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细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术。广泛应用于现代医学、农业科学、生物科学、材料科学和环境科学等领域,培养的细胞为上述领域提供研究的模型和实验材料。目前细胞间可以供从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验及如HEK293T细胞系,Hela细胞系,CHO细胞系等常用细胞系的培养、传代及其他分子实验的操作条件。
1、搅拌式动物细胞培养罐 搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性,因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护,因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害,传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以,动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的,包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。 (1)供氧方式的改进 一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡,为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感,所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种,即气泡用丝网隔开,不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力,以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐,整体呈梨形,搅拌置于培养罐底部,在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡,丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。 (2)搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大,这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进,并在反应器内加装了辅件,实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨,顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°,垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力,实验中用于昆虫细胞的培养,最终的培养密度达到6×106个/mL,成活率在98%以上。 2、非搅拌式动物细胞培养罐 搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大,容易损伤细胞,虽然经过各种改进,这个问题仍很难避免。相比之下,非搅拌式培养罐产生的剪切力较小,在动物细胞培养中表现出了较强的优势。 (1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物,供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供,并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带,因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小,适合细胞高密度生长。 (2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成,每根中空纤维管的内径约为200μm,壁厚为50~70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散,动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长,可以很方便地获取氧分。 (3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一,其特点是结构简单,操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术,研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞,在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面,终密度可达1.13×106个/mL。
从大小来讲,细胞培养瓶约可分为约600ml,250ml,50ml和25ml的,一般都经过表面改性处理,适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用(如单克隆细胞的培养等),50ml的多用于一般性细胞实验用(一般性的传代,保存细胞,为实验提供细胞等),25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养,还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等,都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同,也有玻璃和塑料之分,这里谈一点自己的浅见(欢迎不同意见的战友拍砖)。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样,所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色,导致细胞状态不断下滑,直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然,有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力,或者提高胰酶的浓度来实现,在培养一些细胞过程中,我发现,一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同,如RAW264.7,平滑肌细胞等,在转换培养瓶之后,可以发现好消化了很多,并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验,想说的就是要尽量避免购买国产的培养板,国产的一些培养瓶还可以,但是培养板我们买过很多国产的,确实效果不是很好,细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下,这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买,BD,Corning等等。这些东西原则上是一次性的,但是我们大部分实验室根本不可能做到,其实泡酸,洗干净再用也没问题,毕竟我们没有老外那么富足的经费,所以我们就累点吧,多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的,国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管,原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染,而且用完棉花也方便取出,便于下次再用。