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在自然界存在一种叫做土壤杆菌的细菌,它能感染植物的受伤组织,特别是根茎交接处的受伤组织,引起冠瘿瘤。冠瘿病损害为数众多的双子叶植物,特别是葡萄、核果类树木和观赏植物。冠瘿细胞是植物肿瘤细胞,在许多方面与动物肿瘤细胞类似。它们只有无限生长的能力,把一小块冠瘿组织放入不含植物激素的培养基中培养,能长成大的细胞团块(愈伤组织),而正常植物细胞在不加植物激素的培养基中则不能生长。冠瘤拥胞能制造一类叫做冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物(如章鱼碱和蓝曙红),供根癌土壤杆菌作为养料使用,在正常植物细胞中从未发现过这类物质。 根癌土壤杆菌能把植物细胞转化为肿瘤细胞,是由于它含有一种肿瘤诱导质粒,简称Ti质粒。当细菌感染植物时,Ti质粒中大约占这个质粒l/10的DNA片段(称为转移DNA或T—DNA)进入植物细胞,并整合到植物的染色体上,随染色体一起复制。随后T—DNA携带的细菌基因(致瘤基因和合成冠瘿碱的基因)使在植物细胞中表达,使植物细胞转化成肿瘤细胞,并合成冠瘿碱。由于根癌土壤杆菌能把细菌基因引入植物细胞,并在那里表达出蛋白质来,所以人们称它为天然的“遗传工程师”。这给人们以启示。能否用重组DNA技术把与高产、优质、抗病、抗旱和抗盐碱等优良件状有关的基因循人到T—DNA中,然后再通过根癌土壤杆菌的感染把这些基因引入植物细胞呢?最近几年的研究进展表明,这是完全可能的。 Ti质粒是独立复制的环状DNA分子。由大约1.5—2xl05碱基对组成,相当于细菌染色体的3—5%。它有两个主要类型:一类叫章鱼碱质粒,含有这种质粒的细菌能以章鱼碱为氮源和碳源生长;另一类叫蓝署红质粒,含有这种质粒的细菌能利用蓝曙红。每一种根癌土壤杆菌只含有一种Ti质粒,或者是章鱼碱质粒,或者是蓝曙红质粒。这两种质拉的DNA同源性很低,一般为12—16%,说明它们可能具有不同的进化史。T—DNA是Ti质粒中最重要的组成部分.它所携带的基因主要有两个功能:一是决定肿瘤的形成和肿瘤的形态;二是控制冠瘿碱的合成。如果T—DNA中的致瘤基因发生突变,可能出现三种表型:一是产生比正常肿瘤个大的肿瘤;二是使肿瘤长出许多根;三是使肿瘤长出许多芽。在T—DNA区域以外也有一些基因已被定位,其中毒性基因的功能是决定根癌土壤杆菌对植物的感染以及T—DNA的进入和整合;章鱼碱代谢基因和蓝曙红代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶;质粒转移基因控制细菌的接合作用;不相容性基因控制Ti质粒与其它质粒的不相容性。 Ti质粒之所以能成为把外源基因引入植物的良好载体有两方面的原因。第一,携带质粒的根癌土壤杆菌的寄主范围很广,实际上它能转化所有的双子叶植物。第二,整合到植物染色休上的T—DNA能随种子遗传,而且T—DNA有自己的启动基因,可以启动与其连接的外源基因的转录。此外,也有人研究以植物病毒DNA为载体转移目的基因,或者直接把DNA注射到植物的花粉管和子房中。Ti质粒直接用作基因载体有两个困难:一是它的分子量太大,内切酶位点很多,不容易进行体外重组DNA操作;二是被T—DNA转化的植物细胞成为肿瘤细胞,不能再生成植株。克服第一个困难的办法是先把T—DNA克隆到大肠杆菌的小质粒上,把目的基因插入到小质粒的T—DNA中,然后再设法转移到天然的Ti质粒中。克服第二个困难的办法是在T—DNA的特殊位点中插入目的基因和供筛选用的抗药基因,一方面使致瘤基因发生插入突变,从而使转化细胞能再生成植株,另一方面使目的基因正好位于T—DNA的启动基因的下游,以便启动目的基因的转录。有人经过研究发现了这样一种作用模型:大多数双子叶植物受伤后会产生一种叫丁香酮(acetosyringone)的物质,这时土壤农杆菌感染后,丁香酮在Ti质粒上Vir A的产物A的协同作用下促进了Vir G产物G的活化(即磷酸化),然后产物G相继激活Vir B、V ir c、Vir D、Vir E等操纵子,特别是Vir D和Vir E。前者产生两种蛋白,D1为缺刻酶(nickase),它能特异性地在T—DNA两端产生缺刻;D2则是一种蛋白复合物,它粘在已断开的T—DNA的两端,具“导航”的功能,有人认为它是Rec A,起重组的作用。后者产生单链结分蛋白(SSB),有保护缺刻产生后的T—DNA的功能。T—DNA在诸多蛋白的导航、保护下重组进核基因组。这种转比方法优点是方便,不需分离原生质,且插入的基因拷贝数目少,比较稳定。但它的缺点是土壤农杆菌主要只适于侵染双子叶植物,单子叶植物能被侵染的较少,这就在一定程度上影响了这种方法的推广。有人发现单子叶植物受伤后很少产生丁香酮,这是否是侵染的关键呢?目的许多实验室都在作这方面的探索,以期望能克服这种方法的局限性。http://hiphotos.baidu.com/wfvcshengwu/abpic/item/629fdb39539824d63b87ce6e.jpg
培养基及成分 1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围:恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]:When cultivation of Bacillus,5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围:产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(青虫菌)、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃ for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the liquid , then autoclave at 121℃ for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基 I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围:植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ (乳酸菌培养基 Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围:植物乳杆菌(胚芽乳杆菌) 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY (蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基) Peptone(蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 1g Distilled water (蒸馏水) 1L 8. Glycerol Agar (甘油琼脂) Peptone (蛋白胨) 5g Beef extract (酵母膏) 3g Glycerol (甘油) 20g Top water (自来水) 1000ml Agar (琼脂) 15g pH 7.0-7.2 9. Rhizobium medium (根瘤菌培养基)AS 9 Yeast eztract (酵母膏) 1g Soil eztract (土壤浸提液) 200ml Mannitol (甘露醇) 10g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 800ml pH 7.2 [Note]:Soil extract:Suspend 50g finely and dried gardon soil in 200ml of tap water. Autoclave at 121℃ for 1 hr. Decant through cotton-cloth, filler though paper, make up volume to 200ml. Resterilize for 20 minutes at 121℃ , then mixed with othringredients and distributed. (土壤浸提液的制法:取土壤50克,加水200毫升,15磅蒸煮1小时,经滤纸过滤后加水补足到200毫升。) 适用范围:大豆根瘤菌(慢生型)、豇豆慢生根瘤菌、花生根瘤菌、紫云英根瘤菌、 大豆根瘤菌(快生型)、大豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌、田菁根瘤菌 10. Mannitol Agar (甘露醇琼脂) Yeast extract (酵母膏) 5g Peptone (蛋白胨) 3g Mannitol (甘露醇) 25g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml
[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2007/08/200708071106_59953_1631012_3.jpg[/img] 现在回过头来看,在2004年安徽阜阳“大头婴儿”事件中,有一个可能的致病因素在当时被忽略了:在这些劣质奶粉中后来分离出了阪崎肠杆菌 金立旺/图 张田勘 被忽略的“杀手” 2007年7月下旬,国家质量监督检验检疫总局公布了今年4月入境的不合格食品、化妆品信息,其中全球最大的乳品原料供应商新西兰恒天然多个批次的全脂奶粉被检验出含有致病菌阪崎肠杆菌。这些有问题的全脂奶粉,总数达277.9吨,分别是今年1月和3月进口的。恒天然公司表示,尊重中国政府的相关考虑和规定,已对被检验出阪崎肠杆菌的产品按规定做了处理。 阪崎肠杆菌是寄生于人和动物肠道的“条件性肠道致病菌”。也许,阪崎肠杆菌目前只引起了专业人员的高度重视,并未吸引普通公众的目光,原因在于它不仅对公众是陌生的,且现在造成的危害似乎并不算重。回顾近年来国内的食品安全问题,阪崎肠杆菌也确实被忽略了。 2004年安徽阜阳出现著名的“大头婴儿”事件。据该市县级以上医疗机构核查统计,从2003年5月以来,因食用劣质奶粉出现营养不良综合征共171例,死亡13例,病死率7.6%。婴儿发病和死亡的主因是由于劣质奶粉导致的营养不良,但是现在回过头来看,有一个可能的致病因素在当时被忽略了——这些劣质奶粉中含有阪崎肠杆菌。 阜阳劣质奶粉事件发生后,中国疾控中心营养与食品安全研究所的刘秀梅等人运用来自美国和加拿大的方法,建立了婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离鉴定技术。从87份阜阳劣质奶粉样品中,他们检测到11份阪崎肠杆菌阳性样品,污染阳性率为12.6%。 这是国内首次从婴儿配方奶粉中分离到阪崎肠杆菌菌株。 固然,劣质奶粉导致婴幼儿死亡是因其中蛋白质含量极低,不能满足婴儿的生长需要。比如,按照3-6个月婴儿的生长需要,蛋白质每日摄取量为3g / kg,而劣质奶粉每日只能提供0.07g / kg的蛋白质。所以,长期食用这种几乎没有营养的伪劣奶粉的婴儿,会产生四肢短小,身体瘦弱,头部尤显偏大的症状。 阪崎肠杆菌的污染是否会对当地婴幼儿造成雪上加霜的伤害呢?事过境迁,要得出确切的结论已经很难。不过事后查出阜阳劣质奶粉含有阪崎肠杆菌,对今天的食品安全不啻是敲响了一次警钟。 对婴幼儿最具杀伤力 早在2004年,广州检验检疫局就率先提出,在进口婴幼儿配方奶粉和奶制品中,对阪崎肠杆菌进行监测,并首次从进口奶粉中检查出阪崎肠杆菌。2007年以来,广州、中山、汕头检验检疫部门在进口奶粉中已多次检出阪崎肠杆菌。因此国内的专业人员多次呼吁,要重视阪崎肠杆菌对食品污染和对人健康的危害。 那么,阪崎肠杆菌污食品对人类有哪些危害呢? 阪崎肠杆菌并不是近年才发现的新致病菌。1961年,英国研究人员弗兰克林(Franklin)等人首次报道了2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例。随后美国、希腊、荷兰、加拿大、比利时等国家相继发现了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症,并可能引起神经功能紊乱,造成严重的后遗症和死亡,其死亡率高达50%以上。成人也可能罹患此病,但病情显著轻微。 阪崎肠杆菌主要对新出生婴儿,尤其是对发育不良、免疫功能差的婴幼儿最具杀伤力。来自美国FDA的监测表明,在美国出生体重偏低的新生儿中,感染率为8.7 / 10万;而1岁以下婴儿阪崎肠杆菌感染率为1 / 10万,感染死亡率为 20%至50%。全球从1961年至2003年有案可稽的48起婴儿感染事件中,有25起是新生儿感染。 配方奶粉受阪崎肠杆菌污染,很可能发生在干燥和罐装阶段。因为,与大肠埃希菌、沙门菌相比?熏阪崎肠杆菌对渗透压和干燥具有更高的耐受力。这很可能与这种细菌细胞内有大量的海藻糖酶有关。 阪崎肠杆菌特别喜欢夏天,因为高温让它如鱼得水。在25℃放置6小时,该菌的相对危险性可增加30倍;25℃放置10小时,危险可增加30000倍。因此,即使婴儿配方粉中只有极微量的阪崎肠杆菌污染,在配方粉食用前的冲调期和储藏期该菌也可能会大量繁殖。 尽管在环境中有许多地方是阪崎肠杆菌的栖身之处,但迄今能证实的对人患病有直接因果关系的只有婴儿配方奶粉。尤其值得注意的是,即使受到低浓度的污染,阪崎肠杆菌也可在奶粉的冲调、放置过程中大量繁殖而成为感染的危险因素。 刘秀梅等人认为有3种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染。1.通过生产婴儿配方奶粉的原料;2.在巴斯德杀菌后配方奶粉污染或其他添加剂随粉带入;3.喂养婴儿前被污染。 食品安全的新目标 2004年3月29日至4月3日,在美国华盛顿召开的国际食品卫生法典委员会(CCFH)第36次会议上,阪崎肠杆菌受到了食品安全专家的高度重视。与会专家认为,阪崎肠杆菌是食品安全控制的新目标。 当然,卫生专业人员特别关注的并非仅仅是阪崎肠杆菌,而是通过污染食品致人患病的多种微生物。早在1999年的第32次CCFH大会上,与会者就将食品中病原菌的危险性评估列为CCFH讨论的重要内容,并提出了“食品一病原微生物”的特定评估组合。例如,鸡蛋中的肠炎沙门氏菌;禽肉、生牛羊肉、鱼中的沙门氏菌;禽肉中的空肠弯曲杆菌;牛肉、蔬菜中的出血性大肠杆菌;软奶酪、即食食品、熏鱼、沙拉用冷冻蔬菜中的李斯特菌;贝类中的副溶血弧菌;蔬菜中的志贺氏菌;新鲜食品中的隐孢子菌。还有其他食物中的金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和各种病毒等。 对于这些致病微生物,2004年的CCFH特别提出了应对原则。微生物的安全控制不应停留在终端产品的检测上,应该控制食品的生产、加工、贮存、制备、销售等全过程,强调运用良好生产操作规范(GMP)及危害分析和关键控制点(HACCP)等科学管理体系来管理食品,以保证出厂产品的安全性。 鉴于阪崎肠杆菌的特殊性,联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开了有关婴幼儿配方奶粉中病原微生物的专家咨询会。委员会认为,奶粉中的阪崎肠杆菌和沙门氏菌等是导致婴幼儿感染、疾病和死亡的主要原因。阪崎肠杆菌可以对任何年龄段的人群引起疾病,但主要是婴幼儿,特别是1岁以下和出生28天以内的婴儿,早产儿、低体重儿或免疫缺陷的婴幼儿更容易被感染。HIV阳性母亲的婴幼儿更面临双重危险性。因为他们主要依靠奶粉喂养,比其他婴幼儿更容易感染。 一些防范原则 国际上对阪崎肠杆菌防范的基本原则包括,坚决执行食品召回的政策。2001年4月美国田纳西州发生阪崎肠杆菌感染事件后,国际上第一次采取了对商业婴儿配方粉召回的行动。这一原则应在各个国家普遍执行。 其次,专家提议,婴儿出生的前6个月,母乳喂养最有助于婴儿的生长和健康。但是为了保证婴儿发育需要的营养,必须科学地补充喂养适宜的母乳代用品,如符合食品法典委员会(CAC)标准的婴儿配方食品。应对不能进行母乳喂养的婴幼儿,特别是高危人群提出警示:配方乳粉并不是灭菌产品,可能被病原体污染并引起疾病。 第三,采取多项措施降低阪崎肠杆菌和其他致病微生物的危险性。国际法典委员会在修订操作规范时,制定婴儿配方奶粉中适宜的阪崎肠杆菌微生物标准;生产者应制定加工、使用和操作婴儿配方食品的导则,将危险性降到最低;在生产环境和配方奶粉中降低阪崎肠杆菌的浓度和流行的危险性。 第四,消费者应该用商业无菌液体或开水冲调配方食品,喂食婴儿剩余的液体调配食品应放置冰箱保存,并在食用前再加热。 中国在2005年5月通过了《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准的审定,对奶粉严查此菌。因此,消费者在正规商场购买经过检测的卫生食品是不会有阪崎肠杆菌的。不过,产品买回家后要注意防止二次污染,保持密封以及器具本身的清洁。