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【背景】上个月发了个关于维生素D3的体验(详情参见http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题:【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验),基本上很是满意。做维生素D3的系统适用性时,药典上描述的是,经过高温和光照破坏,得到的前维生素D3峰、反式维生素D3峰,速甾醇D3峰,加上维生素D3主峰,一共为四个峰。但是我破坏后得到的却是五个峰。根据药典上得相对保留时间来核对,多了一个12.2min的峰(如下图)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172250_378375_1609327_3.jpg我的推测,可能是第二次高温光照时没有充氮,产生的VD3的降解产物。Arvid建议我充氮保护一下,再做一次,验证会不会还出现12min的那个峰。雪妖版主也指出,因为没有做溶剂空白,也不能排除是溶剂高温光照产生的。因此,我这次就做了这个实验,来大概确认一下其来源。【色谱条件】仪器型号:Agilent 1260;检测器:DAD检测器;色谱柱:TopsilTM(拓谱)Silica Si 4.6*250mm 5μm;流动相:正己烷-正戊醇(997:3);检测波长:254nm,流速:2 ml/min。【实验设计】有了上一次的实战经验,这次做的有点驾轻就熟。因为上次光照的时间问题,这次有意识的延长了一段时间。本次试验持续了两天。第一天,只是单纯的想搞清楚12min的峰的来源,以及未充氮的可能影响。但是最终结果不是很理想(结果部分有详细介绍)。因此在第二天的试验设计中,为了更好的搞清楚高温和光照以及不充氮对维生素D3各有什么样的影响,选择空白溶剂、充氮样品,未充氮样品进行对比,并把高温后未光照的样品作为一个监测点。【试验结果】第一天:因为流动相为两种混合溶剂,特别是正戊醇含量特别少,每次配制流动相的细微差异可能会导致主峰保留时间的移动,因此先确定主峰的保留时间。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172254_378376_1609327_3.jpg充氮及未充氮样品高温光照后的结果:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172259_378377_1609327_3.jpg可以看到,12min处几乎没有峰。难道是上次的样品被污染出现的?为什么这次又没有踪迹了呢?奇怪!但是,后面应该出现速甾醇的位置也没有峰。充氮和未充氮的谱图基本上没有什么差异,只是6min的地方多出一个峰,而且未充氮的更大一些。肯定还是哪个地方有问题。或者,光照的强度不够??因为我的紫外荧光仪是很老的设备了,灯管处的玻璃都出现锈蚀了。第二天:把昨天未倒掉的样品又经历了高温和光照的过程。检验结果见下图。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172315_378381_1609327_3.jpg奇怪不? 12min的峰及速甾醇都出现了,6min的峰倒快消失不见了!一头雾水啊!重新称样品,一步一步的重新开始做。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172319_378382_1609327_3.jpg基本可以判断溶剂与12min的峰没有任何关系!然后是样品的结果:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207172320_378383_1609327_3.jpg果然,不管是充氮的,还是未充氮的样品,在经历了高温和光照后都出现了12min的峰。说明12min的峰是与维生素D3相关的物质!而且,只高温未光照,不管是充氮或者不充氮,均没有出现12min的物质,因此可以判定,其的出现,和光照有直接关系!速甾醇(主峰后的峰)在高温未光照的充氮样品中没有出现,光照后出现,证明和光照相关;在高温未光照的未充氮样品也有出现,说明和氧气也有一定的相关性;而光照后的未充氮样品中速甾醇的峰高峰面积增大,则进一步确证其和光照是相关的!【结论】1. 确认保留时间在12min的峰不是溶剂高温或光照产生的。2. 确认保留时间在12min是VD3的相关物质,并且与光照有关。3. 速甾醇的产生,和氧气及光照均有关系。4. 12min、14min、15min、19min、25min、30min的物质都是VD3的相关物质。为何?14min为前维生素D3,15min为反式维生素D3,30min为速甾醇,这是中国药典上规定的,不必解释。19min和25min是VD3样品中(参见维生素D3的有关物质检验谱图,http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20120629/4119572/主题:【原创】【极限体验】记一次维生素D原料的入厂检验),12min也已经确认是维生素D3的光照产物。
请教:注射用水溶性维生素中关于烟酰胺、等5项的液相检测方法其标准为烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠和核黄素磷酸钠 照高效液相色谱法(中国药典1995年版二部附录Ⅴ D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用氨基键合多孔硅胶为填料,以(0.02mol/L)磷酸二氢钾溶液-乙腈(27:73),用10%盐酸溶液调节pH为5.3的溶液为流动相,流速为1.5ml/min,检测波长:烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠为214nm;核黄素磷酸钠用萤光检测λEX=445nm、λEM=520nm。各组分的分离度应符合要求。 对照品溶液的制备 (1)取烟酰胺对照品约150mg、硝酸硫胺对照品约12mg、盐酸吡哆辛对照品约18mg、泛酸钠对照品约62mg,分别精密称量置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度摇匀,精密量取2ml置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即为对照品溶液(Ⅰ),此溶液置暗处充氮气于零下20℃可保存1个月。(2)取维生素C钠对照品约425mg、核黄素磷酸钠对照品约19mg,精密称定,置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀,精密量取2ml置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀即为对照品溶液(Ⅱ),此溶液必须临用新鲜配制,并于零下20℃保存,用前放置至室温。 等容混合对照品溶液(Ⅰ)和对照品溶液(Ⅱ)即为对照品溶液。 供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物约2瓶重量,精密称定,置100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取15ml置200ml量瓶中,用流动相稀释至刻度。 测定法 取对照品溶液和供试品溶液各10μl,交替注入液相色谱仪,测定,用外标法计算各组分含量,即得。目前存在问题用紫外检测的分不开5种组分,大家有什么好办法,谢谢
【背景】最近购置了一批原料用于生产,大部分是维生素类的。实验室内部按照各品种的检验规定,对检验内容进行了分工。因为我做液相比较多,所以,分到我手里的,都是液相的检验项目。其中,就含有以下内容中要提到的维生素D3。【色谱条件】仪器型号:Agilent 1260;检测器:DAD检测器;色谱柱:TopsulTM(拓谱)Silica Si 4.6*250mm 5μm;流动相:正己烷-正戊醇(997:3);检测波长:254nm,流速:2ml/min。基本上严格按照2010年版《中国药典》二部附录 Ⅶ K中维生素D测定法中第一法来做。(可能有版友会问到,什么叫“基本上严格按照….来做”,答案就在文中。)【实验过程】首先按照药典中的规定,配制系统适用性供试液。通过高温和光照,对维生素D3对照品进行破坏,得到前维生素D3峰、反式维生素D3峰,速甾醇D3峰。药典中规定的方法是:量取对照品贮备液5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加热1小时,取出,迅速冷却,加正己烷5ml,摇匀,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下,将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5~6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3及速甾醇D3。但是完全按照药典的方法,得到的前维生素D3及速甾醇D3非常小。放大了看,前维生素D3还能认为是一个峰,而速甾醇D3连认为是一个峰都很勉勉强强。没办法,只能延长高温和光照的时间来达到目的(图1即为得到的图谱)。分离度什么的都能达到要求,分别为3.638、1.981、14.767、2.638。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206291837_375047_1609327_3.jpg 图1 系统适用性图谱做好了系统性适用性,剩下的有关物质和含量全部迎刃而解。上传图谱大家鉴赏一下吧。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206291837_375048_1609327_3.jpg图2. 有关物质图谱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206291838_375049_1609327_3.jpg图3. 含量图谱【结果】顺利完成检验任务!【结论】[