促红细胞生成素标准品

抗体或激素等重组蛋白在生物制药市场具有良好的发展前景。目前，重组蛋白主要在中国仓鼠卵巢细胞中生产，这种类型的生产非常昂贵的。因此，人们需要开发新的、更便宜的和有效的表达系统。微藻便成为了一种很好的替代品，因为，微藻作为光合单细胞生物，它们的生长不需要昂贵和复杂的培养基，同时也能够在培养基中分泌蛋白质并进行蛋白质N-糖基化。近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Fine-tuning the N-glycosylation of recombinant human erythropoietin using Chlamydomonas reinhardtii mutants”的研究论文。作者主要研究莱茵衣藻N-聚糖免疫原性表位缺失而开发的敲除策略是否适用于治疗蛋白的糖工程，这对于进一步开发微藻生产人类相容性生物制品至关重要。该研究进行了与人促红细胞生成素(hEPO)相关的聚糖的结构研究，以及这些聚糖在野生型莱因哈特氏C.菌株和关键高尔基糖基转移酶受损的突变体中表达。通过在野生型菌株中表达的重组hEPO (rhEPO)的糖蛋白组学分析表明，3个n -糖基化位点与含有4 ~ 5个甘露糖残基、携带核心木糖、核心焦点和o -甲基的成熟n -聚糖100%糖基化。此外，在C. reinhardtii插入突变体中，木糖基转移酶A、B和聚焦转移酶缺陷的表达导致与rhEPOs相关的n -聚糖的核心木糖基化和核心聚焦化急剧减少，从而表明该策略为衣原体制备的生物制品的n -糖基化人源化提供了前景。文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14424

随着体育商业化的兴起，兴奋剂的社会影响也不断增大。信息化技术的普及，使得各种各样的新型兴奋剂药物和方法层出不穷，因而开发新的兴奋剂检测方法以促进正当的体育运动的发展是极为必要的。日前，我们参观了日本化学分析中心反兴奋剂研究实验室，了解到有关兴奋剂检测的现状以及采用多级质谱分析法进行兴奋剂检测的新理念。 受访客户Makoto Ueki博士， 日本化学分析中心反兴奋剂研究实验室主任 采访 岛津：您一直在关注开发新的兴奋剂检测方法。您能首先向我们介绍一下传统的兴奋剂检测方法吗？ 客户：到目前为止，能够按照指定的分析条件自动识别目标化合物的靶标分析（Targeted analysis）成为了主流。在奥运会等大型国际竞赛中，这种方法对许多兴奋剂药物进行高灵敏度和高通量的多成分分析非常有用。然而，由于每年都会有新的药物添加进世界反兴奋剂组织禁用物质和禁用方法的清单中，我们必须对按照禁用药物的性质对其分类，将被测目标药物进行分类，采用50台仪器进行人海战术检测。这种类型的分析约占传统药物分析的60－70%，例如兴奋剂和麻醉性镇痛药。 岛津：您们采用什么样的设备进行上述分析? 客户：是气相色谱质谱联用仪（GC-MS）。虽然我们在实验室中使用不同厂商生产的不同类型的气相色谱-质谱联用仪，但我们经常使用的是岛津公司开发的气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010 Ultra。高效的目标化合物一分析功能体现在可根据目标化合物自动改变仪器的条件和目标离子，并根据保留指数将他们识别出来。基于这一目的，仪器的稳定性以及与工程师讨论激发仪器的潜能变得至关重要。此外，我们对岛津公司生产的产品在高通量性能、稳定性以及售后支持方面充满信任。此外，我们还对突破靶标分析局限性的技术创新一直保持关注。 岛津：您能具体地告诉我们是什么样的局限性吗? 客户：目标化合物的分析存在局限性是因为我们必须提前对目标物质进行设定和优化测试条件。举例来说，那些不允许使用的药物，也就是我们所谓的&ldquo 非常规药物&rdquo 和&ldquo 仿制药物&rdquo ，它们是在现有药物的结构基础上稍加修饰，这些药物的使用已经成为一个社会问题。这些化合物通常保留着某种药理活性，在地下市场销售，没有合格的安全评估措施。此外，由于这些化合物的分子量和化学特性与现有药物有所不同，在高目标性目标化合物检测过程中，它们作为非目标物质无法被检测到。因此，这就是这些药物成为漏网之鱼的原因。对这些非法行为助纣为虐的不法分子，只是复制或者制作药物类似物并将其在互联网的虚拟药房中出售。然而，一旦发现了未经批准的未知药物，实验室专家必须采取一系列的步骤来建立一种测试方法：首先，确定药物的安全性；第二，搜索用于测试的代谢物标记，开展应用研究或人体研究；第三，因为建立药物检测方法是一项很耗时的工作，一种药物进入反兴奋剂检测目录的时间取决于其检测方法建立的时间&rdquo 。正如人们常说的&ldquo 我们在玩一场猫鼠游戏&rdquo 。 岛津：有什么对策吗? 客户：对策就是制定一种符合各种药物检测而不仅局限于目标化合物的分析方法。 岛津：您能说得具体一点吗？ 客户：目标分析可以表示为&ldquo 使用高灵敏度的分析方法在废物中检测痕量目标物质的过程&rdquo 。这意味着我们要进行样品前处理，以减少其他非目标化合物，并努力通过特定的仅用于发现目标离子的测试条件。换句话说，不受监管药物和仿制药物被作为干扰在前处理时已经排除在外。因此，我们要在同一检测条件下，尽可能多的同时检测更多的化合物，使得被测物不会在检测过程中丢失，采集最广泛和最多的质谱信息，并将其作为数据库存放。这里我们及时地发现了已知化合物的信号，而未知化合物的信号也被记录了下来。如果这个未知化合物没有在健康的、未服用违禁药物的人体内发现过，那么这个化合物的出现就非常可疑，这个未知物就可能是一个外源物或者其代谢产物。接下来，我们使用质谱仪对这个未知的组分进行结构分析，发现潜在的兴奋剂药物。 岛津：您们需要什么样的质谱仪进行这种分析? 客户：许多化合物都需要被这种类型的分析所涵盖。因此，我们使用可以产生质谱裂解碎片的液质联用仪（LC-MS），这种仪器可以提供高分辨的多级质谱离子。在我们拥有的仪器中，岛津LMCS-IT-TOF质谱仪可以满足这一要求。在靶标分析中使用气相色谱-质谱联用仪，通过酸性、中性和碱性溶液提取、净化和分离靶标化合物，并按照它们的化学特性进行衍生化。换句话说，相当多的靶标分子在这一阶段可以得到确定。另一方面，使用液相色谱仪，不需要上述复杂的准备工作就可以加载样品， 液相色谱柱比气相色谱的毛细管色谱柱有更好的柱容量，并且相对于气质联用中的低分辨质谱，液质联用能够提供高分辨多级质谱信息。大约在10年前人们就提出了这一概念，即非靶标分析。在那时，我们和许多厂商一样，对于使用飞行时间质谱仪（TOFMS）进行药物筛选的做法一无所知，因为飞行时间质谱仪在过去主要用于生物聚合物分析。近来，LCMS-IT-TOF质谱仪被认为是用于对包含多个未知化合物的小分子进行多组分同步分析的一种有力工具。现在，人人都可以使用飞行时间质谱仪进行这类分析。 岛津：IT-TOFMS是我们公司独有的一种技术。公司的工程师历经万难，在保持高分辨率和高精确度的同时将离子肼中捕获的离子转移到飞行管中。得知这一技术对于您们的研究非常有用我们很高兴。还有其他您们正在处理的问题吗？ 客户：有，是生物聚合物，尤其是糖蛋白激素。促红细胞生成素（EPO）&mdash &mdash 一种最为有名的促进造血干细胞分类成红细胞的激素&mdash &mdash 最为有名。促红细胞生成素的重组蛋白药物被用作治疗肾原性贫血药物。有时重组蛋白药物也被用作兴奋剂药物，主要是通过增加血红蛋白提高人体的耐受力。然而，很难将人体本身分泌的天然蛋白与重组蛋白药物区分开来。 岛津：如何进行区分？ 客户：一般来说，采用免疫分析法或蛋白免疫印迹法。准备一个与某一特定糖蛋白激素相结合的抗体，在产生荧光或化学发光时粘合标记试剂，同时将抗体绑定在靶标激素上，这样我们就可以从数量上测试丰富的糖蛋白激素。由于我们预先决定了将要观测的糖蛋白激素，因而这也是一种类型的靶标分析。一种免疫学方法只能检测一种靶标物。我们使用尿液样本进行EPO筛查，需要48－72小时的时间。 我们对所有的运动员或注册的运动员在竞赛前进行血液筛选测试， 掌握血红蛋白和红细胞的数量以及母红细胞的比率。基于这一结果，那些显示出不利分析结果的运动员进一步接受蛋白免疫印迹法测试。然而，我们发现在一些不明案例中，尽管尿液中包含的EPO电泳不同于参考标准中规定的EPO电泳，但血液测试结果似乎显然是可疑的。 岛津：为什么会这样？ 客户：促红细胞生成素是医药界最重要的重组蛋白药物之一。第一代重组蛋白药物在世界上投入实际使用并获得专利，但这些专利将在2000年中期到期。与此同时，许多类似药物（仿制药物），即具有不同结构的生物仿制药在世界各地问世。在未作说明的情况下，重组促红细胞生成素被认为是天然促红细胞生成素的类似物，但具有不同的免疫电泳特征。重组蛋白质药物是在用转基因的CHO细胞培养出来的，转基因CHO细胞是由靶标蛋白质编码基因转录。这一方法可合成糖蛋白，其核心蛋白质的氨基酸序列与靶标蛋白质相同。然而，糖链结构是无法控制的，因为糖链结构不直接受基因的控制。重组糖蛋白的糖链结构取决于可用的糖基转移酶和在培养条件下单糖的存在比例。因此，我们可以容易地推断出第一代促红细胞生成素与其生物仿制药的区别在于他们的糖类。实际上，我们在过去几年的研究验证如下：1）第一代促红细胞生成素与其生物仿制药具有同样的核心蛋白质氨基酸序列和聚糖结合位点；2）天线结构、末端结构和单糖比例在聚糖总体上存在着很大差别；3）第一代促红细胞生成素与其生物仿制药在如上所述的糖类上存在的差异与根据等电聚焦电泳的结果推断出它们在等电点上的差异是一致的。 岛津：您们使用质谱仪进行这种研究吗？ 客户：是的，我们采用前面解释过的岛津LCMS-IT-TOF质谱仪和飞行时间质谱仪AXIMA Resonance进行这种研究。质谱仪采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）作为离子源，通过IT-TOFMS进行检测。许多制药公司对其生产的促红细胞生成素产品进行研究并作了报道。我们的目标是基于市场上分销的重组糖蛋白药物，分析世界反兴奋剂组织（WADA）禁止的糖蛋白药物及其生物仿制药。所以，我们需要研究每个目标糖蛋白的特征。为了做到这一点，事实上我们并不只是识别和区分几何异构体， 我们需要直接用碰撞诱导解离多级质谱（MSn CID）确证糖链的结构。我们采取的是一种传统的做法，而不是特殊的方法。首先，糖蛋白被胰蛋白酶消化；其次，N-端聚糖被N-糖酰胺酶从核心蛋白上分离，因此，我们得到的酶切共由三部分构成：结合到短O-端聚糖上的糖肽、胰蛋白酶解肽和N-端聚糖。最后，我们对这些样品进行MS分析。在N-端聚糖被转化为腙提取后，LCMS-IT-TOF 和AXIMA Resonance可以分析整个糖结合的核心蛋白结构、聚糖结合位点和所有结合糖的单糖比例。大量报道显示，糖蛋白激素的生物活性取决于天线结构、末端结构和唾液酸含量，因而需要通过各种限制性内切酶进行分析，并且提取过程通常非常复杂。然而，由于结合位点能够通过多级MSn (n3) CID测试加以识别，因此，我们可以通过在胰蛋白酶消化的O-接连聚糖结合位点中包含多种丝氨酸残基进行验证。 岛津：是的，数据量非常庞大。根据这些大量的结果，我认识到这是一种您和贵公司的员工用辛勤汗水浇灌出来的产品。根据您的解释，如果检测系统是IT-TOFMS，那ESI 或MALDI都可以做这样的分析，对吗？ 客户：不对。我们实验室使用的MS仪器大约有10台。然而，没有一台仪器是相同的。每一台仪器都有不同的离子透镜、离子源和接口。目的不同，使用的仪器也不同，通过几种仪器来验证一种方法。与基础研究不同，测试方法开发是一种技术转化手段，也就是说，其意图在于与世界上的其他机构共享该方法。然而，我们的同行并非总是与我们拥有相同的ESI或MALDI。你很难意识到，即使我们测试相同的样本，一些肽或聚糖的相对信号强度在LC- 和 MALDI-IT-TOFMS串接的质谱上是不同的。当然，质谱模式也会变得不同。我们在此基础上努力寻求一种能够在不同平台进行检测的可重复的条件，因为我们不能将仅在世界上某一特定仪器上实现检测的方法称之为&ldquo 标准&rdquo 。 岛津：完全赞成。 客户：我们知道在一些情况下，在液质联用法原始糖蛋白测试中信号强度较高的胰蛋白酶消化肽，不能通过MALDI-MS试验检测，反之亦然。当肽包含多种碱性氨基酸或者胰蛋白酶消化的检测敏感度取决于离子化特性时，这种情况经常发生。因此，分析一个高信号强度的峰并不意味着我们总能获得一个稳定而灵敏的结果。但是提供这种负面信息对于改进兴奋剂检测方法以及标准化至关重要。 岛津：我明白了。考虑到国外其他机构会使用这一方法，就验证而言，需要两种离子化的质谱仪。我非常清楚这一点。如果分析是由不同的机构做出的，操作人员的技能水平会对测试有影响吗？ 客户：我们对质谱分析法的预计包括这一点，但我们认为这不太可能发生。直观地认识到测试结果的准确性对我们来说很重要。如果测试结果不理想，我们将通过检查谱图找出出错的部分。还有一个优点是，我们能够在同一时间及时地进行多组分分析。液质联用（LC-MS）和气质联用（GC-MS）都可以进行这种分析。例如，近年来代谢物组学分析越来越流行，与前面提到的ESI 和 MALDI一样，代谢物组学分析离子化方法是不同的，因此对于很难通过LC-MS检测的碳氢化合物（烃类）和类固醇分析非常有用。以前，为了使多组分同步分析自动化，我们自己动手编写了数据处理宏程序和报告。感谢你们为满足我们的要求而付出的努力。尽管要花很长一段时间，但在某种程度上我们可以按照客户具体要求制造，现在我们对客户更加友好了（笑）。在未来，如果你们支持能够存储和更新重要数据的改进的软件，这些数据来自没有标准样品的新的化合物，使用起来就会更加得以应手。这将有助于质谱分析仪作为通用设备而扩大使用用途。 岛津：完全正确，现在我们正在按照目的积极提供分析条件，我们称之为分析方法包，并且我们正在建立识别数据库。 客户：复合（质谱）仪也非常必要。我们承受不了靶标化合物发生改变就更改设备的做法。就这一点而言，允许我们只要改变条件就能进行多种分析的质谱仪颇具吸引力。 岛津：感谢您们对质谱仪寄予了极高的期望。您们对质谱仪还有什么不满意的地方吗？ 客户：嗯&hellip &hellip 首先是质谱仪的灵敏度。在目前的兴奋剂检测中提取的尿样数量最多为70mL至90mL。也就是说，质谱仪的灵敏度应提高100倍。第二是价格问题。在一场国际比赛中，应在短期内处理分析大量的尿样，所以引入质谱仪可能需要巨额投资。 岛津：最后，我们想请问您对未来兴奋剂检测的看法？ 客户：正如我所提到的，许多药物相继被生产出来，并有许多使用者在服用。自互联网消除信息阻碍后，新药物发展的速度大大加快。我们实验室的科学家已经远远落后于这一发展进程，因为我们首先要保证检测结果的可靠性和安全性。所以我认为我们的目标是缩短在多个领域积极引入其他可用技术的研究时间。正如我先前提到的，在正在进行的糖蛋白研究中，日本的研究处于非常高的水平，并且在这一领域这些技术独一无二。不幸的是，许多西方兴奋剂控制实验室还未能引入这些技术。尽管糖蛋白测试目前停滞不前，但我们认为在未来研究人员会取得突破性的进展。即使我们能做的事情将受到限制，我们仍愿意让整个世界知道日本开发出的这一现有技术，以及该技术通过将兴奋剂问题最小化而对合法体育运动的发展做出的贡献。 岛津：非常感谢您抽出的宝贵的时间接受这次采访。这对我们很有帮助。 对这次采访的评论 在日本化学分析中心反兴奋剂研究实验室，我们的核心产品，例如气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010 Ultra , 高效液相-离子阱-飞行时间质谱联用仪LCMS-IT-TOF质谱仪和基质辅助激光质谱仪AXIMA Resonance支持着实验室研究人员的日常研究活动。通过这次采访，我了解到即使是由于电离差异和检测系统引起的问题也反映在他们的研究之中，而这些问题通常被仪器工程师所忽略。这给我留下的印象相当深刻，实验室研究人员的严谨工作态度源于他们坚持发展合法体育运动和向社会贡献研究成果的强烈信念。为了最大化发挥一系列多种分析仪器的优势，我们愿意向我们的顾客继续提供更优的解决方案，以回应我在今天听到他们提出的要求。 使用的仪器：气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP2010 Ultra）、高效液相-离子阱-飞行时间质谱联用仪（LCMS-IT-TOF）、基质辅助激光解吸附电离-离子阱-飞行时间质谱仪（AXIMA Resonance） 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有13个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

前言 随着人类对生物学领域深入探索和科技创新的不断发展，目前越来越多的研究院所和生物制药公司将细胞水平的功能性研究、模型建立及药物筛选做为一个重要的研究/研发手段。而高内涵成像分析系统就为这种细胞水平的研究提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体的新的检测平台。干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体干细胞。正是干细胞的这种特性，为细胞生物学的研究提供了更有力的永生化的稳定细胞株。干细胞水平的研究比在普通的细胞株提供了更接近临床相关性的生理学信息；并且比原代细胞相比更容易获得，且具有更好的实验重复性。 干细胞的研究与其他细胞水平的研究有一些相似之处，但其关键的不同点在于在干细胞的研究过程中干细胞的分化。干细胞水平的实验比传统的单线性/单参数的实验具有更多的检测目标，包括其分化能力、分化过程、分化类型及不同类型的量化分析统计等。高内涵成像分析系统以其自身的高分辨率、多参数及智能化分析的特性，恰如其分的满足了干细胞研究的以上需求，而高内涵成像系统的自动化和高通量的特点又以海量的有效数据加速了该研究的过程。 利用高内涵成像分析系统可完成干细胞研究的自动化图像获取及多参数分析，目前常用的全能性干细胞分化研究主要有三类：造血细胞、神经细胞和诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）来源的心肌细胞（图1）。图1：全能干细胞分化层次图应用实例1． 神经祖细胞向神经球分化研究冷藏保存的神经祖细胞（StemCell Technologies, mouse Cells）培养在6孔板内，在培养基中加入不同的生长因子，培养6天后通过ImageXpress Micro对每孔内神经球进行无标记相差成像，并对的神经球的面积进行自动化定量分析。结果如下（图2）： 图2：神经球无标记检测及分析（ImageXpress Micro 20X 相差物镜）2． 神经干细胞向神经元及胶质细胞分化研究神经干细胞在加有EGF（表皮生长因子）和bFGF（成纤维细胞生长因子）的培养基中培养1-2天，然后在分化培养基中培养12-14天。加入EPO（促红细胞生成素）后，检测为神经球向神经元及胶质细胞的分化情况。ImageXpress Micro进行自动化图像获取，运用细胞分类（Cell Scoring）模块进行神经元/胶质细胞阳性率分析，运用神经生长（Neurite Outgrowth）模块进行神经元突触长度及数量分析。结果如下（图3）：图3：神经干细胞分化检测及分析。图（上）表示加入（左）及不加（右）神经细胞的分化图片；图（下）表示不同条件下神经元细胞的阳性率（左）及神经元突出的长度（右）。（ImageXpress Micro 20X物镜）3． 造血祖细胞向骨髓细胞及血细胞分化研究人源CD34+造血祖细胞培养在96孔板中，加入多种不同的造血细胞因子组合（SCF+Flk3+TPO/SCF+IL-3+GM-SCF）后，通过检测CD45和CD15两种标记物在细胞内的表达量，统计分析不同造血细胞因子组合对造血祖细胞的自我更新能力及骨髓细胞分化能力的变化。结果如下（图4）：图4：检测细胞内CD45和CD15的阳性率，评价造血祖细胞在不同条件下的自我更新能力及定向分化能力4． 诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）向心肌细胞分化研究iPS细胞（Celprogen）在专用培养基中培养3-7天，同时检测7种不同标志物的表达量，以判断心肌细胞分化及成熟的状态。下图（图5）中显示Oct4（干细胞标记物）和a-Actinin（心肌细胞标志物）在细胞内的表达情况：图5：iPS细胞分化情况（ImageXpress Micro 20X 物镜）5． iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验临床前安全性评价是药物研发过程中非常重要的环节，早期的心脏毒理学研究将会大大降低在进入临床研究阶段后因药物毒性带来的投入风险。iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验为药物心脏毒性评价提供了一个高效的体外细胞水平的检测方法。心脏跳动可通过传统电生理的方法来检测，用高内涵成像分析系统来进行检测及分析是一个全新的挑战。Molecular Devices公司最近一代的高内涵成像分析系统ImageXpress Micro XL以其最新一代的检测器sCMOS（采样频率可达100pfs）和自定义模块分析功能，完全可出色完成心肌细胞跳动实验的快速检测及分析要求。iPS细胞来源的心肌细胞单层培养在96或384孔板中，心肌细胞会自发跳动同步收缩。加入Calcein-AM染料孵育10min后，撤掉培养基，再加入不同浓度的化合物，置于ImageXpress Micro XL活细胞培养装置中，检测心肌细胞跳动频率的变化。结果如下（图6）：图6：iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验（ImageXpress Micro XL 20X 物镜）总结 干细胞研究作为一种复杂的细胞水平检测模型，需对干细胞的生长、增殖、分化能力、分化类型及状态等多种参数进行检测及定量分析，为疾病治疗研究及药物研发提供了更有效的研究手段。Molecular Devices公司的ImageXpress高内涵系统提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体高内涵成像分析系统完全解决方案，可满足以上研究需求（图7）。图7：Molecular Devices公司针对干细胞研究的高内涵成像系统完全解决方案