大黄素葡萄糖苷对照

在活体成像技术中，一些新的光学探针及光调控技术的出现，拓展了该技术的应用领域。上期给大家分享了检测活性氧的探针，能够在活体水平监测局部炎症中活性氧自由基(ROS)的释放，以及基于肿瘤微环境中高ROS水平介导的自发光动力效应，实现肿瘤诊疗一体化。今天给大家分享一篇2019年发表在《Nature Methods》杂志上的文章。作者设计了一种生物发光的探针BiGluc，利用该探针即可在体内、体外实时、无创的长期监测葡萄糖的摄取。葡萄糖是大多数生物体能量的主要来源，其异常摄取与许多病理条件有关，如肿瘤、糖尿病、神經退行性疾病、非酒精性脂肪性肝炎等。到目前为止，基于18FDG的正电子发射断层成像（PET）仍然是测量葡萄糖摄取的金标准。还没有光学成像技术能够很好的检测该指标。文章中作者设计了一种可以可视化和定量葡萄糖吸收的光学探针。该探针是基于结合笼状萤光素技术与生物正交‘点击’反应，即可激活的笼状萤光素三芳基膦酯（CLP）与全氟苯基叠氮基修饰的葡萄糖（GAz4）分子之间产生的生物正交点击反应，该反应导致游离萤光素的释放，此时在萤光素酶的存在下，即可产生可量化的生物发光信号，其信号强度与葡萄糖的代谢水平相关。在活体成像中，首先是表达萤光素酶的动物注射CLP, 24小时后注射GAz4，注射后即可使用IVIS 小动物活体成像系统进行成像，如下图所示。图1. BiGluc.探针的设计策略点击查看视频：https://v.qq.com/x/page/y0897ftpwnc.html为了研究BiGluc探针在活体水平的应用，文中使用基因工程鼠FVB-luc+/+【该小鼠通过β-actin启动子广泛的表达萤光素酶】来进行评价。在三组FVB-luc+/+小鼠中，首先尾静脉注射CLP溶液，24h后分别灌胃GAz4（BiGluc组)、GAz4+d-葡萄糖(BiGluc+d-葡萄糖组)或PBS(背景组)。结果显示，d-葡萄糖（1:300 ratio with the GAz4 probe）的竞争能够对BiGluc信号进行抑制，使得信号值下降至背景值。从而成功证明BiGluc探针与天然底物存在竞争（下图a-c）。为了进一步研究BiGluc和d-葡萄糖的在体内的选择性，作者进行了胰岛素耐受性试验。高水平的胰岛素会导致GLUT4易位到细胞膜，随后组织对d-葡萄糖摄取的增加。因此实验中FVB-luc+/+小鼠静脉注射CLP，24h后注射GAz4 结合 PBS溶液(对照组)或者胰岛素，随后进行生物发光成像，结果显示胰岛素处理组小鼠的信号增加了三倍（下图d）。图2. 转基因小鼠(FVB-luc+/+)中d-葡萄糖摄取的成像和定量这些实验结果表明，BiGluc探针可以可靠地用于可视化研究活体水平d-葡萄糖的摄取，并且可以进行定量，从而也提示该探针可用于糖尿病等代谢疾病的研究。同样，该探针可用于肿瘤葡糖糖摄取的研究。葡萄糖转运蛋白，特别是GLUT1，在多种类型肿瘤发展中起着至关重要的作用。实验中使用裸鼠接种4T1-luc或4 T1-luc-GLUT1?/?细胞，肿瘤生长至体积65mm3，所有的动物注射等量的萤光素，以确保肿瘤的大小和萤光素酶的表达量相同。如前所示，进行BiGluc探针成像实验。实验结果表明，与对照组相比，4T1-luc-GLUT1?/?发光强度降低38%。同样文中还研究了BiGluc信号是否可以通过化学抑制GLUT1转运体来调节。众所周知，WZB-117是一种小分子的GLUT1可逆抑制剂，能够在不同的癌症中有效地阻止葡萄糖的摄取。结果显示WZB-117处理组，葡萄糖摄取信号减少50%（下图c,d）。同样文中比较了BiGluc 探针和18F-FDG-PET在肿瘤移植体中的应用效果。结果显示 4T1-luc-GLUT1?/-细胞对葡萄糖的摄取量降低，与BiGluc探针成像结果一致（下图e,f）。图3. 使用BiGluc和18F-FDG探针对肿瘤异种移植模型中d-葡萄糖的摄取进行成像和定量这些结果都证明了BiGluc探针在研究机体葡萄糖摄取中强大的功能。相信这项技术可以广泛应用于药物研发以及监测与葡萄糖摄取异常相关疾病的发生和进展，如癌症、糖尿病和肥胖等。此外，BiGluc技术扩大了生物发光成像技术可检测的生物分子的范围。在未来，利用新的红移萤光素-萤光素酶组合技术可以进一步提高BiGluc探针灵敏度，将进一步扩大其应用范围。文章来源https://www.nature.com/articles/s41592-019-0421-z关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

什么是钠、钾元素？钠是细胞外液中带正电的主要离子，参与水的代谢，保证体内水的平衡，调节体内水分与渗透压；维持体内酸和碱的平衡；钠对ATP的生产和利用，肌肉运动，心血管功能，能量代谢都有关系，此外糖代谢，氧的利用也需要钠的参与；同时钠可以维持血压正常，增强神经肌肉兴奋性。与钠相对，人体中的钾主要（95%以上）在细胞内部，是细胞液中主要的正离子。钾参与糖类、蛋白质的正常代谢。葡萄糖和氨基酸经过葡萄细胞膜进入细胞合成糖原和蛋白质是必须有适量的钾离子参与；维持细胞内正常渗透压，由于钾主要存在于细胞内，因此钾在细胞内渗透压的维持中起着主要作用；维持细胞内外正常的酸碱平衡，钾代谢紊乱时，可影响细胞内外酸碱平衡。钾和钠一起作用，维持体内水分的平衡和心律的正常(钾在细胞内起作用，钠在细胞外起作用)；钾和钠平衡失调时会损害神经和肌肉的机能。 实验 本实验根据中国药典2020年版四部通则0406来进行，采用日立ZA3000原子吸收分光光度计进行测试。实验过程：1.复方乳酸钠葡萄糖注射液中钠元素测定配置0μg/ml，2μg/ml，2.5μg/ml，3μg/ml，3.5μg/ml，4μg/ml浓度的标准溶液，同时提取注射液样品中的钠元素，标准溶液及样品液制备完成后，上机进行测试。喷入空气-乙炔火焰，在高温火焰中形成的钠基态原子对钠特征谱线进行吸收，在一定吸光值范围内，其吸光度值和钠的浓度成正比。测试结果： 2.葡萄糖氯化钠钾注射液中钠元素测定配置0μg/ml，0.9μg/ml，1.35μg/ml，1.8μg/ml，2.25μg/ml，2.7μg/ml浓度的标准溶液，同时提取注射液样品中的钠元素，标准溶液及样品液制备完成后，上机进行测试。喷入空气-乙炔火焰，在高温火焰中形成的钠基态原子对钠特征谱线进行吸收，在一定吸光值范围内，其吸光度值和钠的浓度成正比。测试结果： 3.复方葡萄糖电解质MG3注射液中钾元素测定配置 0μg/ml，1.5μg/ml，2.25μg/ml，3μg/ml，3.75μg/ml，4.5μg/ml浓度的标准溶液，同时提取注射液样品中的钾元素，标准溶液及样品液制备完成后，上机进行测试。 喷入空气-乙炔火焰，在高温火焰中形成的钾基态原子对钾特征谱线进行吸收，在一定吸光值范围内，其吸光度值和钾的浓度成正比。 测试结果：结论本次实验对注射液中提取的钠、钾元素进行测试。结果表明，日立ZA3000可以对特征波长589nm的钠元素和766.5nm的钾元素进行准确稳定的分析，测试结果不受注射液中其它共存物质的背景影响，方法稳定可靠。公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

何首乌(PM)作为传统中药具有广泛的药理活性且临床应用广泛，其肝毒性一直备受关注，但由于其多成分、多靶点的特性，其毒性物质和机制尚未阐明。前期研究发现PM 70%乙醇提取物中，D组分(95%EtOH洗脱，PM-D的肝毒性最高，然而PM-D的肝毒性机制尚不清楚。　　2022年8月，北京协和医学院药物研究所靳洪涛、贺玖明团队在Journal of Ethnopharmacology发表了题为“Integrated spatially resolved metabolomics and network toxicology to investigate the hepatotoxicity mechanisms of component D of Polygonum multiflorum Thunb”，提出系统整体的中药毒理研究策略，整合网络毒理学和空间质谱成像技术探究何首乌D组分肝毒性的潜在靶点及代谢机制，为何首乌肝毒性机制发现及中草药的相关组分药理毒理机制研究提供了新的方法和技术支持。　　研究背景　　前期基于斑马鱼胚胎模型对何首乌不同组分及单体成分进行肝毒性评估，发现何首乌D组分的急性毒性和肝毒性明显高于其他提取物，并分离鉴定了PM-D中27个化学成分，主要包含蒽醌类、多酚类、蒽酮类、二蒽酮类等，进一步以斑马鱼胚胎模型的表型终点(肝脏大小、肝脏灰度值和卵黄囊面积)评价何首乌D组分中主要化学成分的毒性，发现蒽醌和二蒽酮类与其他成分相比具有显著的肝毒性。前期的毒性筛选确定潜在毒性物质基础有助于进一步阐明其肝毒性分子机制。　　本研究首次整合了网络毒理学和质谱成像技术应用于中药毒理机制研究，网络毒理学基于系统和整体的角度衡量复杂的“成分-靶点-疾病”网络关系为中药毒性机制探索提供了新的思路。基于质谱成像技术衍生的空间分辨代谢组学技术可在保留空间位置信息的基础上揭示生物组织中代谢物的时空分布特征，有助于理解代谢活动时空变化与组织病理和生理功能之间的关联和作用机制。以何首乌D组分的肝毒性机制研究为例，两种方法的整合应用为中药药理毒理机制研究提供新的研究策略。　　技术流程　　　　研究结果　　1、病理及生化指标　　急性毒性实验中，14 d内所有剂量均未观察到小鼠死亡或异常毒性症状且大体解剖未见明显病理改变。2g/kg剂量反复给药7天后，组织病理学检查发现给药组肝细胞肿胀，肝窦轻度扩张，少量微肉芽肿，肝细胞轻度变性/坏死等改变，血清生化分析显示，血清AST活性和TBIL含量显著升高，ALT和ALP活性水平呈上升趋势(图1)。　　图1 | PM-D给药后小鼠病理及生化指标变化　　2、毒性物质的定量检测　　PM-D中蒽醌类化合物大黄素和大黄素-8-β-D-葡萄糖苷的含量分别为3,989.820 μg/g和12,677.423 μg/g (图2)。反式-大黄素-大黄素二蒽酮和顺式-大黄素-大黄素二蒽酮含量分别为1,847.708 μg/g和1,455.940 μg/g(图3)。　　　　图2 | HPLC谱图　　标准溶液(A)和样品溶液(B), 大黄素-8-β-D-葡萄糖苷(1)和大黄素(2)　　　　图3 | MS谱图　　标准溶液(A)和样品溶液(B), 反式-大黄素-大黄素二蒽酮(1)和顺式-大黄素-大黄素二蒽酮(2)。　　3、网络毒理学分析　　3.1PM-D肝毒性靶点和网络构建　　经药物靶点预测和疾病靶点收集共获得了30个目标靶点网络构建结果显示mTOR、PIK3CA、AKT1、EGFR、ERBB2、ESR1、RPS6KB1、CTNNB1是核心的相关靶点(图4)。　　　　图4 | 网络构建及靶点分析　　(A)共同靶标集合　　(B)药物-靶点-疾病网络　　(C)PPI网络。　　3.2 GO和KEGG富集结果分析　　GO富集结果主要集中在生物过程中，涉及细胞内信号转导的正调控、TOR信号、对外来生物刺激的响应、细胞对内源性刺激的反应、激酶活性的正向调节、MAPK级联调控、凋亡过程的调控、活性氧代谢过程的调控等(图5A)。KEGG的富集信号通路主要包括PI3K-Akt信号通路、ERBB信号通路、AMPK信号通路、mTOR信号通路、肝细胞癌、HIF-1信号通路、Ras信号通路及MAPK信号通路等(图5B)。　　图5 | GO富集分析(A)和KEGG富集分析(B)　　3.3分子对接　　分子对接结果显示大部分核心毒性成分都能与靶点紧密结合，二蒽酮类化合物顺式-大黄素-大黄素二蒽酮(Cis-emodin-emodin dianthrones)，反式-大黄素-大黄素二蒽酮(Trans-emodin-emodin dianthrones)，Polygonumnolide C4相较于其他成分结合能更低。　图6 | PM-D中成分与核心靶点的分子对接分析　　(A)结合能热图分析 (B-D)结合构象可视化：　　(B)反式-大黄素-大黄素二蒽酮- mTOR 　　(C)反式-大黄素-大黄素二蒽酮- EGFR 　　(D)Polygonumnolide C4- mTOR。　　4.质谱成像分析　　4.1高分辨、高覆盖、高灵敏的代谢物成像　　质谱成像在单个像素点提取的代谢物峰可达数万种，覆盖了丰富的代谢物。作者发现两种含量较高的药物成分大黄素和大黄酸相关代谢产物仅在药物组的肝脏中高度富集。内源性代谢物精氨酸和牛磺胆酸等分布具有区域特异性(图7)。　　图7 |AFADESI-MSI可视化PM-D给药后代谢物变化 (A)负离子模式下平均质谱　　(B-E)内外源性化合物的空间可视化：大黄素(B), 大黄酚(C)，精氨酸(D)，牛磺胆酸及牛磺去氧胆酸(E)。　　4.2代谢轮廓分析及差异代谢物鉴定　　差异代谢物经过MS/MS鉴定，并采用MassImager软件可视化其空间分布特征，代表性差异代谢物的质谱图像如图8所示, 可观察到精氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、牛磺酸类和肉碱类代谢物显著上调，部分脂质类代谢物显著下调。　　图8 | 代表性差异代谢物质谱成像图　　4.3通路富集分析　　基于通路富集的结果，构建了包括已鉴定的关键生物标志物在内的代谢网络，揭示了胆汁酸合成、嘌呤代谢、脂肪酸氧化、三羧酸(TCA)循环和脂质代谢等参与了PM-D致肝毒性过程的代谢变化(图9)。图9 | 代谢网络分析　　研究讨论　　本研究首次应用质谱成像技术可视化PM-D中关键代谢物在肝脏中的分布并首次对PM中毒性成分二蒽酮类化合物进行定量检测及网络药理学分析预测潜在毒性靶标为何首乌毒性物质基础研究及潜在肝毒性靶点发现奠定了新的基础。　　空间分辨代谢组学进一步挖掘出何首乌D组分的肝毒性生物标志物，包括氨基酸、酰基肉碱、胆汁酸、脂类等。基因富集和代谢网络综合分析表明，何首乌D组分的毒性机制可能涉及氧化应激、线粒体损伤和AMPK通路等导致的胆汁酸代谢、能量循环、嘌呤代谢和脂质代谢的紊乱相关，该研究有望为临床诊断和监测何首乌肝毒性的发生发展提供参考，并作为代谢适应和重编程的资源，以指导未来临床预后研究，为探索中药毒性机制提供新思路。