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药物杂质是药物活性成分(原料药)或药物制剂中不希望存在的化学成分,会对用药的安全性和有效性带来隐患,因此杂质的检测是保证药物质量至关重要的部分,FDA、EMEA、PMDA、CFDA等各国药品监管部门制定了相应的指导原则对其进行严格管控。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512141737_577892_3005330_3.jpg 独有的四极杆静电场轨道阱Q Exactive™ Focus高分辨液质联用技术,凭其高灵敏度、高专属性和高准确性的分析能力,可对样品中药物杂质进行全面的信息采集。结合新一代的智能小分子化合物鉴定软件Compound Discoverer™,以高度灵活的自定义方式制定分析工作流程,对数据中的目标和非目标杂质进行提取、比对及鉴定,工作流程如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512141737_577893_3005330_3.jpg 通过软件对样品数据的分析和提取,在Compound Discoverer中可以直观、便捷的查看和筛选预期和未知的杂质分析结果,从结果界面中可获得不同条件下样品杂质的变化情况,获得所有杂质保留时间、一级质谱、同位素和二级质谱等丰富信息:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512141738_577894_3005330_3.jpg 在获得母药和杂质的一级和二级质谱信息后,软件将调用碎裂数据库(Fragmentation Library)快速的对泮托拉唑的碎片结构进行归属,该数据库几乎涵盖了所有已发表的文献,保证了碎片解析的准确性。在此研究结果之上,通过软件对杂质与母药二级质谱信息之间的比对,可进一步对杂质变化位点进行推测。在本例中,通过152、185等共有碎片和200、216等特征差异碎片的比对,推测出该杂质为泮托拉唑砜:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512141738_577895_3005330_3.jpg 基于新一代四极杆-静电场轨道阱质谱Q Exactive Focus和新一代小分子化合物分析软件Compound Discoverer,建立了药物杂质鉴定的新流程。无论是优质数据的有效获取,还是获取后对已知和未知杂质的分析鉴定,该工作流程都可以完美的实现。在本例中,共鉴定到泮托拉唑杂质15个,其中可能的降解杂质9个,可能的工艺杂质6个,为药物杂质的质量控制、安全性评估提供了富有价值的信息。(分享)
[font='times new roman'][size=14px]药物靶蛋白鉴定方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非蛋白质组学鉴定方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非蛋白质组学的传统药物靶蛋白鉴定方法,如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的迁徙分析等方法,通常耗时、耗力且不适合进行高流通量的筛选。目前,所使用的技术包括:第一,蛋白鉴定的图象分析,利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量,未被修饰的小蛋白错误率大约[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]30%[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],而翻译后修饰蛋白错误率更高,故需联合其他技术完成鉴定;第二,微量测序,首先使经凝胶分离的蛋白直接印迹在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]PVDF [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]膜,经过一系列操作后将其置于测序仪中进行蛋白质鉴定,但该方法仍然存在一些缺点,如由于酸性水解或者部分降解而产生氨基酸的变异,故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]化学蛋白质组学方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]化学蛋白质组学方法一般先将小分子化合物通过与蛋白质溶液反应,使化学探针或小分子化合物与固相联接,得到被修饰的固相微球,然后利用合适的分离技术将这些蛋白质纯化,结合[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]分析,得到靶蛋白的信息。[/size][/font][font='宋体']亲和色谱法[/font][font='times new roman'][size=14px]亲和色谱法是化学蛋白质组学策略中较为经典的方法之一,它主要应用于研究蛋[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]白质与生物活性小分子或蛋白质与蛋白质的相互作用[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px][17][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]。该方法通过官能团将配体结合在固相基质中,然后与蛋白质孵育,此时与配体结合的蛋白会留在基质上,最后通[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]过变性或与自由配体竞争将结合蛋白洗脱下来,再通过凝胶电泳或者[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]进行分[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]析。该方法的缺陷在于所研究分子衍生物活性不确定、材料配体结合力差异性以及非特异性吸附都将会干扰研究结果。[/size][/font][font='宋体']基于活性的化学蛋白质组学技术[/font][font='times new roman'][size=14px]基于活性的化学蛋白质组学技术([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])是广泛使用的技术之一。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是由美国的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Cravatt[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]课题组在[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]2002 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]年首次提出,最早用于酶谱分析,之后被应用于药物靶蛋白筛选。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术的关键是合成同时带有反应基团和标记物的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]探针,可进一步与待测的蛋白质发生相互反应。药物靶点筛选领域设计的[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]探针通常包括三[/size][/font][align=center][font='times new roman'][size=14px]3[/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][size=14px]个功能部分:反应基团、连接基团和报告基团。与二维凝胶电泳法([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]2-DE[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])、同位素编码亲和标签([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ICAT[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])等技术相比,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术着重研究蛋白质的表达和功能,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]可从天然蛋白质组样品中直接筛选出与小分子特异性结合的蛋白质,从而能更直接快速地明确小分子和蛋白质之间的相互作用,确定小分子的作用靶点,这对于筛选具有低亲和力的靶蛋白极为有利。另外,根据富集和鉴定策略的不同,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ABPP [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]技术可分为竞争性标记方法和生物正交的探针模拟物标记方法。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.%2.%3 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]非化学修饰的蛋白质组学方法[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.1.%3.%4 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在过去[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]20 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]年中,热位移分析([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])已成为最广泛使用的无修饰药物靶点发现方法之一。这种方法简单直接,但探针无法区分不同的蛋白质,因此[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TSA [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]仅适用于纯化蛋白质的实验。为了规避这个问题,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Molina [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]等人开发了一种概念上相似的技术,称为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]C[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],用于直接研究细胞环境中的药物[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]靶标相互作用。如图[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]A[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])所示,细胞裂解物或完整细胞的多个等分试样首先用药物或载体处理,加热到不同的温度并冷却,然后通过离心分离出可溶性部分。随着温度的升高,蛋白质逐渐展开以暴露疏水核,导致蛋白质在高温下沉淀。蛋白质越稳定,蛋白质对热诱导沉淀的抵抗力越高,因此,可以测定可溶性蛋白质随温度变化的稳定性曲线。例如,该[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/antifolate][font='times new roman'][size=14px]方法通过叶酸[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]抗癌药物[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/methotrexate][font='times new roman'][size=14px]甲氨蝶呤[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]与[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/dihydrofolates][font='times new roman'][size=14px]二氢叶酸[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]还原酶的结合、雷替曲塞与胸苷酸合成酶的结合进行了药物靶标的验证。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]是一种允许研究活细胞中药物靶点的方法。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]结合小分子库可用于筛选潜在抑制剂、评估靶标参与效率和监测靶标特异性。此外,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]CETSA[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]还可用于筛选[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]新药和表型化合物的靶点,解决脱靶蛋白、结合机制、药物疗效和完整细胞耐药性等[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]问题。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]1.2.%3.%4 [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])首先将蛋白在有或无活性小分子情况下孵育,并加热到不同的温度以诱导蛋白变性,剩余的可溶性蛋白用缓冲液提取。如图所示,在每个温度下,可溶性蛋白通过高分辨质谱进行量化,画出变性曲线,进一步测[/size][/font][align=center][font='times new roman'][size=14px]4[/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][size=14px]定热稳定性和识别配体引起的变化。其中,[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]50% [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]蛋白发生聚沉时的温度为[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]Tm[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]melting temp[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]e[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]r[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]a[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]tur[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]e[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],通过对比加药前后[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]T[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]m[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]的变化,确定活性分子的靶蛋白。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]TPP[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]可以[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]通过定量[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]MS [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]分析,在蛋白质组水平评估活细胞中活性分子与蛋白结合的情况。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]图[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]A[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]细胞热位移测定和[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]B[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]热蛋白组学分析简要工作流程[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][14][/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物亲和反应的靶点稳定性技术[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物亲和反应的靶点稳定性技术([/size][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px])是一种鉴定药物靶标的新方法。药物[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]与靶蛋白结合后,靶蛋白对蛋白酶的敏感性降低,与对照组相比,药物结合蛋白更不[/size][/font][url=https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/protein-hydrolysis][font='times new roman'][size=14px]易水解[/size][/font][/url][font='times new roman'][size=14px]。这种差异可通过蛋白凝胶电泳和质谱等技术对差异蛋白进行鉴定,可以确定[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]药物直接作用的靶点蛋白[/size][/font][font='times new roman'][size=14px],最大优势是不需要对药物进行任何化学修饰,即可以确定药物的直接结合蛋白。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]在天然小分子靶点的鉴定中发挥了重要的作用,例如[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]对[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]ecumicin[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]、白藜芦醇[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]([/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]resveratrol [/size][/font][font='times new roman'][size=14px])[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]等多种天然产物蛋白靶点的鉴定[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]。但[/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]DARTS[/size][/font][font='times new roman'][size=14px] [/size][/font][font='times new roman'][size=14px]也存在局限性,例如细胞裂解液中的低丰度蛋白的鉴定和非特异性结合会导致[/size][/font][font='times new roman'][size=14px]蛋白对蛋白酶的敏感性升高增加。利用这一特性,研究者还开发了药物亲和力响应靶稳定性的方法用于药物靶点筛选。[/size][/font]
红外光谱KBr压片法鉴定药物结构