婴幼儿奶粉中双氰胺

ZIC® -HILIC色谱柱快速检测婴幼儿奶粉中双氰胺 默克密理博应用实验室 2013-01-29 1 前言 2013 年1 月，新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺(二氰二氨Dicyanodiamide，DCD），已经下令禁售含有DCD的奶制品。中国的进口奶粉八成来自新西兰，全球60%以上的奶源产自新西兰。新西兰奶农通常会在牧草上喷洒双氰胺，防止肥料中的副产品硝酸盐流入河流和湖泊。 双氰胺 目前，还没有相应的食品含量标准和检测标准。默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。双氰胺极性较强，易溶于水，中性及酸性条件下易电离，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC® -HILIC)色谱柱分离。同时，双氰胺在218nm下有强紫外吸收，可以采用ZIC® -HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行快速分析，亦可在LC-MS/MS进行痕量检测。 2 仪器及试剂 2.1 仪器设备 2.1.1 色谱柱：ZIC® -HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 &mu m, 200 Å （1.50458.0001） 2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC(DAD检测器) 2.1.3 单道移液器Transferpette® S，Digital adjustable 500-5000ul（Brand：BR704782） 2.1.4 微孔滤膜:0.45um,PTFE(Millipore：SLFHX13NL) 2.1.5 纯水系统:Milli-Q3（Millipore） 2.1.6 PP离心管：50mL,带盖，含底座（货号:114822BR） 2.2 试剂 2.2.1 色谱乙腈:LichroSolv® Acetonitrile Gradient Grade（1.00030.4008） 2.2.2 乙酸铵：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.01116.1000） 2.2.3 甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（1.00264.1000） 2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超纯水中 2.2.5 乙腈-甲酸溶液：取700ml乙腈（2.2.1）,与300ml 甲酸溶液（2.2.4）混合 3 实验方法 3.1 样品处理 方法1: 取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管（2.1.6）中，加18mL 2%的甲酸水溶液，加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，放入离心机中离心（4000转），20分钟。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加盖密闭，振摇60秒，吸取溶液，过滤，即得供试液。 方法2： 取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，静置，吸取上层溶液，过滤，即得供试液。 加标样品同法配制。 3.2 测试条件 3.2.1 色谱条件 流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液（10 mM）,B-乙腈 比例*：A:B=12：88 流速:1 mL/min 进样量：20ul *必要时设置如下方法对色谱柱进行再生和平衡： 时间，min % % 流速 ml/min 0 12 88 1 等度 10 12 88 1 等度 10.5 30 70 2 再生 15 30 70 2 再生 15.1 12 88 2 平衡 20 2 88 2 平衡 3.3 测试结果 按照方法1处理，结果如下： 3.3.1 对照品图谱 图1 对照品图谱(DCD浓度1.25ug/ml) 双氰胺保留时间4.98min,理论塔板数13086,拖尾因子1.1. 3.3.2 无检出的奶粉空白 图2 配方奶粉空白 3.3.3 奶粉加标 图3 奶粉加标（测试液中加入的标样浓度:5ug/ml） 图4 奶粉加标（测试液中加入的标样浓度：0.05ug/ml） 3.3.4 某知名品牌奶粉 图5 某进口奶源的知名品牌奶粉图谱 该品牌奶粉中未检出双氰胺. 4 结论 采用ZIC® -HILIC色谱柱，可用于双氰胺的快速检测。处理方法简单，色谱峰型良好，方法重现性良好（RSD 100 0 0.400 equilibration 16.0-24.9 100 0 0.600 equilibration 24.9-25.0 100 0 0.400 equilibration 详细方法可参考： FDA Laboratory Information Bulletin 4487 Journal of Chromatography A 1220 (2012) 101&ndash 107 更多详情，请拨打默克密理博实验室基础业务 400-889-1988

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质&mdash &mdash 双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。 1 实验部分 1.1 仪器、试剂与材料 高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。 双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。 1.2 实验步骤 称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22&mu m微孔滤膜，待测。 注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； 2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。 1.3　实验条件 1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： 色谱柱：Venusil® HILIC（5&mu m，100Å ，4.6*250mm）； 流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85； 波长：220nm；进样量：10µ l；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。 1.3.2LC-MS/MS法： （1）色谱条件： 色谱柱：Venusil® HILIC（ 5&mu m，100Å ，2.1*150mm）； 流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0） B：乙腈； 进样量：10µ L；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。 表2 流动相梯度程序 时间，min A% B% 0 10 90 0.4 50 50 1.8 50 50 1.9 10 90 7 10 90 *备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。 （2）质谱条件： 质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。 表3双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/68.1 71 10 41 6 85.1/43.1 71 10 41 6 注：带&ldquo ____&rdquo 的监测离子对为定量离子对。 2.结果与讨论 2.1 高效液相色谱法： 2.1.1双氰胺的液相色谱图 2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µ g/g，1µ g/g，2µ g/g，5.0µ g/mL和10µ g/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4： 表4 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺5.57min Y=108.16X+27.827 0.9971 0.5µ g/g 2.1.3准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5 表5 0.5µ g/g添加回收实验结果（HPLC法） 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.3% 85.5% 89.1% 85.63% 3.97% 2.2 LC-MS/MS法 2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图 2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6： 表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺 2.25min Y=3859.1X+23694 0.9900 2ng/g 2.2.3准确度和精密度 选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。 表7 10ng/g添加回收实验结果 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.5% 83.5% 89.3% 85.2% 4.31% 3.产品订货信息 产品名称 规格型号 货号 新一代 MAS-QuChERS-双氰胺净化管（填料量加大，更适合婴幼儿奶粉等复杂样品） 500mg/15mL，50支/包 MS-SQA02 MAS-QuChERS-双氰胺净化管 100mg/2mL，50支/包 MS-SQA01 Venusil HILIC液相色谱柱 4.6*250mm，5&mu m，100Å VH952505-0 2.1*150mm，5&mu m，100Å VH951502-0 Clarinert微孔滤膜 Nylon（通用） 尼龙0.22&mu m，直径50mm, 100/Pk AM025020 Clarinert 针式过滤器 Nylon（通用） 尼龙0.22um， 直径13mm，200/pk AS021320 双氰胺对照品 500mg /瓶，含量&ge 99.0% DCD-0001 1g /瓶，含量&ge 99.0% DCD-0002 离心管 50mL，带螺纹盖，25个/包 LXG0050 一次性注射器 5mL,100/pk ZSQ-5ML

在两家公司同时停牌5天后，蒙牛昨天(6月18日)下午不出意料地宣布了收购雅士利的消息。 　　但在这场中国乳业并购第一案后，远不只是两家企业一个愿买一个愿卖那么简单。“大家长”工信部正在依国务院意图，大刀阔斧地整合国内婴幼儿奶粉市场。在政府的引导下，婴幼儿奶粉领域的大鱼吃小鱼的游戏才刚刚开始。 　　不管愿意与否，规模较小的企业将不得不出局。即便雅士利的婴幼儿奶粉年营收在2012年已达到37亿元，但也只相当于蒙牛总营收的十分之一。 　　这场政府主导的自上而下的婴幼儿奶粉行业整合的方法之一，是将在严苛而昂贵的技术改造中，优先给予兼并重组企业资金支持。这意味着，蒙牛这样得到政府认可的乳业巨头，将会成为婴幼儿奶粉市场的霸主。 　　婴幼儿奶粉行业被诟病已久，企业和政府花费数年才平复了三聚氰胺丑闻。今年3月，香港奶粉限购令引发连锁反应，也让国内奶粉业者尴尬不已。5月底国务院常务会议后，工信部决定让整合提速——在蒙牛宣布收购雅士利当天，120余家婴幼儿企业代表来到北京，聆听工信部对最新政策的解读之余，被要求效仿蒙牛、雅士利现场“相亲”。 　　工信部的目的是改变中国婴幼儿奶粉市场竞争混乱、潜在食品安全风险难以把控的局面。但就蒙牛收购雅士利的个案，担忧已现：一家食品质量安全声誉劣迹斑斑的公司，将主导一家比它声誉更好的婴幼儿奶粉品牌的未来。 　　小公司出局：婴幼儿奶粉引入制药标准 　　6月18日，蒙牛乳业与雅士利联合宣布，蒙牛乳业向雅士利所有股东发出要约收购，并获得控股股东张氏国际和第二大股东凯雷接受要约的不可撤销承诺，承诺出售合计约75.3%的股权。此次交易有可能涉及的最大现金量将超过110亿港元，这是迄今为止，中国乳业最大规模的一次并购。 　　这次交易背后，是由工信部“看得见的手”对行业进行的洗牌，“扶大弃小”为整体思路的政策调控呼之欲出。 　　5月31日，国务院召开常务会议，提出按照药品管理办法监管婴幼儿奶粉质量，即GMP改造。工信部也发布《提高乳粉质量水平 提振社会消费信心行动方案》，这份被简称为“双提”的行动方案，第一步行动就是从6月到8月，针对婴幼儿乳粉企业进行质量安全检查。 　　这些“前奏”，拉开了自上而下的整合大幕。而资金支持，构成了官方促成整合的“杀手锏”。 　　GMP是国际药品生产质量管理的通用准则，是专用性、强制性的标准，多数国家或地区的GMP都具有法律效力，其所规定内容不得增删。这和目前企业实施的ISO9000认证系统不同，后者的实施是建立在企业自愿基础上的。 　　更重要的是，这是一项昂贵的改造。 　　工信部消费品工业司司长王黎明核算了技术改造成本：“初步测算，GMP规范改造大概盈亏界点是1000吨。1000吨以下的乳粉生产企业，就基本不赚钱了，或者还要亏一点。”在婴幼儿配方乳粉生产全行业实施GMP过程中，政策和资金支持将被优先给予兼并重组企业。 　　18日，消费品工业司副巡视员高伏明确表示：“在政策规定和资金方面的支持，优先支持兼并重组企业和转产企业开展GMP改造 重点支持加强奶源源头控制，发展自有基地及延伸产业链的企业。计划利用两年时间，使清理整顿后的行业生产企业，全部完成GMP改造并通过认证。” 　　不过，GMP改造资金支持如何计算及支付，未被公布。18日下午，工信部单独组织了企业代表座谈会。 　　工信部提议：127婴幼儿奶粉企业现场谈并购 　　目前，全国有婴幼儿配方乳粉生产企业127家，年产量约60万吨。其中，年产量在3万吨以上的企业仅有3家，分别是伊利、完达山和飞鹤。国产婴幼儿配方乳粉品牌仅占高端产品份额的20%到25%。按照工信部的要求，将两年时间培育形成10家年销售收入超过20亿集团，将行业集中度提高到70%以上。 　　目前，由工信部牵头制订的兼并重组工作实施方案，正在研究中。这不是政府部门第一次提升行业集中度——2011年，质检总局曾对乳制品生产许可证进行重新审核，全国1176家乳制品企业4成遭淘汰。 　　昨日，在公布完蒙牛收购雅士利消息后，工信部消费品工业司司长王黎明直接对台下企业说：“全国120多家婴幼儿乳制品生产企业负责人都到场了，我提议今天作为相亲日。你们或是优势企业互补联合，或是跨区域联合，先恋爱。今天你们都见面认识了，能结亲的赶快结亲。” 　　蒙牛膨胀的野心：将继续并购 　　在收购雅士利后，蒙牛的奶粉业务将并入到雅士利的奶粉业务，奶粉业务将由雅士利的平台来统一操作。蒙牛总裁孙伊萍承诺，让雅士利向“更加国际化”的奶粉企业晋级。 　　这是继将酸奶业务后，蒙牛交出的第二大业务板块。 　　5月20日，蒙牛刚刚宣布和达能成立合资公司，整合双方酸奶业务。交易中更值得关注的是：执掌这部分最具潜力业务的，不是双方现有管理层，合资公司管理者将从开放市场上甄选。 　　近年来，蒙牛质量问题不断，学生奶事件、黄曲霉毒素事件、冰激凌厂卫生条件恶劣……品牌不断地被透支。除了食品安全方面问题，让蒙牛高管不省心的还有业绩。去年，因食品安全事件影响消费者信心等因素，蒙牛营业收入下滑3.5%至360亿，这是蒙牛多年来业绩首度出现下滑，同期它的竞争对手伊利营收上升12%，达到419亿。 　　一直让蒙牛引以为傲的液态奶(包括常温奶、乳饮料和酸奶)市场，竞争优势也在悄然丧失。2012年，伊利、蒙牛液奶营收分别为322.7亿和323.4 亿，蒙牛略胜一筹，但背后应该很心酸，要知道2011年时蒙牛领先优势还高达70亿元。截至2012年年底，蒙牛液奶市场份额下降至27.4%，伊利仍旧虎视眈眈，如果不谋变，2013年伊利液奶收入超越蒙牛指日可期。 　　现在，中粮董事长宁高宁和蒙牛总裁孙伊萍敞开了大门，一方面拆解出酸奶业务，迎接“外来的和尚”达能 一方面收购雅士利，弥补奶粉这一高利润产品的不足。 　　去年蒙牛利润只有12亿元，且刚刚花费25亿收购现代牧业27%股权，此次合作涉及资金巨大，蒙牛何处筹资? 　　蒙牛方面表示，很多银行都希望与蒙牛合作，看好蒙牛与雅士利联姻的发展前景，愿意提供贷款业务。并购将采用银团贷款的方式，蒙牛称贷款获得了“非常优惠”的贷款利率，但不便于披露 因为考虑不摊薄股东利益，故只考虑了银团贷款，不考虑增发。 　　除了收购现代牧业和雅士利，蒙牛还表示：“不排除围绕全产业链继续进行并购与合作的可能性”。 　　尽管蒙牛称将保留雅士利品牌独立运作，但在中国消费者对食品安全质量问题日益敏感的背景下，蒙牛这两个字对其控股的婴幼儿奶粉品牌只有减分作用。 　　【原标题：蒙牛通吃危险：本土婴幼儿奶粉安全引担忧】