往的成像技术所解决的问题，例如，内吞体的分布，以及内吞体尺寸和寿命之间的关系。最后，通过结合高数值孔径方法和结构光激活非线性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨率条件同时追踪两种蛋白质的活动。　　Betzig博士的团队在进一步提高他们的SIM技术。他们也急切地盼望和生物学家一起探索潜在的应用并进一步改进这一技术的可用性。　　现在，科学家们可以通过现在，科学家们可以通过JaneliaJanelia的高级成像中心利用这些新的的高级成像中心利用这些新的SIMSIM技术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，技术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，BetzigBetzig博士说道，使得博士说道，使得SIMSIM成为能够被其他实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”成为能够被其他实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”

欢迎您参加由北京大学生命科学学院公共仪器中心和国家蛋白质科学研究设施（北京）北大分中心平台于7月17日--22日举办的生物显微成像培训班。第一届生物显微成像专题研讨会生物显微成像是生命科学研究中的重要工具。近年来，北京大学在超分辨成像领域取得了一系列突破性进展，在超灵敏快速活细胞超分辨成像、单分子超分辨成像、偏振结构光超分辨成像、长时程STED超分辨活细胞成像等多个方向取得新突破。超分辨成像技术的一个关键环节——荧光探针和标记过程对于超分辨成像的实现必不可少，我校多个新型荧光探针的开发助力超分辨成像的分辨率提高，促进活细胞超分辨成像的可行性。另外，光学成像平台通过多标-超多标标记结合光谱成像或循环成像，拓展了单细胞原位空间蛋白组学的应用。在生物力学方面，光学成像平台的生物型原子力显微镜Bio-AFM可对生物样品进行高分辨扫描成像以及力学性质的测定，流体力单细胞显微操作系统FluidFM可实现单细胞注射、活细胞内物质抽提、粘附力测定等功能，助力生物学与力学、材料学等多学科的交叉融合。北京大学生命科学学院公共仪器中心成立于2009年，目前已发展到7个平台：光学成像平台、电镜平台、流式平台、蛋白质核心支撑平台、质谱平台、离心机平台、同位素室。其中多个平台同时承担国家蛋白质科学研究设施（北京）北大分中心平台的运行管理任务。光学成像平台目前有Leica STED 3X超分辨显微镜、Nikon N-SIM超分辨显微镜、OMX SR活细胞超分辨、Live SR转盘共聚焦超分辨、Bio-AFM生物型原子力显微镜、FluidFM流体力单细胞显微操作系统、Zeiss Light Sheet光片显微镜、高内涵显微镜、PhenoCycler Fusion单细胞空间蛋白组学分析平台等20多台大型光学成像设备。为了分享光学显微成像领域的最近进展，促进其应用，光学成像平台举办第二届生物显微成像高级研讨班。此次培训内容包括授课和实验操作两个部分。理论讲述部分，我们邀请到超分辨率显微成像、活细胞快速成像、荧光探针及荧光蛋白、单细胞空间蛋白组学技术等领域的知名学者做深入的课堂讲述；实验操作部分，将以专题的形式进行超高分辨显微系统搭建、超高分辨率技术的应用、超分辨率活细胞成像、高端显微成像技术应用、基于成像的单细胞空间组学技术、生物型原子力显微镜、流体力单细胞显微操作系统等内容的实验操作培训。此次培训班由北京大学生命科学学院和国家蛋白质科学研究设施（北京）北大分中心主办，全程完成培训的学员颁发北京大学结业证。