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如何用普通生物显微镜拍清楚非小细胞肺癌细胞的细胞膜呢
[font='times new roman'][color=#000007]MSI1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000007] [/color][/font][color=#000007]在人小细胞肺癌细胞系中的表达及[/color][color=#000007] [/color][font='times new roman'][color=#000007]MSI1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000007] [/color][/font][color=#000007]低表达[/color][color=#000000]细胞模型的构建[/color]MSI1 在人小细胞肺癌细胞系中高表达提取人正常肺上皮细胞 BEAS-2B,SCLC-A 型 H69、H209、DMS153 细胞,SCLC-N 型 H446、H82、H2066 细胞,SCLC-P 型 H526、H211 细胞,SCLC-Y 型 H841、DMS114、SW1271 细胞的 RNA,利用 q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 检测 MSI1 在正常肺上皮及小细胞肺癌细胞系中的表达情况,结果如图 2-1 显示,MSI1 在小细胞肺癌细胞系中的表达远远高于正常肺上皮细胞,综合分析,选取了 H69、H82、H526 及 SW1271 细胞用于后续实验。 [img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326443512_4838_5389809_3.png[/img]图 小细胞肺癌细胞系中 MSI1 mRNA 的表达(***P0.001)MSI1 低表达细胞模型的构建本实验选取人小细胞肺癌细胞系 H69、H82、H526、SW1271 细胞,使用慢病毒感染技术敲低 MSI1 的表达,同时设置对照组除外病毒本身对细胞产生的影响,待细胞状态良好使用嘌呤霉素筛选, 然后在荧光显微镜下观察如图 , 可见 H69-NC 、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2细胞均产生绿色荧光,表明人小细胞肺癌细胞慢病毒感染成功。 [img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326451025_2121_5389809_3.png[/img]图 慢病毒感染后 4X 荧光显微镜下图片(H69、H82、H526、SW1271 明场及荧光照片) 敲低 MSI1 后转录和蛋白水平验证分别提取对数生长期的 H69-NC 、H69-shMSI1-1 、H69-shMSI1-2 、H82-NC 、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞的 RNA 和蛋白,利用 q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 技术分别检测各细胞 MSI1 mRNA 相对表达量,结果如图 所示,与对照组相比,H69-shMSI1-1、 H69-shMSI1-2 、 H82-shMSI1-1 、 H82-shMSI1-2 、 H526-shMSI1-1 、 H526-shMSI1-2 、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 组 MSI1 mRNA 表达量明显降低(P0.01), 抑制率约为 75%。利用 Western blot 技术检测各细胞内 MSI1 蛋白的表达情况。结果如图 2-3 所示,与对照组相比,MSI1 蛋白表达在 H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞中明显降低。表明 MSI1 低表达细胞模型构建成功。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326454704_2148_5389809_3.png[/img]图 敲低 MSI1 在转录水平和蛋白水平的验证(***P0.001)
[align=center][size=18px]敲低[/size][size=18px] MSI1 对小细胞肺癌细胞生长增殖的影响[/size][/align][size=16px]检测 MSI1 对人小细胞肺癌细胞生长增殖的影响[/size][size=16px]收集[/size][size=16px] H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组[/size][size=16px]细胞细胞[/size][size=16px]离心,并用完全培养基调整细胞浓度,H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、[/size][size=16px] [/size][size=16px]H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 以每孔 1×104 [/size][size=16px]个[/size][size=16px]细胞平铺于 96 孔板中,SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2,以每孔 1.3×[/size][size=16px]104 [/size][size=16px]个[/size][size=16px]细胞平铺于 96 孔板中,37℃ 恒温培养箱中培养。铺板后,分别于 24 h、48 h、72 h、96 h、120h 在每孔加入 10 [/size][size=16px]μL[/size][size=16px] CCK-8 溶液,37℃ 恒温培养箱中孵育 4h。并用酶标仪测定波长 450 nm 处 OD 值,利用 [/size][size=16px]Graphpad[/size][size=16px] prism5 计算增殖情况。[/size][size=16px]检测 MSI1 对人小细胞肺癌细胞药物敏感性的影响[/size][size=16px]收集[/size][size=16px] H69 、H82 、H526 、SW1271 的对照组和实验组细胞, 其中 H69-NC 、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、[/size][size=16px]H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 细胞系以 1×104 [/size][size=16px]个[/size][size=16px]细胞/孔的细胞密度接种于 96 孔板中,SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 以 1.3×104 [/size][size=16px]个[/size][size=16px]细胞/孔的细[/size][size=16px]胞[/size][size=16px]密度接种于[/size][size=16px] 96 孔板中。待细胞融合率约 80%,加入不同浓度顺[/size][size=16px]铂[/size][size=16px]。每组均设置对照组及空白组(仅有同体积培养基)。H69、H82、H526 的对照组和实验组[/size][size=16px]加药浓度梯度为 0、1、2、4、8、16、32、64 nmol/mL,SW1271 对照组和实验组细胞加药浓度梯度为 0、2、4、8、16、32、64、128、256 nmol/mL,(加药浓度梯度根据细胞类型、前期预实验结果及细胞对药物的敏感程度而定)。每种浓度设 6 [/size][size=16px]个[/size][size=16px]复孔,每孔总体积为 100 [/size][size=16px]μL[/size][size=16px],培养 24、48、72、96、120 h 后[/size][size=16px]分别检测细胞活力。每孔加入[/size][size=16px] 10 [/size][size=16px]μL[/size][size=16px] 的 CCK-8[/size][size=16px](避光),培养箱中孵育[/size][size=16px] 4 h 后取出,使用酶标仪测定波长为 450 nm 的吸光度(OD 值)。利用公式:抑制率=(加药组-空白组)/(对照组-空白组)计算增殖抑制率。实验重复 3 次,取平均值。以药物浓度为横坐标,细胞增殖抑制率为纵坐标,利用[/size][size=16px]Graphpad[/size][size=16px] prism5 绘图。[/size] [size=16px]敲低[/size][size=16px] MSI1 对人小细胞肺癌细胞增殖能力的影响[/size][size=16px]CCK-8 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲[/size][size=16px]瓒[/size][size=16px],生成的甲[/size][size=16px]瓒[/size][size=16px]物的数量与活细胞的数量呈正比,因此可以直接进行细胞增殖和毒性分析。[/size][size=16px]CCK-8 法 测 生 长 曲 线 实 验 结 果 如 图[/size] [size=16px]3-1 显 示 , 实 验 组 H69-shMSI1-1 、[/size][size=16px]H69-shMSI1-2 、 H82-shMSI1-1 、 H82-shMSI1-2 、 H526-shMSI1-1 、 H526-shMSI1-2 、[/size][size=16px]SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞的 OD [/size][size=16px]值明显[/size][size=16px]低于对照组。[/size][size=16px]表明敲低[/size][size=16px] MSI1[/size][size=16px]抑制了[/size][size=16px] SCLC 细胞的生长增殖。[/size][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211302321138249_2126_5887180_3.png[/img][size=16px] [/size][size=16px]图[/size][size=16px] [/size] [size=16px]MSI1 低表达对 H69、H82、H526、SW1271 对照组和实验组细胞增殖的抑制情况。应用 [/size][size=16px]Graphpad[/size][size=16px] prism5 作图所示(*P0.05,**P0.01,***P0.001,表示与对照组相比,[/size][size=16px]敲低组[/size][size=16px] OD 值减小[/size][size=16px]具有统计学意义)。[/size] [size=16px]测敲低[/size][size=16px] MSI1 对人小细胞肺癌细胞药物敏感性的影响[/size][size=16px]药敏实验结果如图[/size][size=16px] 3-2 所示,与对照组相比,实验组 H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-shMSI1-1、[/size][size=16px]SW1271-shMSI1-2 经不同浓度[/size][size=16px]顺铂处理[/size][size=16px] 24、48、72、96、120 h 后细胞的药物敏感性无明显变化。[/size][size=16px] [/size][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211302321124223_9282_5887180_3.png[/img]