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各位老师好!希望大家都能讲讲你们在做肉组织中β-受体激动剂的经验,最近自己感觉在这个项目上遇到瓶颈了。现将自己的一些疑惑列举出来,和大家一起探讨。1、利用农业部1025-18-2008标准-----检测β-受体激动剂。外标回收率真的是惨不忍睹啊! 不知道大家的经验呢?2、我改用内标校准定,只有三种内标,实验性的选择了一下:西马特罗--克伦特罗内标;特布他林----沙丁胺醇内标;非诺特罗----沙丁胺醇内标;氯丙那林-----莱克多巴胺内标;妥布特罗----克伦特罗内标;以上几个的校准加标回收率都很不错,尤其在猪尿中回收率都很好90%以上,但是在肉中回收率不太稳定,大家有何高见?你们做这9中参数内标是怎么对应的啊?3、喷布特罗我用三种内标进行了5六次的加标回收实验,喷布特罗用莱克多巴胺和克伦特罗做内标,回收率都20%以下,用沙丁胺醇做内标,回收率都在200%以上了。总的来说,提点建议或意见?4、我想请教一下:乙酸乙酯提取和叔丁基甲醚提取有什么不同呢?(克伦特罗,沙丁胺醇,莱克多巴胺,特布他林,西马特罗,氯丙那林,非诺特罗,喷布特罗,妥布特罗)为什么不能用一种试剂呢,难道是两种提取的瘦肉精种类不一样吗?
β-受体激动剂是一类人工合成的肾上腺激动剂,俗称“瘦肉精”,在动物体内会提高其瘦肉率,但使用含有瘦肉精的肉类,将对人体造成极大伤害。我国相关法律法规规定禁止在生猪等食源性动物养殖过程中使用β-受体激动剂类药物。β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类衍生物,根据苯环上取代基的差异,可分为苯胺型和苯酚型。苯胺结构的化合物,轭合反应率和蛋白结合率低;苯酚结构的化合物轭合代谢过程较强,药物进入人或动物体内后,通过糖苷键结合参与代谢,转换为葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物。所以β-受体激动剂的检测通常需要酶水解步骤,β-葡萄糖醛酸酶是一种可以使葡糖醛酸苷键加水分解的酶,它可以把葡萄糖醛酸轭合物或硫酸轭合物的糖苷键切断,释放出游离态。目前,检测β-受体激动剂通常参照GB-T22286-2008方法,具体检测流程为:称量2g样品 — 加50μl酶水解12小时 - 添加内标物 - 振荡提取15min - 离心10min(5000r/min) - 移取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL,混合均匀 - 高氯酸调节PH值至1±0.3 - 离心10min(5000r/min) - 移取全部上清液至新的离心管中,用10mol/L的氢氧化钠溶液调PH至11 - 加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯(6: 4)混合溶液,充分提取 - 离心10min(5000r/min)- 取全部有机液氮气吹干 - 加5 mL乙酸钠缓冲液(pH 5.2)复溶残渣 - 净化样品 - UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS检测。在β-受体激动剂检测过程中,酶水解是检测中的关键步骤之一,然而12小时的酶水解时间严重影响了工作效率,所以选择一种合适的酶,提高水解效率是需要解决的问题。目前,市场上的β-葡萄糖醛酸酶一般提取自鲍鱼,蜗牛,大肠杆菌,还有IMCSzyme生物工程改良的β-葡萄糖醛酸酶,相较其他同类产品,IMCSzyme活性、纯度得到显著提高。 IMCSzyme 不仅能缩短酶解反应时间、简化后期纯化步骤,其高纯度也大大降低了对检测仪器的干扰和损害。下面我们就用实验来验证IMCSzymeβ-葡萄糖醛酸酶的性能。参照GB-T22286-2008方法,做IMCSzyme β-葡萄糖醛酸酶与蜗牛β-葡萄糖醛酸酶对比实验。分别取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g,加入0.2 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.2) 8 mL,蜗牛β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃放置12 h;另取沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品各2 g,加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL,IMCSzyme β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃放置12 h;酶解反应后,样品前处理并净化,最后UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS检测。结果如图1所示,含沙丁胺醇和特布他林的阳性鸡肉样品经蜗牛β-葡萄糖醛酸酶酶解处理的测定结果分别为8.62 μg/L和9.66 μg/L;经IMCSzyme水解测定结果分别为10.7 μg/kg和13.17 μg/kg;结果表明,采用相同的酶用量和酶解时间,IMCSzyme对底物的水解效率高于蜗牛β-葡萄糖醛酸酶。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106041039356819_1444_2617624_3.png[/img][/align][align=center][color=black]图1 不同酶制剂水解效率的比较[/color][/align]采用IMCSzymeβ-葡萄糖醛酸酶水解样品,实验设计了2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h水解时间,考察水解效率。实验步骤:分别取含沙丁胺醇和特布他林阳性鸡肉样品2 g,加入快速水解缓冲液(pH 7.4) 8 mL,IMCSzyme β-葡萄糖醛酸酶50 μL,37 ℃分别放置2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h,酶解反应后,按照GB-T22286-2008方法进行处理并净化,UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS检测。结果如图2所示,由图表明沙丁胺醇、特布他林水解2h,水解产物逐渐增多;水解2-8h,水解产物变化不大,水解超过8h,水解产物开始降解。由此推断2小时已水解已基本完成。[align=center][img=,446,267]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106041041150241_6306_2617624_3.png!w446x267.jpg[/img][/align][align=center]图2 IMCSzyme不同时间水解效率对比[/align]综上述实验可得,使用[font=宋体]IMCSzyme[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]β-葡萄糖醛酸酶水解样品只需2小时就能水解完全,这大大的缩短了β-受体激动剂水解时间,提高了检测效率。[/font]
目前国内整治瘦肉精事件是否只检测克仑特罗的呢?相关部门是用的什么仪器做的?一般β-受体激动剂除了克仑特罗以外还包括沙丁胺醇、特布他林、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、妥布特罗、喷布特罗、心得安等等这些,你测了几种了呢?这些可以同时检测吗?