肉豆蔻酸异丙酯对照品

应用指南 | CMS-TLC 用于天然产物肉豆蔻提取物的分析鉴定 天然产物及其潜在的活性成分及其在传统医学中的应用在药学研究领域日益引起人们的兴趣。天然产物的活性成分是理想的化学起始结构，可以在药物开发过程中进行改进，因此，目前批准的药物中有很多是基于天然产物开发的。本文介绍了利用 Advion expression CMS 和 Advion Plate Express TLC 薄层色谱质谱接口对肉豆蔻醇提物进行分析的工作流程。实验仪器质谱：expression CMS 小型台式质谱仪TLC：薄层色谱质谱接口实验方法TLC 方法 采用TLC硅胶60 F254 分离化合物，展开剂为80/20 石油醚 (bp.60-80) /二恶烷。 提取:有机肉豆蔻香料坚果磨成粗粉，取 500mg 加入 10mL 甲醇中，超声处理15min。将浆液过滤后，20000g 离心 5min，上清液储存在棕色玻璃小瓶中，5°C 保存，待进一步分析使用。 衍生:新鲜配制固蓝RR盐，浓度为 200 mg/100 mL甲醇，使用前与 0.1N 氢氧化钠溶液 2:1 混合，在室温下干燥20分钟。TLC/FIA/CMS 分析 TLC 分析:采用Advion TLC薄层色谱质谱接口进行直接提取分析，流动相为甲醇＋0.1%甲酸，流速为200 μL/min。 HPLC 分析:样品通过高效液相色谱分析系统进行分析，流速为 350 μL/min，时间 5 min，流动相为乙腈＋0.1% 甲酸，梯度从 50% 到 90%。 MS分析: Advion expression CMS 采用极性切换和源内 CID 扫描，质量范围为 m/z 100 到 m/z 1000。结果分析 肉豆蔻具有精神活性，它是少数能干扰大麻素的化合物之一。与另一种天然产物大麻相比，肉豆蔻提取物在紫外下对大麻素标准品（如大麻酚 (CBN)、大麻二酚 (CBD) 和四氢大麻酚 (THC)）的 Rf 区域仅显示出轻微的响应。用 TLC/FIA/MS 分析 TLC 板上的该区域显示没有 THC 的质量信号，并且当通过 UHPLC/CMS 分析时，也没有迹象表明肉豆蔻提取物中存在大麻素。此外，在 Rf 值为 0.4 时，没有形成经典的固蓝 RR 颜色反应；而肉豆蔻提取物在 Rf=0.2 时呈现紫色。在紫外照射下，相应的分析物有强烈的信号，可能不是大麻素，而是肉豆蔻的主要成分之一，如黄芩苷或肉豆蔻酸。图2 肉豆蔻提取物的 TLC 和 TLC/FIA/MS 分析结果图。与 Rf = 0.40 的三种大麻素标准品（CBN、CBD 和 THC）相比，紫外下 THC 区域有轻微的阳性反应；但是，(B) 图显示在用固蓝 RR (A) 衍生时，没发生标志性颜色反应。推导表明，Rf=0.21 的未知化合物对颜色反应有干扰。同时进行了相应位置的 MS 分析（2B 中的红色椭圆形）显示，负离子模式 MS 扫描 (C) 中 m/z 402.2 处的信号和丰富的源内 CID MS 信息 (D)。 进一步的 TLC/FIA/MS 分析表明，该分析物在负离子模式下质荷比为 m/z 402.2，排除了该化合物为三肉豆蔻精的可能性。然而，CID表明甘油三酯至少含有部分月桂酸。在 UHPLC/CMS 分析( 图3 )中也确认了相同的分析物，UHPLC 保留时间为 9.02 min, MS 数据包括正、负离子模式数据以及源 CID 数据。关于该分析物确切的化学结构的进一步研究还在进行中，但表明使用 expression CMS 从天然产物分析中获得的信息更丰富。图3 (A) 肉豆蔻提取物的 UV 谱图，(B) 负离子模式下的 MS TIC 谱图，(C) 正离子模式下的 TIC 谱图，(D) t=0.92 分钟的负离子模式质谱图，和 (E) 各自的正离子模式质谱图。结论 TLC/FIA/MS 工作流程为从植物材料中提取的天然产物和药用化合物的分析增加了有价值的信息和特定的数据。 Advion Plate Express 是一种创新的样品提取设备，用于从 TLC 薄层板上直接提取化合物，提供天然产物的快速分析。 Advion expression CMS 小型台式质谱仪，具有更快的扫描速度，在线极性切换和源内 CID ，可快速提供化合物基本信息。

药用辅料问题近几年困扰了国内的药物制剂生产企业，辅料质量控制引起了监管机构和生产企业的重视。在药典四部辅料品种里对理化检验的指标有具体要求，岛津和合作伙伴开展了辅料检测相关的研究，这里跟大家分享一个案例：聚山梨酯80中多脂肪酸检测。 聚山梨酯80，又名吐温80，是一种非离子型表面活性剂，系油酸酸山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20油酸山梨坦。因为聚山梨酯80对亲脂性药物有较好的助溶作用，因此常被用作注射剂及口服液的增溶剂或乳化剂，是一种常用的药物制剂辅料。聚山梨酯80通常为混合物，其分子结构中脂肪酸部分的组成大多不同，以油酸为主要成分，同时还含有其他脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸等。近年来,在临床应用中出现了一些安全性问题的报道，如过敏、溶血等不良反应。研究表明，副作用的产生可能跟聚山梨酯80的纯度有关，而测定脂肪酸的组成在一定程度上反映了聚山梨酯80的纯度。 2015版中国药典增加了聚山梨酯80要求，2020版中国药典沿用， “聚山梨酯80”品种下有脂肪酸含量要求：肉豆蔻酸(≤5.0%)、棕榈酸(≤16.0%)、棕榈油酸(≤8.0%)、硬脂酸(≤6.0%)、亚油酸(≤18.0%)、亚麻酸(≤4.0%)，与EP、BP等要求一致。 ?Nexis GC-2030气相色谱仪 参考《中国药典》中碱催化三氟化硼/甲醇衍生化前处理方法，遵照药典规定的气相色谱条件，应用岛津Nexis GC-2030（FID）气相色谱仪建立了聚山梨酯80中脂肪酸组成的测定方法，并对市场上的三个聚山梨酯80产品进行了测定。 混合对照品溶液色谱图 （0.1 mg/mL）（上图按出峰顺序：1、肉豆蔻酸甲酯，2、棕榈酸甲酯，3、棕榈油酸甲酯，4、硬脂酸甲酯，5、油酸甲酯，6、亚油酸甲酯，7、亚麻酸甲酯） 按照中国药典前处理方法，在选定的分析条件下，测定三个聚山梨酯80样品中的脂肪酸组成，结果如表5所示。油酸含量越高，表明聚山梨酯80的纯度越高。这三个产品中油酸含量从40%-77%不等，而药典要求油酸含量不低于58.0%，产品C不满足药典要求。 三个聚山梨酯80产品的脂肪酸组成测定结果结论 聚山梨酯80中油酸的含量与其纯度直接相关，通过气相色谱法对聚山梨酯80中脂肪酸进行检测，实验结果有效地反应其中的脂肪酸组成和含量，可用于药品辅料的质量控制，进而降低临床用药的风险。

空间代谢组学：单细胞空间代谢流分析新方法原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国 关注我们，更多干货和惊喜好礼刘甜生物体内的代谢物和脂质不仅是细胞的关键组成模块，它们在信号传导、表观基因组调控、免疫、炎症和癌症发展中同样具有重要作用和意义。代谢组学分析是我们了解、评估生物体、器官和细胞状态的重要方式。而单细胞技术通过展示组织内部甚至单克隆细胞之间的细胞异质性，将生物学研究推进至新维度。质谱成像（MSI）技术可以从样品中创建特定化合物的图像，这些图像是由样品表面获得的数千个质谱生成的。每个记录的质谱都会为图像贡献一个像素，而每个质谱中的峰都可以生成一个图像。与其他成像方法相比，MSI无需化合物标记，可实现非靶向分析。本次与大家分享的是一篇最新发表于bioRxiv上的有关单细胞空间代谢流分析方法的文章[1]。研究人员基于AP-SMALDI Orbitrap平台开发了一种命名为“13C-SpaceM”的新方法，通过13C标记的葡萄糖示踪葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径（glucose-dependent de novo lipogenesis）。本方法应用超高分辨率的基质辅助激光解吸/电离实现了单细胞质谱成像，并通过全离子碎裂模式（AIF）模拟了脂肪酸分析前处理过程中的皂化反应，对包括甘油磷脂在内的主要脂质中的脂肪酸部分实现了共同分析。超高灵敏度、高分辨质谱检测器为单细胞内脂肪酸同位素检测提供了准确的定性、定量结果。研究人员通过鼠肝癌细胞的常氧-低氧模型，对检测方法进行了验证，确认方法的有效性。之后应用本方法分别检测了ATP柠檬酸裂解酶基因敲降（ACLY knockdown）鼠肝癌细胞以及携带异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变的小鼠胶质瘤脑组织切片，通过比较脂肪酸的同位素丰度变化评估脂肪酸从头合成比例以及外源性脂肪酸摄取的变化。分析结果揭示了在脂肪酸从头合成过程中，乙酰辅酶A池（Acetyl-CoA pool）中存在大量的空间异质性，这表明在微环境适应过程中发生了代谢重编程。01研究背景脂质在生物体生命过程中承担着多种重要作用，多数脂质是由脂肪酸合成而来。成年哺乳动物体内的细胞通常由血液中摄取脂肪酸，而脂肪、肝脏以及癌细胞还可以Acetyl-CoA为底物，从头合成脂肪酸[2]。Acetyl-CoA经过一系列代谢反应，可以生成含有16个碳的饱和脂肪酸棕榈酸（16:0），之后棕榈酸发生碳链延长或去饱和反应生成不同的饱和、不饱和脂肪酸，从而影响脂质组成。而Acetyl-CoA同样有多种来源，除了葡萄糖经由TCA循环生成的柠檬酸在ACLY作用下生成Acetyl-CoA以外，在缺氧环境下，葡萄糖后续代谢产物丙酮酸会转化为乳酸，从而无法合成Acetyl-CoA、进入脂肪酸合成途径。在此情况下，谷氨酰胺可通过还原羧化反应生成柠檬酸，进而合成Acetyl-CoA [3,4] 。另有文献报道，缺氧环境下的癌细胞还可以将乙酸作为脂肪酸合成的前体 [5,6] 。而Acetyl-CoA除了作为脂肪酸合成底物以外，对于蛋白翻译后修饰、基因表达等均有重要作用。通过监控脂肪酸合成和Acetyl-CoA代谢间的互动可以帮助我们深入理解癌细胞的生存状态。02分析方法大气压MALDI成像分析是通过AP-SMALDI5离子源配合Q Exactive plus高分辨质谱仪实现的。激光像素设置为 10×10 µ m，激光衰减器角度设置为33°。质谱在负离子模式下采用一级全扫描和全离子碎裂（AIF）扫描模式。AIF模式的隔离范围为 m/z 600-1000，扫描范围为m/z 100-400，分辨率 140k，最大注入时间500 ms，碰撞能量NC 25%。（图1）图1. 单细胞代谢流质谱成像分析流程（点击查看大图）MALDI分析前后，分别应用显微镜检测，确定细胞影像位置及MALDI消融标记位置。通过检测MALDI的消融标记，将其与细胞影像叠加，并通过应用数学公式进行解卷积，从而整合显微镜图像和MALDI图像。实现了应用MALDI成像质谱检测到的单细胞分子轮廓。（图2）图2. 整合显微镜和MALDI-MS分析结果实现单细胞质谱成像（点击查看大图）03鼠肝癌细胞常氧-低氧模型单细胞成像分析鼠肝癌细胞在添加25 mM的12C-葡萄糖或U-13C-葡萄糖后，用含1mM醋酸、2 mM谷氨酰胺和10%透析胎牛血清的无葡萄糖DMEM细胞培养基培养，在37°C、5% CO2的培养箱中在常氧（20% O2）或低氧（0.5% O2）条件下培养72小时。选择72小时的时间点是为了确保棕榈酸的同位素标记已经达到稳态。（图3）在低氧条件下培养的细胞被表达绿色荧光蛋白（GFP）标记。在共培养实验中，常氧和低氧细胞使用胰酶分离，每种条件下混合10000个细胞，在同一张玻璃片上进行培养，并在固定之前允许其附着3小时。图3. 由稳定同位素标记的13C6-葡萄糖生成细胞质Acetyl-CoA以及后续的脂肪酸和脂质合成途径（点击查看大图）通过质谱一级全扫描分析，质谱成像共检测到64种脂质，包括磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）等。具体脂质鉴定结果经过了常规LCMS脂质分析确认。在AIF模式下，检测到了11种含量最高的脂肪酸，相应检测结果同样与常规LCMS分析结果相符。为了验证本方法，研究人员检测了常氧-低氧培养的鼠肝癌细胞混合样本。通过对氨基酸同位素峰的定量分析，发现13C标记的棕榈酸（M0）主要在正常细胞中检出，而缺氧细胞中的棕榈酸以未标记状态（M+0）为主。通过GFP标记结果的对照，证明了本方法可以通过同位素峰分布有效识别不同培养状态的细胞。图4. 在常氧（GFP阴性）和低氧（GFP阳性）条件下的原代鼠肝癌细胞共培养模型的显微镜和质谱成像结果（点击查看大图）图5. 通过GFP标记验证识别不同培养模式细胞的准确性（点击查看大图）04单细胞Acetyl-CoA池标记水平分析研究人员使用了两种表达不重叠的shRNA序列（ACLYkd oligo1和ACLYkd oligo 2）细胞系以及一个对照组细胞系。通过使用1 μg/mL的四环素处理细胞72小时实现了ACLY沉默。质谱成像数据是以10 μm的像素大小获得的，每个细胞的平均面积为550μm2，平均每个细胞有12个像素。通过应用二项式模型计算每个细胞的acetyl-CoA池标记程度p值，从而量化细胞质中acetyl-CoA池中从葡萄糖衍生的同位素标记acetyl-CoA的比例。测试结果与预期相符，ACLYkd细胞中的acetyl-CoA池标记水平低于对照组。值得注意的是，两种ACLYkd细胞之间的差异非常明显。ACLYkd oligo1的结果呈双峰分布，p值的差异明显较大，表明该细胞系存在两个亚群体。其中一个模式显示的p值与对照组相近，说明存在一个“沉默失败”的细胞亚群。ACLYkd oligo1第二个模式具有的p值明显则低于ACLYkd oligo 2，表明ACLYkd oligo 1中还存在一个“强沉默”的亚群，在这些细胞中，沉默效率非常高，导致acetyl-CoA同位素标记比例大幅降低。在ACLYkd oligo 2中，acetyl-CoA池的标记程度以及GFP报告基因强度显示出更均一的分布。M+2峰是最能表现出ACLYkd oligo1细胞中“强沉默”群体的低acetyl-CoA标记表型的质谱峰。M+8峰则为对照组细胞的特征标记峰。M+2和M+8之间的差异可以作为显示异质性的指标，用于展示葡萄糖对细胞质中acetyl-CoA的相对贡献。因此，13C-SpaceM能够检测ACLY敲降细胞中的异质性，并识别不同的亚群体。这种单细胞和空间异质性无法通过整体分析揭示，显示了13C-SpaceM方法的独特优势。图6. 细胞ACLY敲降后acetyl-CoA的同位素标记程度分析（点击查看大图）05肿瘤组学中氨基酸合成异质性的空间组学分析研究人员分析了从横向植入表达突变型异柠檬酸脱氢酶（IDH）和红色荧光蛋白（RFP）的GL261胶质瘤细胞的小鼠大脑组织切片。在采集组织前的48小时，小鼠被喂食未标记的或含有U-13C葡萄糖的液体饮食。首先，研究人员分析了12C-葡萄糖饮食的肿瘤携带小鼠大脑切片中的酯化脂肪酸组成。通过比较质谱TIC与显微镜明场和荧光成像，发现整个大脑（包括肿瘤区域）的质谱离子响应很高（图7a）。测试过程中，肿瘤区域与组织切片的其余部分分别采用10μm和50μm激光分辨率进行分析。对不同脂肪酸的空间分析揭示了在非肿瘤携带的脑半球组织中，脂肪酸丰度存在高度的异质性，我们可以仅根据它们的脂肪酸组成来识别的某些结构，如胼胝体和前连合部，这两个区域都富含油酸（18:1）且棕榈酸（16:0）、硬脂酸（18:0）和花生四烯酸（20:4）的含量低。有趣的是，尽管棕榈酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸在肿瘤和周围的大脑组织中的含量相似，肉豆蔻酸（14:0）和棕榈酸（16:1）在肿瘤组织中则明显增加。与大脑其它部分相比，肿瘤中必需脂肪酸亚麻油酸（18:2）和α/γ亚麻酸（18:3）也明显增高。之后，研究人员分析了喂食含有U-13C葡萄糖饮食的小鼠肿瘤组织，从肿瘤组织中选择性分离出的5种主要从头合成的脂肪酸的同位素分布（图7c）。三种饱和脂肪酸肉豆蔻酸（14:0）、棕榈酸（16:0）和硬脂酸（18:0）的13C摄入丰度较高，同位素分布最大分别可至M+10，M+12和M+14。其中，肉豆蔻酸M+0的强度极低，几乎完全源自脂肪酸从头合成。由于肉豆蔻酸对一些重要信号蛋白的翻译后修饰很重要，这一发现表明胶质瘤可能选择性地上调肉豆蔻酸的合成以促进自身生长。相比之下，两种单不饱和脂肪酸，棕榈酸（16:1）和油酸（18:1）的M+0同位素的相对丰度较高。硬脂酸和油酸的M+2同位素丰度明显增加，表明它们是由未标记的前体（即棕榈酸和棕榈酸）延长形成的。研究人员进一步利用棕榈酸的同位素分布计算acetyl-CoA池中源自葡萄糖的比例，发现肿瘤组织内的该比例同样具有显著的空间异质性（图7d）。图7. 小鼠脑胶质瘤组织内部脂肪酸代谢空间异质性分析（点击查看大图）总结本文作者开发了一种全新的单细胞代谢流成像检测方法，将超高激光分辨率的大气压MALDI与高分辨率、高灵敏度的质谱检测器相结合，对细胞和肿瘤组织内的葡萄糖依赖性脂肪酸从头合成途径实现单细胞层面的空间分析。不仅为单细胞水平空间探测代谢活动提供了新的方法，还为正常和癌症组织中的脂肪酸摄取、合成和修饰分析提供了前所未有的视角。参考文献：1. Buglakova E, Ekelö f M, Schwaiger-Haber M, et al. 13C-SpaceM: Spatial single-cell isotope tracing reveals heterogeneity of de novo fatty acid synthesis in cancer. Preprint. bioRxiv. 2024 2023.08.18.553810. Published 2024 Feb 28. doi:10.1101/2023.08.18.5538102. Rö hrig F, Schulze A. The multifaceted roles of fatty acid synthesis in cancer. Nat Rev Cancer. 2016 16(11):732-749. doi:10.1038/nrc.2016.893. Metallo CM, Gameiro PA, Bell EL, et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2011 481(7381):380-384. Published 2011 Nov 20. doi:10.1038/nature106024. Wise DR, Ward PS, Shay JE, et al. Hypoxia promotes isocitrate dehydrogenase-dependent carboxylation of α-ketoglutarate to citrate to support cell growth and viability. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108(49):19611-19616. doi:10.1073/pnas.11177731085. Kamphorst JJ, Chung MK, Fan J, Rabinowitz JD. Quantitative analysis of acetyl-CoA production in hypoxic cancer cells reveals substantial contribution from acetate. Cancer Metab. 2014 2:23. Published 2014 Dec 11. doi:10.1186/2049-3002-2-236. Schug ZT, Peck B, Jones DT, et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 2015 27(1):57-71. doi:10.1016/j.ccell.2014.12.002如需合作转载本文，请文末留言。