磷酸氢二钠无水细胞或昆

点评 | 朱锦芳（NIH）2022年5月23日，上海交通大学基础医学院生化与分子细胞生物学系童雪梅教授课题组及其合作团队，上海市免疫学研究所李斌研究员课题组和复旦大学附属华山医院/脑科学转化研究院杨辉研究员，在Nature Metabolism杂志在线发表题为 Non-oxidative pentose phosphate pathway controls regulatory T cell function by integrating metabolism and epigenetics 的研究论文，揭示非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）对调节性T（Treg）细胞代谢模式及细胞功能的调控机制。Nature Metabolism同期发表伦敦帝国理工学院Margarita Dominguez-Villar博士为该研究撰写的News & Views特评，认为该文章发现非氧化PPP在Treg细胞活化和功能调控中的中心地位（a central regulator）。表达特征转录因子Foxp3的Treg细胞是一类具有免疫抑制功能的CD4+ T细胞亚群，维持机体免疫系统稳态，防止免疫过激诱发自身免疫病。已知葡萄糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代谢等都参与 Treg 细胞功能调控。PPP是一条不产生ATP的葡萄糖分解代谢途径，由生成NADPH的氧化PPP和产生5-磷酸核糖的非氧化PPP组成。非氧化PPP包括4个代谢酶催化的5步可逆反应，可以通过改变代谢物流向来满足细胞的功能需求。非氧化PPP是否参与免疫细胞如Treg细胞的代谢与功能调控尚不清楚。转酮醇酶TKT是非氧化PPP中催化两步可逆反应的代谢酶。童雪梅团队已发现TKT在肝脏、脂肪和肠道中调控糖脂代谢平衡的重要作用（Li M et al, Cancer Research, 2019 Tian N et al, Diabetes, 2020 Tian N et al, Cell Death & Disease, 2021）。在本研究中，研究人员通过构建Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠模型，深入探究非氧化PPP是否和如何调控Treg细胞代谢及功能。他们研究发现，Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠出生3周后发生严重自身免疫性疾病，并且在断奶之后相继死亡，其表型与缺失Foxp3基因的小鼠相似。进一步研究发现，敲除TKT在不影响Treg数目和转录因子Foxp3 水平的情况下，阻断Treg细胞的免疫抑制功能。为了排除炎症反应的影响，研究者根据Foxp3基因位于X染色体和雌鼠X染色体选择性失活的特点，构建了在同一只鼠中既有TKT缺失又有TKT正常表达的Treg细胞嵌合小鼠模型。该小鼠Treg细胞的转录组和表观遗传组分析表明，TKT缺失导致Treg细胞中87.9%的差异表达基因被下调，染色质可及性降低。这些被下调的基因几乎全部为效应性Treg特征性基因，表明非氧化PPP对调控Treg细胞免疫抑制功能是必需的。研究者进一步发现，TKT缺失导致Treg 细胞NADPH 减少和氧化应激增加，葡萄糖进入线粒体氧化减少，脂肪酸氧化增加，氨基酸分解代谢显著增强，分解代谢重构使线粒体功能受损。同时，被氧化应激和线粒体损伤诱发的还原性TCA循环使α-酮戊二酸/琥珀酸及α-酮戊二酸/富马酸比率降低，DNA甲基化增加，抑制Treg细胞特征性功能基因表达，导致其免疫抑制性功能丧失。文章也发现非氧化PPP中的另外一个代谢酶——转醛醇酶（TAL），对维持效应性Treg特征性功能基因表达也不可或缺。此外，在自身免疫性病人外周血 Treg细胞中，TKT水平显著降低。综上所述，此研究首次揭示非氧化PPP对于调控Treg细胞中糖、脂和蛋白质分解代谢稳态、维持代谢物依赖的表观遗传修饰和功能基因表达有关键作用，即非氧化PPP可以通过整合三大营养物质代谢和表观遗传修饰控制Treg细胞功能。这项研究将为通过调控Treg功能防治自身免疫性疾病和其它免疫相关疾病提供新策略新手段。非氧化 PPP 通过整合代谢组和表观遗传组调控Treg细胞功能上海交通大学医学院博士生刘琪、阿拉巴马大学伯明翰分校博士生朱方明和上海市免疫学研究所博士生刘鑫男是该研究论文的共同第一作者。此项研究得到复旦大学生物医学研究院叶丹研究员、海军军医大学附属长征医院风湿免疫科徐沪济主任、上海交通大学附属仁济医院沈南主任、上海交通大学基础医学院徐天乐教授、清华大学药学院胡泽平研究员、阿拉巴马大学伯明翰分校胡晖教授等合作实验室的大力协助。通讯作者为童雪梅教授、李斌研究员和杨辉研究员。专家点评朱锦芳Jeff Zhu (Chief, Molecular and Cellular Immunoregulation Section, NIH)调节性T细胞（Tregs）在维持免疫耐受和免疫稳态中发挥关键作用，并且参与调节感染和癌症中的各种免疫反应。一方面，Treg功能的丧失通常与自身免疫和过度炎症有关；另一方面，肿瘤微环境中激活的Treg往往会抑制肿瘤免疫。因此，了解Treg的产生、激活及其获得抑制性功能的机制不仅将拓展基础免疫学认知，而且将为各种免疫相关疾病提供新颖有效的临床疗法。不同的代谢途径在控制Treg和效应性辅助型CD4+ T（Th）细胞的发育和分化中作用不同。经典观点认为，Tregs更倾向于脂肪酸氧化，而效应Th细胞主要利用葡萄糖作为能量来源。在本项工作中，童雪梅团队及其合作实验室共同发现，非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）在控制Treg细胞激活和抑制功能中起着关键作用。非氧化PPP是葡萄糖分解代谢的一个分支，它在Treg和效应性Th细胞中的功能尚不清楚。令人惊奇的是，在Treg中敲除非氧化性PPP中的重要酶—转酮醇酶（TKT），小鼠会产生致死性自身免疫病。Treg细胞特异性 TKT 缺失导致其失去免疫抑制功能，却不影响其发育和Foxp3蛋白表达。机制上，童雪梅及其合作团队发现TKT缺失诱导线粒体氧化应激和还原性TCA循环，导致α-酮戊二酸（α-KG）水平降低。α-KG作为重要的表观遗传辅助因子，能调控组蛋白和DNA去甲基化酶的功能。TKT缺失时，Treg中众多基因的DNA甲基化增加，染色质可及性下降。并且，α-KG补充能够改善由Treg特异性TKT 缺失引起的自身免疫反应。此外，在临床自身免疫性疾病患者外周血Treg中，TKT水平被下调。Treg获得抑制功能需要被激活，TKT缺失诱发的自身免疫反应是由活化Treg特征性基因表达减少所导致的。由于Treg细胞群体的异质性，单细胞分析可以为TKT如何调节Treg激活和表观修饰提供一个更清晰的解释。然而，该研究发现在大约1000个激活态Treg特征基因中，只有124个受到TKT缺失的影响，却诱发了显著的小鼠自身免疫病表型，表明这个小的基因群体包含对Treg功能至关重要的效应分子，例如IL-10和TIGIT等。因此，本项研究发现令人印象非常深刻。本项工作不仅促进我们全面认识Treg细胞激活和功能的机理，而且在未来治疗人类疾病方面具有潜在重要转化价值。原文和特评链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00575-z，https://www.nature.com/articles/s42255-022-00574-0

FJA-2型微机控制自动滴定系统测定食品添加剂磷酸氢二钠 方建安 张振兴 （南京传滴仪器设备有限公司、徐州天嘉食用化工有限公司） 徐州天嘉食用化工有限公司携带样品与有关分析试剂前来我公司，利用FJA-2 型微机控制自动滴定系统对磷酸氢二钠含量的测定，对多个样品的测试结果表明，电位滴定法测定磷酸氢二钠含量，具有较高的灵敏度与好的测定精度，滴定图谱清晰。现将测试结果报告如下，供能考。 （一）磷酸氢二钠测定方法与结果 用天平称取样品溶液零点几克，精确到0.001g（视样品含量不同而不同）于100ml烧杯中，加c1mol/L盐酸10ml，加50 ml蒸馏水，待样品溶解后，以PH复合电极为指示电极，用NaOH［C(NaOH)＝0.9795mol/L］为滴定剂，在FJA-2微机控制自动滴定系统上进行自动滴定，叁个样品测量结果如下表。滴定曲线如图所示。 测量次数 样品号 样重（克） 滴定剂体积 终点1 (ml) 滴定剂体积 终点2(ml) 磷酸氢二钠含量 （%） NaN2 0.516 6.265 9.894 97.82 NaN2 0.526 6.047 9.750 97.92 NaN2 0.652 5.405 9.987 97.75 计算 磷酸氢二钠%=[C (V2-V1) 0.1420 100]/m 式中： C&mdash &mdash NaOH滴定剂的摩尔浓度； V&mdash &mdash 滴定剂NaOH的耗用量（ml）； m&mdash &mdash 试样重量； 0.1420&mdash &mdash 为磷酸氢二钠的毫摩尔质量。 （二）讨论 1、上述是连续3次测定结果，可以看出，几次测定结果的最大值减最小值的绝对差值都在于0.2% 以内。最后一个图谱为体积对pH滴定曲线。 2、为了保证测定的精度要注意下面几个重要环节： （1）、正确配置NaOH溶液也是控制滴定的精度的一个重要因素。要点是要用饱和NaOH溶液来配制滴定剂，不要固体称重来配制；要用新的去离子水（电导值小于5µ S）来配制滴定剂；滴定剂瓶上要装吸收二氧化碳的过滤器等。 （2）、pH复合电极要靠滴定池边，磁力搅拌要平稳，不要太剧烈，以防样液的损失。 参考文献 【1】 斯维拉。G著，高立译。自动电位滴定。北京。原子能出版社。1985 【2】 方建安，夏 权编著。电化学分析仪器。南京，东南大学出版社，1992 【3】 方建安，影响电位滴定精度的几个问题，分析仪器，（4），1993 【4】 方建安，方 晖等，一种微机控制的自动光度滴定系统，分析化学，（10）24，1233，1996

前言：深低温下细胞出于“休眠”状态得以长期保存，解冻后需要维持较好的活率才能达到应用效果 ，细胞解冻需要一个”舒适“的温度范围，如何实现过程控温？如何有效安全解冻细胞？如何维持工艺可重复？今天小编向各位介绍一款全系列产品，它就是美国百奥莱BioLife公司开发的ThawSTAR细胞程序复苏仪，一直被业内视为解锁细胞解冻工艺黑科技产品，ThawSTAR可以轻松实现细胞自动化解冻，标准工艺高度重复，解冻安全、操作方便、性能稳定！一、ThawSTARTM CFT系列细胞复苏仪（冻存管专用）2021年6月23日CFDA正式批准由复星凯特引进美国Kite的嵌合抗原受体CAR-T细胞治疗产品奕凯达（阿基仑赛注射液）上市，该药品为中国首个获批上市的细胞治疗产品，行业士气颇受鼓舞，9月3日，国内第 2 款CAR-T! 药明巨诺 “瑞基仑赛注射液”获批上市 。一时间，朋友圈瞬间被刷爆，翘首期盼，艰辛付出，终于硕果累累！近二十年，随着世界生物技术快速发展，国内生物制药行业生机盎然，新的制药工艺不断引进与改进，免疫细胞靶向治疗已然成为实体肿瘤、癌症等决定患者生与死的最后救命稻草。对于采用“活体”细胞静脉注射的方式备受关注！白血病女孩Emily通过CAR-T疗法实现痊愈的故事，让患者再次看到希望。实际上，细胞解冻复苏需要一个“舒适温度”范围才能维持较好的解冻后活率，美国百奥莱BioLife 公司自2015年推出首款ThawSTARTM CFT系列细胞程序复苏仪以来，一直被视为业内黑科技产品，在无水干式的条件下自动化轻松解冻冻存管内细胞，而且维持与水浴一致的解冻活率，该款仪器设计小巧，操作简单，通过STARTM低温传感技术监控细胞样本解冻过程温度变化，可以在BSC生物安全柜内洁净度较高的环境中直接使用，相比传统水浴操作，ThawSTAR 解冻更安全、更稳定、更方便！ThawSTARTM 操作简单，流程如下：1. 连接电源启动仪器，预热至起始温度2. 垂直插入冻存管3. 仪器自动启动解冻程序4. 程序达到解冻终点后，冻存管弹出5. 取出样本后，轻轻晃动，冰晶消失。ThawSTARTM CFT系列细胞复苏仪订购信息，如下：二、ThawSTARTM CB系列细胞复苏仪（冻存袋专用）当前，已上市的几款CAR-T细胞药主要采用冻存袋灌装解冻，复杂且昂贵的生产工艺决定了其在终端市场的售价，此前，复星凯特阿基仑赛注射液被流出的药品销售订单来看，国内首款CAR-T疗法阿基仑赛注射液零售价为120万元/袋（约68ml），复星凯特相关负责人回复记者称，“公司CAR-T细胞治疗产品定价将根据价值、疗效、成本等各项综合考量制定，目前定价方案尚未最终确定，正在进行多方沟通中，希望可以惠及风多中国患者。” 但毫无疑问的是CAR-T细胞疗法确实很贵！（来源：资料图）（来源：资料图）CAR-T细胞疗法的全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，其中CAR指的是嵌合抗原受体，它的原理在于先激活免疫细胞，然后再去杀死癌细胞，即利用T细胞来杀死癌细胞。针对冻存袋细胞给患者静脉注射前最关键的一步解冻复苏工艺，美国百奥莱公司开发了ThawSTARTM CB细胞程序复苏仪！为实现冻存袋细胞标准化解冻方式提供了新途径！ThawSTARTM CB细胞程序复苏仪是一款针对细胞冻存袋细胞标准程序解冻的复苏仪，针对25~1000mL 容量6个标准规格冻存袋，提供了12个标准的解冻程序，通过STARTM低温穿透传感技术，直接检测细胞样品温度，实时传感系统自动判断解冻结束终点，给细胞解冻时控温提供了有效途径，人性化的操作界面一目了然，密码登录，解冻过程温度数据记录，方便追溯。对于不同细胞剂量美国百奥莱厂家还可以提供订制化解冻程序服务，仪器整体设计结构紧凑，桌面型触摸屏操作，操作简单、安全、稳定。 同样，ThawSTARTM CB优化了操作设计，流程如下：ThawSTARTM CB细胞复苏仪，程序可选、操作简单、解冻安全！ThawSTARTM CB系列细胞复苏仪订购信息，如下：三、ThawSTARTM AT系列细胞程序复苏仪（冻存瓶专用）传统的细胞药主要采用冻存袋存储细胞并在临床上注射使用，但是，受冻存袋包材本身柔软等材料本身特性限制，无法自动化批量分装，液体残留偏高。最近十年，由比利时Aseptic Technologies公司研发生产的AT-Closed Vials可谓是火遍了全球生物技术靶向治疗行业，解决了小剂量分装，深低温冻存、同时也实现了自动化放大分装工艺。尤其干细胞用户群体普遍采用6mL的AT-Closed Vial，那么针对6mL规格的AT-Closed Vial 如何实现有效干式精准解冻呢？美国百奥莱公司早在2018年便开发了ThawSTAR AT6细胞程序复苏仪，并被国外多家知名免疫细胞公司所采用，通过订制化标定解冻过程温度执行程序，可实现自动且精准的判断解冻结束终点，操作简单，工艺高度重复，避免了人为主观判断解冻终点造成的细胞药“失效”！ThawSTAR AT6 细胞复苏仪对于不同剂量下，液氮与干冰冻存过的样本解冻时间表现对比，如下：ThawSTARTMAT系列细胞复苏仪有多款型号，订购信息如下：如果您需要申请Demo机试用，请抓紧联系我们吧！中国区授权总经销：上海朗喜工业科技有限公司