羟基异亮氨酸对照品

p　　近年来，随着精准医学和个体化诊疗的发展，临床诊断的重心正逐渐趋向于“精准”,先进的检测技术是实现精准诊断的前提。质谱作为临床检测新技术，在生命组学、精准医疗及临床医学中发挥着越来越大的作用。随着质谱技术的发展及普及，其在临床诊断中的应用也越来越多。截至目前，通过CFDA医疗器械注册且尚在有效期内的质谱相关试剂盒产品共10项，其中进口试剂产品5项，国产试剂产品5项。以下为这些产品详细的CFDA医疗器械注册信息。/pp　　strong进口：/strong/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong1.琥珀酰丙酮样本前处理液(串联质谱法)/strong/span/pp　　注册证编号：国食药监械(进)字2014第3403746号/pp　　注册人名称：NeoBase™ Succinylacetone Assay Solution/pp　　型号、规格：1 小瓶，2.8 mL。/pp　　结构及组成：琥珀酰丙酮样本前处理液： 为稀释的含水联氨溶液。(具体内容详见说明书)/pp　　适用范围：本试剂用于体外测量与评估滤纸干血斑样本(DBS)中琥珀酰丙酮浓度试验中的样本处理。/pp　　批准日期：2014-08-01/pp　　有效期至：2019-07-31/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong2. 非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒(串联质谱法)(NeoBase™ Non-derivatized MSMS Kit)/strong/span/pp　　注册证编号：国械注进20173400071/pp　　注册人名称：Wallac Oy/pp　　代理人名称：珀金埃尔默医学诊断产品(上海)有限公司/pp　　型号、规格：960人份/盒/pp　　结构及组成：含氨基酸内标准品、酰基肉碱内标准品、干血斑质控品、V型底耐热微孔板、V型截底透明微孔板、铝箔制微孔板封套、粘性微孔板封套、微孔板条形码标签、特定批号的质量控制证书。(具体内容详见说明书)/pp　　适用范围：本试剂盒用于测量和评估采集到滤纸片上的新生儿干血样中的氨基酸、琥珀酰丙酮、游离肉碱以及酰基肉碱的浓度。包括以下分析物，氨基酸：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸/异亮氨酸/羟基脯氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸 肉碱：游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱/ 3-羟基-丁酰肉碱、丁酰肉碱、甲基丙二酰肉碱 / 3-羟基-异戊酰肉碱、异戊酰肉碱、异戊烯酰肉碱、戊二酰肉碱 / 3-羟基-己酰肉碱、己酰肉碱、已二酰肉碱、辛酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳酰肉碱(肉豆蔻酰肉碱)、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、十六碳酰肉碱(棕榈酰肉碱)、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、18碳酰肉碱(硬脂酰肉碱)、18碳烯酰肉碱(油酸肉碱)、18碳二烯酰肉碱(亚油酸肉碱)、3-羟基-十八碳酰肉碱、3-羟基-十八碳烯酰肉碱 酮：琥珀酰丙酮。(具体内容详见说明书)/pp　　批准日期：2017-01-11/pp　　有效期至：2022-01-10/pp　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　3.VITEK MS-CHCA Matrix for use with VITEK MS/strong/span/pp　　注册证编号：国食药监械(进)字2014第1401567号/pp　　注册人名称：bioMerieux,SA/pp　　型号、规格：5× 0.5 mL/pp　　结构及组成：α-氰基-4-羟基-肉桂酸、乙醇、乙腈和溶剂。(具体内容详见说明书)。产品有效期：2-8℃下避光储藏,有效期12个月。附件：注册产品标准，产品说明书。/pp　　适用范围：用于质谱样本的预处理。/pp　　批准日期：2014.03.28/pp　　有效期至：2018.03.27/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong4. 多种氨基酸和肉碱测定试剂包(串联质谱法) (NeoGram Derivatized Assay Solutions/strong/span/ppspan style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　　)/strong/span/pp　　注册证编号：国械注进20163401510/pp　　注册人名称：Wallac Oy/pp　　代理人名称：珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司/pp　　型号、规格：流动相溶剂：473 mL/瓶× 3瓶 萃取液：237 mL/瓶× 1瓶 复溶溶液：237 mL/瓶× 1瓶 3.0 N盐酸正丁醇：110 mL/瓶× 1瓶。/pp　　批准日期：2016.04.19/pp　　有效期至：2021.04.18/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂)：含流动相溶剂、萃取液、复溶溶液、3.0N 盐酸正丁醇。(具体内容详见说明书)/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：本产品与多种氨基酸和肉碱测定试剂盒(串联质谱法)配合使用，用于测量采集到滤纸片上的新生儿足跟穿刺干血样中的氨基酸、游离肉碱以及酰基肉碱的浓度。/pp　　产品储存条件及有效期：(体外诊断试剂)2～30° C 避热避光条件下保存，有效期 15个月。/pp　　strongspan style="color: rgb(255, 0, 0) "5. 多种氨基酸和肉碱测定试剂盒(串联质谱法)(NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit)/span/strong/pp　　注册证编号：国械注进20163401511/pp　　注册人名称：Wallac Oy/pp　　代理人名称：珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司/pp　　型号、规格：1920人份试剂/盒/pp　　批准日期：2016.04.19/pp　　有效期至：2021.04.18/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂) ：含氨基酸内标准品、酰基肉碱内标准品、干血斑质控品、V 型底耐热微孔板、V 型截底透明微孔板 、铝箔片微孔板封套、粘性微孔板封套、热封膜、微孔板条形码标签、与批次匹配的质量控制证书。(具体内容详见说明书)/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：本试剂盒用于测量采集到滤纸片上的新生儿足跟穿刺干血样中的氨基酸、游离肉碱以及酰基肉碱的浓度。具体分析物见附件。/pp　　产品储存条件及有效期：(体外诊断试剂)2～8° C条件下储存,有效期为12 个月。/ppstrong　　国产：/strong/pp　strongspan style="color: rgb(255, 0, 0) "　1. 同型半胱氨酸检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法)/span/strong/pp　　注册证编号：沪械注准20162400091/pp　　注册人名称：上海复星长征医学科学有限公司/pp　　型号、规格：100人份/盒/pp　　批准日期：2016.02.15/pp　　有效期至：2021.02.14/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂) ：主要组分 剂型 规格 主要组成成份内标液(N1) 液体 1ml DL-高胱氨酸-D8 还原剂(H2) 固体 0.277g/瓶 1,4-二硫苏糖醇 蛋白沉淀剂(T3) 液体 1ml 三氯醋酸对照品(D4、D5、D6) 液体 3??50μl DL-同型半胱氨酸 质控品(Z7) 液体 1??50μl DL-同型半胱氨酸 稀释液(X8) 液体 1??ml 小牛血清水溶液/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：供医疗机构用于体外检测人血清或血浆样本中同型半胱氨酸的含量，作辅助诊断用。/pp　　产品储存条件及有效期(体外诊断试剂) ：2～8℃避光,12个月/pp　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong2. 25-羟基维生素D检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法)/strong/span/pp　　注册证编号：沪食药监械(准)字2014第2401132号/pp　　注册人名称：上海复星长征医学科学有限公司/pp　　型号、规格：100人份/盒/pp　　结构及组成：A液：甲酸、甲醇 B液：甲酸、甲醇 pH调节剂：氢氧化钠 校准品1、2、3、4：25(OH)VD2、25(OH)VD3及小牛血清 质控品1、2：25(OH)VD2、25(OH)VD3及小牛血清 内标：25(OH)VD2-d6、25(OH)VD3-d6 稀释液：小牛血清。产品储存条件及有效期：12个月附件：产品标准，产品说明书。/pp　　适用范围：供医疗机构用于对人血清样本中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度的体外定量检测，作辅助诊断用。/pp　　批准日期：2014.07.05/pp　　有效期至：2019.07.04/pp　　产品标准：YZB/沪6954-40-2014/pp　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　3. 1，5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒(液相色谱-串联质谱法)/strong/span/pp　　注册证编号：沪械注准20162400317/pp　　注册人名称：上海复星长征医学科学有限公司/pp　　型号、规格：100人份/盒/pp　　批准日期：2016.04.21/pp　　有效期至：2021.04.20/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂) ：对照品1、2、3：1，5-脱水葡萄糖醇 质控品：1，5-脱水葡萄糖醇 沉淀剂(含内标)：13C6-1,5-脱水葡萄糖醇 稀释液：乙腈 pH调节剂：氨水。/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：供医疗机构对人血清样本中1，5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)浓度的体外定量检测，作辅助诊断用。/pp　　产品储存条件及有效期(体外诊断试剂) ：2～8℃避光，12个月/pp　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　4.琥珀酰丙酮和非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒(串联质谱法)/strong/span/pp　　注册证编号：国械注准20163401324/pp　　注册人名称：广州市丰华生物工程有限公司/pp　　型号、规格：NZP008：480人份/盒、NZP108：960人份/盒。/pp　　备注：申请人在产品上市后继续收集产品临床使用数据，并于延续注册时提交至少五家省级医疗卫生机构不少于五万例新生儿干血斑样本的临床筛查实验数据。筛查试验可不设对照组，但其余项目应严格按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求进行，并在最终的临床资料中由出具临床数据的机构写明每一病例的筛查结果与最终诊断结果的关系或将筛查结果与诊断结果不符的病例情况写明。/pp　　批准日期：2016.07.29/pp　　有效期至：2021.07.28/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂) ：氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、质控品、非衍生法萃取液、非衍生法流动相、琥珀酰丙酮样本处理液、U型底微孔板、V型底微孔板、铝箔制微孔板封片、粘性微孔板封片。(具体内容详见说明书)/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：该产品用于检测新生儿滤纸干血片样本中的琥珀酰丙酮和多种氨基酸、肉碱的浓度。/pp　　产品储存条件及有效期(体外诊断试剂) ：2～8℃下保存，避光、避热、密封储存，有效期为12个月。/pp　span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　5.衍生化多种氨基酸和肉碱测定试剂盒(串联质谱法)/strong/span/pp　　注册证编号：国械注准20163401325/pp　　注册人名称：广州市丰华生物工程有限公司/pp　　型号、规格：ZP009：480人份/盒、ZP109：960人份/盒。/pp　　备注：申请人在产品上市后继续收集产品临床使用数据，并于延续注册时提交至少五家省级医疗卫生机构不少于五万例新生儿干血斑样本的临床筛查实验数据。筛查试验可不设对照组，但其余项目应严格按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求进行，并在最终的临床资料中由出具临床数据的机构写明每一病例的筛查结果与最终诊断结果的关系或将筛查结果与诊断结果不符的病例情况写明。/pp　　批准日期：2016.07.29/pp　　有效期至：2021.07.28/pp　　主要组成成分(体外诊断试剂) ：氨基酸同位素内标准品、肉碱同位素内标准品、质控品、衍生法萃取液、衍生化试剂、复溶液、衍生法流动相、U型底微孔板、V型底微孔板、铝箔制微孔板封片、粘性微孔板封片。(具体内容详见说明书)/pp　　预期用途(体外诊断试剂) ：该产品用于检测新生儿滤纸干血片样本中的多种氨基酸和肉碱的浓度。/pp　　产品储存条件及有效期(体外诊断试剂) ：2～8℃下保存，避光、避热、密封储存，有效期为12个月。/p

5月15日，欧盟委员会发布(EU)No445/2013号条例，批准硒代蛋氨酸羟基类似物用作动物饲料添加剂。硒代蛋氨酸羟基类似物添加于饲料时，分属的添加剂类型为“营养添加剂”，功能组为“微量元素化合物”，需保证硒元素在12%含水量的饲料成品中的含量不超过0.5mg/kg，有机硒不超过0.2mg/kg。　　硒代蛋氨酸羟基类似物用作饲料添加剂时，可作为蛋氨酸营养补充剂，促进动物生长发育。但该物对皮肤和眼睛有刺激作用，在使用该产品后，必须用水冲净皮肤。对此，检验检疫部门提醒相关企业：一是根据欧盟委员会发布的法规，严格按照相关要求来用作动物饲料添加剂。二是与相关部门合作，加大检测力度，确保出口产品符合欧盟标准。三是推进生产工序升级和优化，并建立自检自控体系，分析关键控制点并予以重点关注，确保其含量符合法规要求，避免退运或召回。

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）前面讨论了基于质谱的蛋白质测序技术的一般流程及基于质谱的肽段序列测定方法。在组成蛋白质的20种氨基酸中，亮氨酸和异亮氨酸互为同分异构体，具有相同的分子质量，无法通过二级质谱产生的同系列离子的质量差异被区分。然而亮氨酸/异亮氨酸对单克隆抗体药物的功能影响巨大，典型的单克隆抗体在互补决定区（CDR）中含有至少3个亮氨酸/异亮氨酸，在复杂的样品中可以存在多达9个。单克隆抗体中CDR的错误识别，会导致抗原结合亲和力与抗体的特异性大量丧失。因此，对单克隆抗体中的全部亮氨酸或异亮氨酸进行准确测定意义重大[1-2]。亮氨酸和异亮氨酸的侧链分别是异丁基和仲丁基，通过质谱的多级碎裂产生的特征离子可以对亮氨酸和异亮氨酸进行区分。一种方法是通过不同系列的碎片离子质量差来区分，其原理是肽段在ETD-HCD或EThcD碎裂模式下可产生z离子，含有异亮氨酸和亮氨酸肽段分别失去一个乙基自由基（C2H5）和一个丙基自由基（C3H7），产生质量分别减少29 Da和43 Da的w离子，因此通过质谱产生的z/w离子质量差，可区分肽段中的亮氨酸和异亮氨酸[2-5]。Zhokhov[3]对人血清白蛋白（HSA）、gp188蛋白两种蛋白质的43条胰蛋白酶酶解肽段中的93个亮氨酸和异亮氨酸进行鉴定，准确区分了其中的83个，但由于z/w离子分别产生在ETD和HCD谱图中，在鉴定过程中需要人工筛选含有z/w离子的谱图。Tatiana[4]等通过EThcD的碎裂模式对蛙皮肤分泌的14条肽段进行鉴定，使肽段的z/w离子出现在同一张谱图中，区分鉴定了这些肽段中的61/75个亮氨酸和异亮氨酸。由于不能保证每个含有亮氨酸或异亮氨酸的肽段在质谱中碎裂一定会产生相应的z/w离子，因此通过z/w离子质量差的方法无法对蛋白序列中全部的亮氨酸和异亮氨酸准确测定。另一种方法是通过亮氨酸和异亮氨酸的亚胺离子的三级碎片离子区分，其原理是亮氨酸或异亮氨酸质子化的离子（132 Da）容易损失甲酸而形成相应的亚胺离子（86 Da），它们的亚胺离子在三级碎裂中分别会产生m/z 69和m/z 43的特征离子。Nakamura[6]使用嗜热菌蛋白酶对人钙降素进行酶解，得到以亮氨酸或异亮氨酸为N端的肽段，通过该方法确定钙降素的第4和9个氨基酸为亮氨酸，第27个氨基酸为异亮氨酸，但此方法的缺点是当一条肽段中含有不止一个亮氨酸或异亮氨酸时，特征离子峰相会互干扰，无法对其判断。Bagal[5]将亚胺离子的三级碎片离子的方法和z/w离子质量差的方法结合，并将该策略用于两个单克隆抗体CDR中的亮氨酸和异亮氨酸的鉴定，由于使用胰蛋白酶酶解产生的肽段长度过长，对鉴定造成影响，仅对6条肽段中的亮氨酸和异亮氨酸的准确鉴定，无法区分CRD区全部亮氨酸和异亮氨酸。Sheila[7]使用4种蛋白酶对单克隆抗体进行酶解，对二级质谱产生的a1离子进行三级碎裂，排除了肽段内部亮氨酸或异亮氨酸的干扰，根据每个三级谱图中特征峰强度的比值对亮氨酸和异亮氨酸区分，由于谱图中噪音干扰以及肽段的共碎裂，会使一些含有特征离子的谱图不能用于准确区分亮氨酸和异亮氨酸，最终对单克隆抗体中的71.1%-94.1%亮氨酸和异亮氨酸进行区分。我们借鉴该方法，结合非特异酶连续酶解技术，以及基于碎片离子质量校正和多谱图共同打分策略，实现了对单克隆抗体药物赫赛汀轻链中7个异亮氨酸和18个亮氨酸，重链中9个异亮氨酸和33个亮氨酸的鉴定，准确度100%，轻链鉴定的覆盖度为100%，重链鉴定的覆盖度为97.67%。鉴定蛋白质中亮氨酸和异亮氨酸的流程图[1] Hurtado P P, O' Connor P B. Differentiation of isomeric amino acid residues in proteins and peptides using mass spectrometry [J]. Mass Spectrom Rev, 2012, 31(6): 609-25.[2] Xiao Y, Vecchi M M, Wen D. Distinguishing between Leucine and Isoleucine by Integrated LC-MS Analysis Using an Orbitrap Fusion Mass Spectrometer [J]. Anal Chem, 2016, 88(21): 10757-66.[3] Zhokhov S S, Kovalyov S V, Samgina T Y, et al. An EThcD-Based Method for Discrimination of Leucine and Isoleucine Residues in Tryptic Peptides [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2017, 28(8): 1600-11.[4] Samgina T Y, Kovalev S V, Tolpina M D, et al. EThcD Discrimination of Isomeric Leucine/Isoleucine Residues in Sequencing of the Intact Skin Frog Peptides with Intramolecular Disulfide Bond [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2018, 29(5): 842-52.[5] Bagal D, Kast E, Cao P. Rapid Distinction of Leucine and Isoleucine in Monoclonal Antibodies Using Nanoflow LCMS(n) [J]. Anal Chem, 2017, 89(1): 720-7.[6] Nakamura T, Nagaki H, Ohki Y, et al. Differentiation of leucine and isoleucine residues in peptides by consecutive reaction mass spectrometry [J]. 1990, 62(3): 311-3.[7] Maibom-Thomsen S, Heissel S, Mortz E, et al. Discrimination of Isoleucine and Leucine by Dimethylation-Assisted MS3 [J]. Anal Chem, 2018, 90(15): 9055-9.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn）。