乙腈中苏丹红号溶液标准

摘 要 本文介绍了食品中苏丹红检测方法的研究进展，主要包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、薄层层析法等。　　关键词 苏丹红 高效液相色谱 液相色谱-质谱 气相色谱-质谱联用 薄层层析　　近年来，一些国家和地区不断发生食品污染等恶性事件。特别是随着科技的发展，一些原来认为无害的食品添加剂，发现存在慢性或致癌作用,原来检测不出的有害物质被查出等。苏丹红是偶氮苯类人工色素，属于工业染料，主要用于油、蜡、鞋等的增光着色。由于苏丹红I、II、III、IV及其代谢产物具有致癌性，国家禁止作为色素添加剂在食品中使用。苏丹红I、II、III、IV的检测方法有高效液相色谱法[1]、液相色谱-质谱法[2]、气相色谱-质谱联用法[3]、薄层层析法[4]等。　　1. 高效液相色谱法对食品中苏丹红的检测　　高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代色谱柱分离分析方法，它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术发展起来的[5]。原则上讲，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱法分析。在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析[6]。高效液相色谱法主要有以下几种：　　1.1 欧洲委员会推荐的液相色谱法[7]　　该方法是将样品经匀浆化或粉碎后，加入乙睛(苏丹红III、IV加入氯仿)提取，过滤，滤液用反相高效液相色谱仪进行色谱分析。苏丹红I、苏丹红II的检测波长为478nm，苏丹红III、苏丹红IV则为520nm。苏丹I的检测限是0.013&mu g/ml、最低浓度为0.106&mu g/ml、在辣椒粉样品中的添加回收率高于90%。　　1.2 国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会发布的高效液相色谱法　　该方法在欧洲委员会公布的检验方法的基础上作了改进。苏丹红检测方法国家标准采用了简单的正相吸附固相萃取原理，一次性去除了样品中红辣椒和番茄中的干扰成分，使用目前国内已广泛应用的高效液相色谱仪就可准确完成4种苏丹红染料的检测。该法用正己烷代替乙睛做提取液，提取后经旋转蒸发仪蒸发浓缩，氧化铝层析柱固相萃取净化后，采用梯度洗脱，用反相高效液相色谱进行色谱分析，外标法定量。　　检测波长:苏丹红I为478nm 苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV为520nm。于苏丹红I出峰后切换。　　王艳春[8]等简化了样品的前处理，避免高效液相色谱淋洗液乙睛、丙酮溶液对人体的损害，降低了成本，提高了仪器稳定性[9]。用0.1%甲酸的甲醇溶液作为淋洗液，不用梯度洗脱测定食品中苏丹红含量。研究了用高效液相色谱法测定食品中苏丹红的色谱条件、线性范围。该方法的检出限苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV分别为:11&mu g/kg、10&mu g/kg、8&mu g/kg、8&mu g/kg，相对标准偏差2.6%，回收率为88%～106%。　　1.3 凝胶柱净化-高效液相色谱法　　凝胶层析是指混合物随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。凝胶颗粒是一类具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起过滤或&ldquo 筛&rdquo 的作用，故又称为凝胶过滤或分子筛层析(gel chromatography)[10]。　　Mazzctti M报道了一种简单而快速的苏丹I检测方法[11]，包括Soxtcc萃取、高压凝胶层析纯化，HPLC紫外/VIS 检测器检测。最低检出限为7&mu g/kg，定量分析限为13&mu g/kg。　　杨建荣等[12]认为苏丹Ⅰ分子结构上的偶氮键可表现为弱碱性，在低pH值时，偶氮键的氮原子可吸引少量质子H+，增强分子极性，洗脱加快 但洗脱液pH值在2～4.5时， pH值变化对分子极性影响不大，而pH值在4.0～6.0时,分子极性随pH值变化非常明显。并考察了联苯胺、苏丹红Ⅲ、偶氮蓝、丽春红4R四种偶氮染料对苏丹红I色谱分离的干扰，发现以pH值为2.65的冰乙酸水溶液和乙腈为流动相进行线形梯度洗脱，可获得很好的分离效果。杨建荣等[13]考察了不同配比的乙腈-磷酸、乙腈-乙酸乙酯和乙腈-甲酸体系对苏丹红的分离情况。结果表明，采用乙腈-乙酸溶液为流动相体系时，待测物谱峰纯度高。欧盟法[14]流动相为16.5%乙酸水溶液和乙腈，酸度较高，对柱子要求也比较高。张玉黔等[15]分别用0.1%、1%、10%醋酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱。结果表明，醋酸浓度对苏丹红的分离没有影响，但低浓度醋酸对色谱柱的损害相对较小以及在此条件下待测样品的杂峰对苏丹红的测定也无影响，整个分析时间只需32 min。　　2.LC/MS法对食品中苏丹红的测定　　色谱-质谱联用技术结合了色谱、质谱两者的优点，故成为仪器分析进展的热点。LC可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肤、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤[16]。MS作为理想的色谱检侧器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度[17]。因此，色谱-质谱联用长期为人们所关注。随着各种离子化技术的不断出现，液质联用在生物、医学等领域的地位越来越重要[18]。　　对于复杂食品基质本底或一种新的基质本底，HPLC检测后，通过LC/MS确证苏丹红的存在是必要的。此外，如果光谱分析结果不令人满意(如待分析物浓度较低或可能存在结构类似物时)也可用LC/MS技术进行确证。质谱法比高效液相法灵敏20倍[19]。可检出ppb数量级。由于涉及样品大多是辣椒和番茄制品，样品本身的复杂基质直接干扰仪器检测，且苏丹红具有非离子性脂溶物的特点，导致样品提取、纯化、富集非常困难，采用好的提取溶剂往往造成提取液中混入大量的干扰成分，若考虑低残留量进行富集往往首先浓缩的是样品的内源性物质，结果使得干扰更为严重[20]。由于这类染料的特点，先进国家普遍采用的研究方法是液相色谱-质谱联用技术。欧盟标准方法《辣椒粉及以辣椒为主要成分的产品中苏丹红和胭脂树橙的含量分析》中也使用大型液质联用仪。质谱检测仪具有定性优势，是我国标准发布前检测苏丹红常用的办法。有毛细管液相-电喷雾-飞行质谱法[21]，液相色谱-大气压化学电离-多极质谱法[22]和液相色谱-电喷雾质谱法[23]，均属于液相色谱-质谱联用检测法。该方法经过液相分离、光谱定量、质谱定性而最终实现对食品中苏丹红的检测。　　用LC-ESI/MS法可以分析食品中4种苏丹红色素[10]。样品中的苏丹红用乙睛提取，需纯化。色谱柱为Agilnet C18，流动相为乙睛-0.5%乙酸溶液(体积比72:28)。采用正离子电离方式，每种化合物选择3个碎片离子为定性离子以获得高选择性，选取每个化合物丰度最高的碎片为定量离子以获得高灵敏度。4种苏丹红色素的检出限(LOD)和检量(LQO)均为ng/g水平。标准加入量为0.2&mu g/g水平时的回收率为86%～98%，且重现性良好。仪器分析时间仅需8min，适合于大量样品快速分析。　　&ldquo 染红食品&rdquo 中苏丹红I、II、III和IV残留量的高效液相色谱(HPLC)初筛、质谱分析方法已经报道[4]。以MerckRP-18柱为分析柱，流动相：乙睛：水=90：10，二极管矩阵检测器(PDA)和MAX质谱仪为检测器。平均回收率(%)：87.3、83.0、86.7和90.0。　　3.GC/MS法对食品中苏丹红的测定　　用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法(gas chromatography，GC)。它是由惰性气体将气化后的试样带入加热的色谱柱，并携带分子渗透通过固定相，达到分离的目的。气相色谱法具有分离效率高、灵敏度高及速度快的特点。气质联用系统中，质谱仪相当于色谱的定性检测器[16]。　　气相色谱-质谱(GC-MS)选择离子检测法(SIM)，同时测定了食品中苏丹红I～IV[25]。色谱柱为PR-SR石英毛细管柱载气He: EI离子源，选择m/z77，105，115，143，176，247，248，261，352，380用于SMI检测，并按不同的采样时间分成4组，每组4个离子，分别对应于每种苏丹红进行定性分析确证 选择苏丹红I～IV各自的分子离子峰m/z248，276，352，380作抽出离子图进行定量分析。苏丹红I、II的线性范围为0.01～10.0mg/L，苏丹红III、IV的线性范围为0.1～10.0mg/L 检出限：苏丹红I、II为1&mu g/kg，苏丹红III为5&mu g/kg，苏丹红IV为10&mu g/kg 回收率86%～95%。该法与欧洲健康与消费者保护委员会的方法(HPLC法)相比，灵敏度高1～2个数量级，分析时间缩短，用色谱保留时间，质谱同时定性，消除了食品中杂质的干扰，结果准确可靠，选择性和重复性好，适用于所有食品成品及原料的检验。　　固相萃取-气质联用被用于测定辣椒油中苏丹红I和苏丹红II[26]。用Strata-X小柱进行辣椒油样品的前处理，用气质联用法对苏丹红I和苏丹红II进行定性和定量分析。对苏丹红I和苏丹红II方法的检出限分别为0.5&mu g/L和0.7&mu g/L，平均回收率分别为93.8%和95.9%，RSD分别为2.7%～6.9%和1.1%～4.4%。　　气相色谱-质谱(GC-MS)选择离子检测法(SIM)，测定了食品中苏丹红I号[25]。用石英毛细管柱，He载气 EI离子源，选择m/z277、115、143、248离子用于SIM检测，并根据这4个抽出离子的峰面积比进行确证。苏丹红I号的线性范围为0.01～10.0mg/L，相对标准偏差小于6.1%，回收率85%～90%，检出限为0.001mg/kg，每个样品分析时间为5min。该法与欧洲健康与消费者保护委员会发布的方法(HPLC法)相比灵敏度高两个数量级，分析时间缩短，用色谱保留时间，质谱同时定性，消除了食品中杂质的干扰，避免了只用色谱保留时间定性可能产生的错误，结果准确可靠，选择性和重现性好，适用于所有食品成品及原料的检验。　　4.薄层色谱法对食品中苏丹红的测定　　薄板和展开剂的选择在薄层色谱法测定中均起着关键作用，也是食品中苏丹红薄层色谱法测定的研究重点。　　薄板和展开剂对分开样品中苏丹红有重要影响。王鲜俊等[27]比较了同一展开剂甲醇-丙酮-醋酸在硅胶G薄层板、聚酰胺薄层板、硝酸盐-硅胶G板上对苏丹红Ⅰ～Ⅳ的展开效果，发现在聚酰胺薄层板上，苏丹红Ⅰ～Ⅳ快速展开，且斑点集中 而硅胶G薄层板对苏丹红Ⅰ、Ⅱ分不开，硝酸盐-硅胶G板对苏丹红Ⅲ、Ⅳ分不开。张杨[28]采用展开剂正丁醇-无水乙醇-氨水，在聚酰胺薄层板上可将苏丹红Ⅰ～Ⅳ分开，但有拖尾现象。庞艳玲[29]通过对比研究，发现在硅胶G板上，展开剂正己烷-二氯甲烷-氨水可迅速、稳定地分开样液和标液中的苏丹红Ⅰ～Ⅳ 而展开剂三氯甲烷-正己烷、三氯甲烷-石油醚、三氯甲烷-石油醚-醋酸不能将苏丹红Ⅰ、Ⅱ分开 展开剂甲醇- 丙酮- 醋酸对苏丹红Ⅰ～Ⅳ均不能分开。　　5.结束语　　国内外食品质量安全事件之所以接连发生，除了有关食品质量安全的法规不健全外，食品检测技术不过关、检测仪器使用不方便也是重要的原因。为保护人类健康，对食品中苏丹红染料的测定需要进一步深入研究，尽快建立一种实用、快捷、准确可靠的检测技术。　　参考文献　　[1] 李军, 雍炜, 李刚, 等. HPLC法测定辣椒及其制品中苏丹红色素含量[J].检验检疫科学, 2005, 15 (2) : 44. 461.　　[2] 杨强, 李刚, 彭涛, 等. 辣椒及其制品中苏丹红I号的HPLC -MS/MS检测方法[J].中国食品卫生杂志, 2005, 17 (6) : 34. 361.　　[3] 林佶, 万玉萍, 沈其萍, 等. GC /MS, SIM定性定量分析食品中的苏丹红1号[J].职业与健康, 2006, 22 (22) : 45.461.　　[4] 王鲜俊,缪红,文君. 薄层色谱法测定海椒面中的苏丹红[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15 (12) : 1475-1476.　　[5] 方惠群，于俊生，史坚. 仪器分析〔M〕.科学出版社，2004，157.　　[6] 武汉大学化学系. 仪器分析〔M〕.高等教育出版社，2000，385.　　[7] Hormazaba V. Determination of the Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Meat by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry [J]. Jounral of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2005，27(17):2759-2770.　　[8] 王艳春. 食品中苏丹红染料检测方法的研究[J]. 中国卫生检验杂志，2005，15(11):1313-1315.　　[9] 郑用熙.分析化学中的数理统计方法[M].北京，科学出版社，1991，1106-1121.　　[10] 喻凌寒. HPLC-DAD法测定辣椒及其制品中苏丹红I的含量[J]. 光谱实验室，2004，21(6):11311.　　[11] Mazzctti M，Fascioli R，MaZZoneini L，et al. Determination of 1-phenylazo-2-naphthol (Sudan I) in chilli powder and in chilli-containing food products by GPC clean-up and HPLC with LC/MS confirmation [J].Food Addit Conatm. 2004，21(10):935-941.　　[12] 杨建荣,陶志华,曹建明. 苏丹Ⅰ在反相高效液相色谱中的保留行为研究[J]. 中国公共卫生，2006, 22 (4) : 499-450.　　[13] 杨建荣,桃志华,曾建明. 反相高效液相色谱法同时检测食品中苏丹- 1与对位红的含量[J]. 温州医学院学报, 2006, 36 (1) :74-76.　　[14] Veretout O, Demesse L, Szymanski L. Analysis and dosage of the colorants Sudan and Bixin in chilli powder and pepper-based products. European Commission. News notification: 3 /99: Corrected method for the detection of Sudan [R ].　　[15] 张玉黔,栾燕,王新丽，等.反相高效液相色谱法测定食品中苏丹红1、2、3、4的方法研究[J].中国卫生检验杂志, 2005, 15 ( 7) :807-808.　　[16] 汪正范，杨树民，吴牌天，等.色谱联用技术.化学工业出版社〔M〕，2001，122.　　[17] Henion J D，Thomson B A，Dwason P H. Determination of sulfa drugs in biological fluids by liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry [J] Anal. Chem.，1982，54(3):451-456　　[18] 庞焕，文允锚. 质谱联用技术研究进展及其在药物分析中的最新应用[J].中国药学杂志，2001，36(7):433-435.　　[19] H. HoffillnaKL，PaceG，Mixed-mechanism ionization to enhance sensitivity in atomospherie pressure ionization LC/MS [J].Pharein Biomed Anal，2000，22(5):861- 867　　[20] 徐智秀、肖红斌. 高效液相色谱质谱质谱法分析人参皂甙[J].色谱，2000，(6):521-5241.　　[21] Calbinai F，Careri M，Evliri L，et al. Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan azo-dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatography&ndash electrospray tandem quadrupole orthogonal-acceleration time of flight mass spectrometry[J].Chromoatgr A，2004，1058(1-2):127-135　　[22] Tateo F，Bononi M. Fast Determination of Sudan I by HPLC/APCI-MS in Hot Chilli, Spices, and Oven-Baked Foods [J].Agric Food Chem，2004，52(4):655-658.　　[23] Wang Zhengfan. Chromatograph Quality and Quantification [M].Bejiing，2003.　　[24] 黄宏南，华永有，吴晶文. 动物源食品中四环素、土霉素、盐酸克伦特罗HPLC-PDA同时快速检测方法的研究[J].海峡预防医学杂志，2003，9(2):1-4.　　[25] 黄晓兰，吴惠勤，黄芳. GC-MS/SIM法同时测定食品中的苏丹红Ⅰ~Ⅳ[J].分析测试学报，2005，24(4):1-5.　　[26] 郭新东，何强，郭茂章. 固相萃取-气质联用测定辣椒油中苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ[J].广州化工， 2005，33(3):606.　　[27] 王鲜俊,缪红,文君. 薄层色谱法测定海椒面中的苏丹红[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15 (12) : 1475-1476.　　[28] 张杨. 薄层层析法测定苏丹红的方法探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16 (5) : 559-570.　　[29] 庞艳玲. 薄层色谱-紫外可见分光光度法在苏丹红检测中的研究与应用[D]. 山东师范大学硕士学位论文, 2006.　　(作者单位：河北省赵县质量技术监督检验所)

苏丹红是一种人工合成的染料，并非食品添加剂，其结构为亲脂性偶氮化合物，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型。如果食品中的苏丹红含量较高，达上千毫克，则苏丹红诱发动物肿瘤的机会就会上百倍增加，特别是苏丹红有些代谢产物是人类可能的致癌物。 早在2003年5月，法国发现从印度进口的红辣椒产品中含有苏丹红Ⅰ号。随后，在欧盟成员国加强检测后，又在包括咖喱粉在内的一系列进口辣椒产品中发现了苏丹红Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ号。2005年2月，英国食品标准局在英国&ldquo 第一食品公司&rdquo 制造的伍斯特郡辣酱油使用的辣椒粉中查出了苏丹红Ⅰ号，并于2月下旬，向全球发出十五项安全警告。随后，我国也加强了苏丹红Ⅰ~Ⅳ号的检测工作，发布了《GB/T 19681-2005 食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》国家标准。 迪马科技一直致力于为食品安全检测提供完善的服务，面对苏丹红事件层出不穷，迪马科技在参考国标的基础上开发出辣椒红色素中苏丹红的检测方法。样品经乙腈两次提取后旋转蒸发至干，正己烷溶解，然后使用ProElut Silica 固相萃取柱进行净化，高效液相色谱法检测。相比较于国标方法前处理过程更加简便，色谱分析条件优化后分析时间更短，10分钟内即可实现四种苏丹红的完全分离。 下面为详细解决方案，敬请参考！辣椒红色素中苏丹红的测定样品准备/提取称取0.1 g~0.2 g样品于离心管中，加入10 mL乙腈；涡旋混合5 min，超声提取5 min，6000 rpm下离心3 min，收集上清液；残渣再用10 mL乙腈提取，每次涡旋混合5 min，超声提取5 min ，6000 rpm下离心3 min；合并两次提取液；在40 ℃下用减压蒸馏将提取液蒸干，然后用5 mL正己烷溶解，待净化。2. SPE柱净化&mdash &mdash ProElut Silica 1 g/6 mL（Cat.#：63006）(1)活 化：10 mL正己烷，流出液弃去；(2)上 样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)洗 脱：15 mL乙醚：乙腈=1：9洗脱，收集流出液；(4)重新溶解：在40 ℃下用减压蒸馏将收集的流出液蒸干，然后用乙腈定容至2 mL后供HPLC分析。3 分析条件色谱柱：Diamonsil C8(2) 150× 4.6 mm，5 &mu m（Cat.#：99650）流 速：1.0 mL/min 检测器：UV：478 nm柱 温：30 ℃进样量：20 &mu L 流动相：A：乙腈，B：水梯度时间（min）055.0115A（%）85908585B（%）15101515 4 添加回收结果辣椒油中苏丹红的添加回收结果 目标物苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ回收率94.47%93.44%90.80%92.12%辣椒红色素中苏丹红的测定相关产品信息：货号名称规格样品前处理63006硅胶萃取柱ProElut Silica1 g/6 mL, 30/pk24435812管防交叉污染真空SPE萃取装置12位48031,3,6mL柱管通用连接器15/pk4806考克(控制流量)15/pk99011真空/正压两用泵，无油1/pk99013抽滤瓶套装(包括硅橡胶管2米,2L抽滤瓶及橡胶塞)1/pk37177针头式过滤器 Nylon13 mm,0.22 &mu m 100/pk37180针头式过滤器 Nylon13 mm,0.45 &mu m 100/pk色谱柱及保护柱99650反相高效液相色谱柱 Diamonsil C8(2) 150 × 4.6 mm，5 &mu m6202EasyGuard C8 保护柱套装10 × 4.01个柱套 + 2个柱芯标准品50P-C16986101苏丹红Ⅰ[842-07-9]250 mg50P-C16986102苏丹红Ⅱ[3118-97-6]250 mg50P-C16986103苏丹红Ⅲ[85-86-9]250 mg50P-C16986104苏丹红Ⅳ[85-83-6]250 mgHPLC溶剂Ÿ 缓冲盐Ÿ 离子对试剂50101乙腈 HPLC级4 L50115正己烷 HPLC级4 L通用色谱产品52401B瓶架/蓝色50 孔52401A瓶架/白色50孔5323样品瓶（棕色/螺纹）2 mL, 100/pk5325样品瓶盖/含垫（已经组装）100/pkH80465HPLC 进样针25 &mu L

p style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/e77b4557-0131-4f53-abc6-dd54c03b641b.jpg" title="001.png"//pp　　按照《中华人民共和国食品安全法》有关规定，为规范食品快速检测方法使用，我局组织制定了《辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测 胶体金免疫层析法(征求意见稿)》食品快速检测方法，现向社会公开征求意见。请于2018年3月10日前通过电子邮件反馈意见。/pp　　联 系 人：金绍明、成长玉/pp　　联系电话：010-67095928、010-88331033/pp　　电子邮箱：kbsbzglc@cfda.gov.cn/pp　　附件：辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测 胶体金免疫层析法(征求意见稿)/pp style="text-align: right "　　食品药品监管总局办公厅/pp style="text-align: right "　　2018年2月8日/pp style="line-height: 16px "img src="/admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_doc.gif"/a href="http://img1.17img.cn/17img/files/201802/ueattachment/038d8c4f-6431-48b3-a908-0ee639c80619.doc" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测 胶体金免疫层析法（征求意见稿）.doc/span/a/p