外源质粒

第一节概述 　　把一个有用的目的DN***段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。　　利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。　　质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DN***段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。　　从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DN***段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

质粒提取柱（大中/硅胶膜）CommaAffin™质粒中提柱http://www.biocomma.cn/images/nucleic-11.jpg产品组成外管医疗级PP，15ml，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，用来收集离心液。内管医疗级PP，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，底部鲁尔接口设计，方便离心液收集。直径11.0mm筛板特殊 纤维材料 ，在高速离心过程中，支撑硅胶膜，保证硅胶膜的完整性，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，厚度仅为0.3-0.5mm，孔径50um，孔隙率只有不到百分之二十，相比市场上同类产品，比面积小，静电小，DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um，高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA，低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP，固定筛板与硅胶膜。CommaAffin™质粒大提柱http://www.biocomma.cn/images/nucleic-3.jpg产品组成外管医疗级PP，50ml，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，用来收集离心液。内管医疗级PP，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，底部鲁尔接口设计，方便离心液收集。直径24.0mm筛板特殊 纤维材料 ，在高速离心过程中，支撑硅胶膜，保证硅胶膜的完整性，耐受酸碱和大部分的 有机溶剂 ，厚度仅为0.3-0.5mm，孔径50um，孔隙率只有不到百分之二十，相比市场上同类产品，比面积小，静电小，DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um，高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA，低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP，固定筛板与硅胶膜。CommaAffin™核酸中/大提柱可用在核酸提取过程（见图1）中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中核酸吸附量：CommaAffin™质粒中提柱：0-100ug 规格：15ml离心管+吸附柱CommaAffin™质粒大提柱：0-500ug 规格：50ml离心管+吸附柱 http://www.biocomma.cn/images/nucleic-7.jpg 图1 质粒提取过程适用范围：核酸提取原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改 变溶液环境使DN A溶解到纯水或TE中。质粒DNA提取：抽提缓冲液，或者结合液中需要胍盐（如硫氰酸胍等） 辅助DNA吸附到膜上。【注意事项】 1.上柱前溶液的PH值应小于7；2.洗涤液中的乙醇浓度不得低于50%，一般55%--80%之间。3.最后洗脱，可以用去离子水或者TE（10 mmol/LTris-Cl，1 mmol/L EDTA (pH8.0)）。如果长期保存DNA，建议使用TE。订购信息Cat#品名柱管规格包装004407质粒中提过滤管20ml50套/包004410质粒中提过滤管30ml50套/包004416质粒大提过滤管60ml20套/包

名称：质粒房工作守则关键词：质粒目的：操作规范化，减少污染！主体内容：一、 常规操作1、 进入质粒房须换专用工作服，自己的白大衣或厚外套可脱在门外的衣帽架上；2、 工作时尽量避免交谈，无实验时少在其中逗留；3、 请勿随意调节培养箱和摇床的温度，以免对他人实验造成影响。如实验确实需要调动温度，应公告他人；4、 超净工作台勿用酒精擦洗，使用前可用紫外灭菌10分钟，使用后清理干净；5、 枪头、废液请分开放置，实验完成后枪头倒于垃圾桶，废液倒于洗手间的卫生专用池，并将垃圾杯冲洗干净；6、 做完实验后，试剂用品等放回原处，台面及时清理干净；7、 用过的培养瓶、培养皿和无用的菌液等请及时清理；8、 感受态细胞和培养液等常用试剂快用完时请及时通知值日生。二、 值日生工作职责1、 每周值日生时间从周六开始，至下周五结束；2、 在周六周日或之前准备好灭菌的枪头、离心管（包括0.5、1.5、10和50ml）、培养皿和培养基（一般固体200ml、液体300ml）等常用物品；3、 及时制作酒精棉球，给酒精灯添加酒精，及时清理垃圾；4、 及时做好公用试剂的配制工作，如50％甘油、70％乙醇、Solution I、II、III、10N NaOH和10％SDS等；5、 每周督促他人清理冰箱中各自废弃物品，每周全面清理打扫质粒房一次，紫外灭菌一次（30分钟）。三、 常用试剂的配制1、 Solution I：50mM Glucose，25mM Tris-HCL（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0），灭菌后存于4℃；2、 Solution II：0.2N NaOH，1％ SDS（现配现用）；3、 Solution III：5M 乙酸钾 60ml，冰乙酸11.5ml，加水到100ml即可；4、 LB：25g LB粉加水1000ml，固体LB加入1.5-1.7g琼脂粉/100ml即可，分装灭菌，4℃保存；5、 Ampi：配成100mg/ml的母液，存于-20℃，使用浓度为100ug/ul；Kana：配成100mg/ml的母液，存于-20℃，使用浓度为50ug/ul。