透明质酸酶标准品

[align=center][b]羟丙基透明质酸质量标准的建立[/b][/align][align=center]杨桂兰，臧恒昌[b][/b][/align][b]摘要：[/b]透明质酸（HA）具有保湿、润滑、营养、修复和预防损伤等生理功能，在维持组织完整性方面和促进感染、损伤、胚胎发育过程中组织形成和重塑方面发挥重要作用。在化妆品、食品及医药领域的应用越来越广泛。但HA容易被体内透明质酸酶降解，体内留存时间短。研究者们期望通过对其进行修饰，得到抗酶解的HA衍生物，延长体内保留时间。修饰HA的衍生物近年来主要致力于将其修饰为两亲性衍生物，对抗酶解活性也有研究；这种亲油亲水性使其不仅能够降低降解速率，而且能够降低表面张力。其次，两亲性HA可以解决美容填充时HA分子量过大，黏度过高，注射困难的问题，修饰后的两亲性HA具有黏度降低（相同分子量相同浓度）的优点。HA两亲性衍生物也可作为生物可降解性的药物载体。 本文参考羟丙基淀粉取代度测定方法，建立了采用分光光度法测定羟丙基透明质酸（HHA）取代度的方法。同时摸索了HHA的抗酶解活性检测法、干燥失重、pH、蛋白含量及微生物等关键指标的测定方法。[b]关键词：[/b]透明质酸；羟丙基透明质酸[align=left] 本研究为确保自制羟丙基透明质酸的质量，特制定一系列产品的质量检验标准。[b]1分子量测定1.1材料[/b] NaCl(AR)，NaN[sub]3[/sub] (CP) ，BSA(Roch)；高效液相色谱仪，(美国Agilent)；多角度激光光散射仪，DAWNEOS，美国Wyatt。[b]1.2方法[/b] 测定条件：流动相：0.2mol/L NaCl (包含0.02% NaN[sub]3[/sub])；流速：0.6ml/min，样品浓度：0.05 mg/ml；柱温：35 ℃，进样体积：500 μl。按照仪器操作规程进行操作。[b]2取代度测定2.1原理[/b][/align][align=center][b][img=,497,113]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807251603456954_6718_3389662_3.png!w497x113.jpg[/img][/b][/align][align=left][b]2.2材料[/b] HHA；水合茚三酮、1，2-丙二醇、浓硫酸、亚硫酸氢钠、可见分光光度计、具塞比色管（25 ml），容量瓶（100 ml、1000 ml）[b]2.3方法 [/b] 丙二醇标准溶液的配制：准确称量1.0g丙二醇溶液于1000 ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，然后分别取2、4、6、8、10 ml于100 ml容量瓶中，定容至刻度，得到丙二醇含量分别为20、40、60、80、100 mg/ml的溶液。[b]2.3.1丙二醇标准曲线的制备[/b] 分别吸取上述丙二醇溶液0.5 ml于25 ml具塞比色试管中，置于冰浴中，逐滴加入4 ml浓硫酸（不宜加入过快，并不时震荡）混合均匀后置100 ℃的水中加热3 min（秒表控制），取出后立即放入冰浴中，冷却至15℃，沿管壁加入水合茚三酮试剂0.3 ml，边加边摇匀；在25 ℃的水浴中放置80 min，再用浓硫酸稀释至12.5ml（约7.7 ml浓硫酸）。缓慢倾倒混匀后（不要用混合器震荡），静置5 min，用1 cm比色皿于590 nm波长处测定溶液的吸光度，绘制吸光度—浓度曲线，拟合丙二醇标准曲线方程。 空白：以相同条件下不加丙二醇溶液作空白。[b]2.3.2试样的测定[/b] 分别称取0.05 g~0.1 gHHA及制备该批HHA所用HA粉末于100ml的量瓶中，量取25 ml的0.5 mol/L的硫酸，缓缓加入量瓶中。置于100℃水浴中加热，缓缓摇动，至试样完全溶解，冷却，用纯水定容，量取0.5ml此溶液置25ml比色管中，其余如上述丙二醇的配制方法。羟丙基含量和取代度算法分别如公式1、2所示。[/align][align=center][img=,411,64]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807251608249134_5590_3389662_3.png!w411x64.jpg[/img][/align][align=center]注： C：试样中丙二醇含量，由吸光度计算得出； m：取样量；0.7763：转换系数；[/align][align=center][img=,387,58]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807251610349286_9676_3389662_3.png!w387x58.jpg[/img][/align][align=center]注：6.9190：HA分子量/环氧丙烷分子量[/align][align=left][b]3抗HAase降解特性3.1材料[/b] 注射用透明质酸酶（HAase）（上海第一生化药业有限公司、1500单位/瓶）；缓冲液（磷酸二氢钠：0.0057 g、磷酸氢二钠：0.0230 g、氯化钠：9.0 g、纯化水：1.0 kg）；平氏黏度计，Φ1.0 mm、Φ2.0 mm；恒温水槽，上海仪表仪器厂； DK-8D数显恒温水浴锅，金坛市医疗器械厂。[b]3.2方法[/b] 称取HHA和对照HA各 0.5 g份于150 ml肖特瓶中，加入50 ml缓冲液，震荡至完全溶解。用氢氧化钠溶液或HCl溶液调节pH值6.0~7.2，取溶解液10.0 g，纯水稀释5倍；作为起始样品测黏度。取1500单位的酶用缓冲液稀释10倍，分别吸取40单位加入上述HA和HHA溶液中，摇匀，放入37℃的水浴中降解，24 h取样：称取10.0gHA溶液于50 ml容量瓶中，加入纯化水稀释至刻度线，加热煮沸2min，冷却至室温，测其在25℃下的运动黏度，算法如公式3所示。[/align][align=center] [img=,449,41]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807251629104708_3045_3389662_3.png!w449x41.jpg[/img][/align] 24小时黏度下降率Δη低于75%。[align=left][b]4透光率的测定4.1材料[/b] 紫外-可见分光光度计、电子天平（精度0.01g）[b]4.2方法[/b][/align][align=left] 取本品0.50g至盛有100 ml水的锥形瓶中，在冰箱中放置过夜，溶解后，纯水作为空白，参考紫外-可见分光光度计操作规程，550 nm波长处测定溶液的透光率。[/align][align=left][b]5pH的测定5.1材料[/b][/align][align=left] 电子天平（精度0.01g）、pH计、磁力搅拌器、磁子、100 ml锥形瓶、100 ml量筒、新沸放冷的纯化水。[/align][align=left][b]5.2方法[/b][/align][align=left][b]5.2.1 溶解[/b][/align][align=left] 称取供试品0.10 g，置锥形瓶中。加新沸放冷的水100 ml和磁子，将锥形瓶用封口膜封口，将锥形瓶置磁力搅拌器上搅拌约4小时，完全溶解，目测为均一透明溶液。[b]5.2.2 测定[/b][/align][align=left] 按照所用pH计的操作规程，先对pH计进行校准，之后将电极和温度探头深入被测溶液中，缓慢搅拌，读取pH值。[b]6运动黏度的测定6.1材料[/b][/align][align=left] 电子天平（精度0.1 mg）；平氏黏度计（毛细管内径为1.0 mm ± 0.05 mm）；恒温水浴：控温精度±0.01 ℃；秒表：分度0.01秒；振荡器。[b]6.2方法[/b] 称量样品0.1 g（折干），置100 ml容量瓶中，加水振荡至溶解后作为供试液。取毛细管内径为1.0mm ± 0.05 mm的平氏黏度计，加入5 ml供试液，置水浴中，25 ℃下放置15分钟后，秒表测定供试液流过黏度计两条线之间的时间，取两次测定的平均值按下式计算，即为供试品的运动黏度，计算方法如公式4所示。[/align][align=left] 运动黏度ν（mm[sup]2[/sup]/s）＝[i]Kt [/i]公式（4）[/align][align=center]式中 [i]K[/i]为用已知黏度的标准液测得的黏度计常数，mm[sup]2[/sup]/s[sup]2[/sup]；[/align][align=center][i]t[/i]为测得的平均流出时间，s；[/align][b]7干燥失重7.1材料[/b] 卤素水份测定仪，HHA样品；[b]7.2方法[/b][align=left] 取本品约1.0g，置HG53 型卤素水分测定仪托盘内。110 ℃测定15分钟，记录测定结果。[b]8细菌、霉菌及酵母菌测定8.1供试液制备 [/b][/align][align=left] 取34ml无菌磷酸盐缓冲液1瓶，将1500U HAase加入其中，用吸量管各吸取1ml分别加入至4个平皿中，作为阴性对照。再取样品1.5 g，加入到做完阴性对照的含有HAase的30 ml磷酸盐缓冲液中，42℃下振荡溶解，制得 1﹕20的供试品溶液。[b]8.2 细菌总数测定[/b]（1）阴性对照试验将温度低于45℃溶化的营养培养基分别注入上述2个含有1 ml的磷酸盐缓冲液的平皿中，每个平皿约15～20 ml左右，凝固，倒置培养。均不得有菌生长。（2）样品测定用吸量管准确吸取上述1∶20的供试液2ml加入至8 ml的磷酸盐缓冲溶液中，混匀，作为1∶100的稀释级。向平皿中分别加入1∶20、1∶100的供试液各1 ml，向每个平皿注入温度低于45℃的事先溶化的营养琼脂约15～20 ml，待凝固后倒置放入培养箱中。每个稀释级均制备2个平板。[b]8.3 霉菌及酵母菌数测定[/b]（1）阴性对照试验 分别注入向2个含有1ml的上述磷酸盐缓冲液的平皿中将温度低于45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基，每个平皿约15～20 ml左右，凝固，倒置培养，均不得有菌生长。（2）样品测定 用吸量管准确吸取上述1∶20供试液2ml加入至8 ml的磷酸盐缓冲溶液中，混匀，作为1∶100的稀释级。各吸取1∶20、1∶100的稀释级的供试液1 ml加入至平皿中，注入温度不超过45 ℃的溶化玫瑰红钠琼脂培养基，每个平皿约15～20 ml，待凝固后，倒置培养。每个稀释级均制备2个平板。[b]8.4 结果[/b] 将营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板分别倒置于30～35℃、23～28℃生化培养箱中，营养琼脂平板培养3天，用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养平板培养5天，用于霉菌、酵母菌计数，按照稀释比例，计算出每克样品中的微生物数。[b]9 结论[/b] 采用制定的质量标准对产品检验，结果表明，HHA能保持HA的润滑性和流动性，也具有明显的抗HAase降解的特性；克服了HA衍生物抗酶解但缺少润滑性的缺点，预期用途是开发成骨关节注射液或皮下注射填充剂用于美容，期望能够延长体内保留时间起到长效治疗的作用，减少患者注射次数，减轻患者痛苦。[/align][align=center]参考文献[/align] 赵凯, 刘丽艳, 刘婧婷. 分光光度法测定羟丙基淀粉取代度. 食品科学，2011, 32(22) : 201-203.[align=center][b][/b][/align][align=center][b][/b][/align]