实时荧光定量

实时荧光定量PCR数据中的基本概念：在整个扩增过程中会出现基线期，指数期，线性期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长，但是在基线期我们没办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的CT值就成了计算模板含量的关键值。▲ 图一：线性图谱▲ 图二：对数图谱为什么知道CT值就能够得到最初的目标基因含量呢？如图三，表示一个基因单次扩增曲线。N为扩增产物的分子数，模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物的分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此PCR理论方程只在指数期成立，也就是图三绿色框的部分。▲ 图三数据处理：以下三张图分别表示我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线、标准曲线、溶解曲线。1、绝对定量：使用一系列稀释的已知浓度的标准品与未知样本同时进行测定，根据系列浓度标准品的CT值与起始模板量之间的线性比例关系。注意事项：☑ 标准品必须来源可靠，浓度已知。☑ 标准品要和待测样品同时在仪器中扩增。☑ 只能根据标准品覆盖的浓度范围进行待测样本浓度的推测。2、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品之间的表达差异或目标在不同时相差的表达差异，也就是倍数差异。Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统来自美国Azure Biosystems公司，以创新服务于生命科学为愿景。Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统融合了高品质Peltier温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，为您的科学研究提供高精准、高灵敏的可靠结果。Azure Cielo 3/6检测通道，可根据实验需求灵活配置。同时配有10.3触控系统，主机本身可独立运行、连接、远程交互，让您随时随地知悉实验进程和及时获得实验结果。

仪器信息网讯 2011年3月23日德国耶拿分析仪器有限公司在中国科学院遗传与发育生物学研究所举办了“高速实时荧光定量PCR体验交流会”。来自高校和科研院所的专家和技术人员50余人参加了这次体验交流会。出席体验交流会的还有德国耶拿公司中国区总经理赵泰先生、生命科学中国区经理诸建先生等。 　　在体验交流会之前，诸建先生首先向大家介绍了德国耶拿公司的历史及发展现状。耶拿公司的原子吸收光谱仪、紫外可见分光光度计、元素分析仪、总有机碳分析仪等产品在中国市场上有着广泛的知名度，并且占据了很大的市场份额，尤其2004年耶拿公司在世界上首次推出连续光源火焰原子吸收光谱仪，只需一个高能量氙灯光源，即可测量元素周期表中67个金属元素，是原子光谱仪划时代的革命性技术。 德国耶拿分析仪器有限公司生命科学中国区经理 诸建先生 　　但大家对德国耶拿公司的生命科学仪器产品的认识并不多，在诸建先生的介绍中大家进一步了解了耶拿公司的生命科学仪器的发展历史以及其技术特点。德国耶拿公司在2000年级开始了生命科学业务，2002年推出了第一款生命科学类仪器。尤其在2009年，德国耶拿公司收购了Cybio和Biometra公司，德国Biometra公司是欧洲最大的一家专业生产分子生物学仪器厂家，所提供的产品中包括高端PCR仪。所以此次体验会主要展示的仪器高速实时荧光定量PCR仪qTOWER的设计中就融合了Biometra公司的一些先进技术。 德国耶拿分析仪器有限公司中国区总经理 赵泰先生 　　据赵泰先生介绍，2010年，德国耶拿公司在中国组建了生命科学团队，开始在中国市场大力向生化仪器领域扩张。此次举办的高速实时荧光定量PCR体验会即是该系列市场拓展活动之一。“百闻不如一见”，将仪器拿到现场展示给用户，让用户亲眼目睹实际样品的测定过程，会引起用户浓厚的兴趣，进一步展示德国耶拿仪器的高品质和独特性能。 　　在体验交流会上，首先由德国耶拿公司的工程师吴潇韫女士详细介绍了高速实时荧光定量PCR仪qTOWER和全自动液体处理工作站FasTrans的性能、构造和特点等。 德国耶拿分析仪器有限公司 吴潇韫女士 　　高速实时荧光定量PCR仪qTOWER可以解决当今定量PCR实验面临的挑战，即缩短定量PCR检测时间、降低定量PCR实验成本、确保定量PCR实验结果的可靠性。 　　对比传统的实时荧光定量PCR，qTOWER的实验速度提高10倍 　　qTOWER采用低缘紧凑型的镀金纯银样品槽，其高效的热传导功能使热能利用率高。通过高效、长寿命的peltier元件控温，能够实现12°C/sec的升温速率和8°C/sec的降温速率。 　　SAC专利技术，使样品管壁能够向皮肤一样和样品槽紧密贴合，使模块的温度与反应管中液体的温度保持一致，热传导效率高达90%以上。综合以上多项技术，最快可在20分钟内完成40个循环的96孔四通道荧光定量PCR反应。 　　qTOWER的能耗大约是其它同类产品的五分之一 　　qTOWER整个PCR反应体系只需5-20ul样品，最低5ul体系即可进行荧光定量PCR检测，可实现微量样品的检测。另外，qTOWER不需要特殊的荧光定量PCR试剂，用户可自由选择常规的各种荧光定量PCR试剂。节约了样品和试剂，尤其节约了较昂贵的荧光定量PCR试剂，qTOWER大大降低了实验成本。 　　由于qTOWER高效的能量利用效率、节省的工作时间、样品体积少等特点，其耗电量最多能够减少95%，所以它每年只消耗100KWh (一年220天计算，每天运行4个程序)。 德国耶拿分析仪器有限公司工程师Matthias先生现场演示仪器的操作并进行相关实验 　　在大家详细了解了qTOWER的技术特点之后，由来自德国的工程师Matthias先生现场演示了qTOWER以及全自动液体处理工作站FasTrans的操作并进行相关实验。 　　通过这一次的高速实时荧光定量PCR体验交流活动，让更多的生命工作者了解德国耶拿的生命科学产品和先进技术，让更多的实验室对德国耶拿公司的qTOWER等先进生命科学仪器产生了兴趣，在应用实时荧光定量PCR技术上又添新选择。 用户对德国耶拿公司的产品非常感兴趣 体验交流会最后举行了抽奖活动 　　德国耶拿公司举行的“高速实时荧光定量PCR体验会”系列活动的首站于2011年3月16日在上海展开，16日-18日期间分别在中科院上海生命科学研究院、复旦大学和上海交通大学成功举办了三场。3月22日，“高速实时荧光定量PCR体验会”来到了北京，在中国农业大学成功举办了北京站的首次活动。23日在中国科学院遗传与发育生物学研究所体验会结束后，将转战天津进行本系列活动的最后一站。德国耶拿公司的“高速实时荧光定量PCR体验会”系列活动吸引了大批生命科学工作者的参与，取得良好的效果。 在中国农业大学成功举办“高速实时荧光定量PCR体验会”的现场

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。qPCR 原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。那在我们了解了qPCR的原理之后，我们接下来就要了解一下这几个我们在做实时荧光定量PCR的实验时，一定要清楚的知道的几个概念：CT值、扩增曲线、基线、荧光阈值和阈值循环数01Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。02扩增曲线（amplification curve）是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。03基线（baseline）是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。04荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。05阈值循环数表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小 起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。06荧光化学目前，实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。那我们要如何选择qPCR的检测方法呢？下面我就列出他们各自的优缺点，大家可以参考一下！ qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量qPCR常见问题分析1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。6. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解