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在自然界存在一种叫做土壤杆菌的细菌,它能感染植物的受伤组织,特别是根茎交接处的受伤组织,引起冠瘿瘤。冠瘿病损害为数众多的双子叶植物,特别是葡萄、核果类树木和观赏植物。冠瘿细胞是植物肿瘤细胞,在许多方面与动物肿瘤细胞类似。它们只有无限生长的能力,把一小块冠瘿组织放入不含植物激素的培养基中培养,能长成大的细胞团块(愈伤组织),而正常植物细胞在不加植物激素的培养基中则不能生长。冠瘤拥胞能制造一类叫做冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物(如章鱼碱和蓝曙红),供根癌土壤杆菌作为养料使用,在正常植物细胞中从未发现过这类物质。 根癌土壤杆菌能把植物细胞转化为肿瘤细胞,是由于它含有一种肿瘤诱导质粒,简称Ti质粒。当细菌感染植物时,Ti质粒中大约占这个质粒l/10的DNA片段(称为转移DNA或T—DNA)进入植物细胞,并整合到植物的染色体上,随染色体一起复制。随后T—DNA携带的细菌基因(致瘤基因和合成冠瘿碱的基因)使在植物细胞中表达,使植物细胞转化成肿瘤细胞,并合成冠瘿碱。由于根癌土壤杆菌能把细菌基因引入植物细胞,并在那里表达出蛋白质来,所以人们称它为天然的“遗传工程师”。这给人们以启示。能否用重组DNA技术把与高产、优质、抗病、抗旱和抗盐碱等优良件状有关的基因循人到T—DNA中,然后再通过根癌土壤杆菌的感染把这些基因引入植物细胞呢?最近几年的研究进展表明,这是完全可能的。 Ti质粒是独立复制的环状DNA分子。由大约1.5—2xl05碱基对组成,相当于细菌染色体的3—5%。它有两个主要类型:一类叫章鱼碱质粒,含有这种质粒的细菌能以章鱼碱为氮源和碳源生长;另一类叫蓝署红质粒,含有这种质粒的细菌能利用蓝曙红。每一种根癌土壤杆菌只含有一种Ti质粒,或者是章鱼碱质粒,或者是蓝曙红质粒。这两种质拉的DNA同源性很低,一般为12—16%,说明它们可能具有不同的进化史。T—DNA是Ti质粒中最重要的组成部分.它所携带的基因主要有两个功能:一是决定肿瘤的形成和肿瘤的形态;二是控制冠瘿碱的合成。如果T—DNA中的致瘤基因发生突变,可能出现三种表型:一是产生比正常肿瘤个大的肿瘤;二是使肿瘤长出许多根;三是使肿瘤长出许多芽。在T—DNA区域以外也有一些基因已被定位,其中毒性基因的功能是决定根癌土壤杆菌对植物的感染以及T—DNA的进入和整合;章鱼碱代谢基因和蓝曙红代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶;质粒转移基因控制细菌的接合作用;不相容性基因控制Ti质粒与其它质粒的不相容性。 Ti质粒之所以能成为把外源基因引入植物的良好载体有两方面的原因。第一,携带质粒的根癌土壤杆菌的寄主范围很广,实际上它能转化所有的双子叶植物。第二,整合到植物染色休上的T—DNA能随种子遗传,而且T—DNA有自己的启动基因,可以启动与其连接的外源基因的转录。此外,也有人研究以植物病毒DNA为载体转移目的基因,或者直接把DNA注射到植物的花粉管和子房中。Ti质粒直接用作基因载体有两个困难:一是它的分子量太大,内切酶位点很多,不容易进行体外重组DNA操作;二是被T—DNA转化的植物细胞成为肿瘤细胞,不能再生成植株。克服第一个困难的办法是先把T—DNA克隆到大肠杆菌的小质粒上,把目的基因插入到小质粒的T—DNA中,然后再设法转移到天然的Ti质粒中。克服第二个困难的办法是在T—DNA的特殊位点中插入目的基因和供筛选用的抗药基因,一方面使致瘤基因发生插入突变,从而使转化细胞能再生成植株,另一方面使目的基因正好位于T—DNA的启动基因的下游,以便启动目的基因的转录。有人经过研究发现了这样一种作用模型:大多数双子叶植物受伤后会产生一种叫丁香酮(acetosyringone)的物质,这时土壤农杆菌感染后,丁香酮在Ti质粒上Vir A的产物A的协同作用下促进了Vir G产物G的活化(即磷酸化),然后产物G相继激活Vir B、V ir c、Vir D、Vir E等操纵子,特别是Vir D和Vir E。前者产生两种蛋白,D1为缺刻酶(nickase),它能特异性地在T—DNA两端产生缺刻;D2则是一种蛋白复合物,它粘在已断开的T—DNA的两端,具“导航”的功能,有人认为它是Rec A,起重组的作用。后者产生单链结分蛋白(SSB),有保护缺刻产生后的T—DNA的功能。T—DNA在诸多蛋白的导航、保护下重组进核基因组。这种转比方法优点是方便,不需分离原生质,且插入的基因拷贝数目少,比较稳定。但它的缺点是土壤农杆菌主要只适于侵染双子叶植物,单子叶植物能被侵染的较少,这就在一定程度上影响了这种方法的推广。有人发现单子叶植物受伤后很少产生丁香酮,这是否是侵染的关键呢?目的许多实验室都在作这方面的探索,以期望能克服这种方法的局限性。http://hiphotos.baidu.com/wfvcshengwu/abpic/item/629fdb39539824d63b87ce6e.jpg
[b][font=微软雅黑]双歧杆菌[/font][/b][font=微软雅黑]在食品工业中,喷雾干燥是一种生产率高、操作费用低的工艺,是普遍采用的制备干燥、稳定、体积小的食品或食品添加剂的方法之一。此外,还可用用保护和浓缩微生物。[/font][font=微软雅黑]许多人还报道了用喷雾干燥制备发酵用于生产发酵乳制品或作为提高奶酪风味的附加物。然而,微生物对喷雾干燥的温度及脱水很敏感。因此,如果喷雾干燥应用于发酵剂制备注意微生物的存活率。[/font][b][font=微软雅黑]双歧杆菌[/font][/b] [font=微软雅黑]Bifidobacterium是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌,末端常常分叉,故名双歧杆菌。双歧杆菌分布在胃肠的数量随年龄阶段的增长而减少,分布多的是母乳营养儿。已经发现,双歧杆菌有32个亚型,含有双歧杆菌的生物制剂多达70种。婴儿双歧杆菌占总肠道菌的百分之六十,60岁以上老人双歧杆菌只占百分之七点九。[/font][b][font=微软雅黑]双歧杆菌[/font][/b][font=微软雅黑]形态很不一致的杆菌,0.5~1.3 μm×1.5~8μm,常呈弯、棒状和分支状。单生、成对、V字排列,有时成链,细胞平行成栅栏状,或玫瑰花结状。偶尔呈膨大的球杆状 。[/font][align=center][img]https://img69.chem17.com/9/20190409/636904143730081616114.png[/img][/align][b][font=微软雅黑]双岐杆菌[/font][font=微软雅黑]药理作用:[/font][/b][font=微软雅黑]治疗便秘[/font][font=微软雅黑]、[/font][font=微软雅黑]肿瘤防治[/font][font=微软雅黑]、[/font][font=微软雅黑]保护肝脏[/font][font=微软雅黑]、[/font][font=微软雅黑]防治心血管疾病、改善乳糖消化[/font][font=微软雅黑]等[/font][b][font=微软雅黑]双岐杆菌[/font][color=#000000][font=微软雅黑]营养食品作用[/font][/color][color=#000000][font=微软雅黑]:[/font][/color][/b][font=微软雅黑]促吸收[/font][font=微软雅黑]、[/font][font=微软雅黑]抗衰老[/font][font=微软雅黑]、[/font][font=微软雅黑]防治疾病[/font][font=微软雅黑]。[/font][font=微软雅黑]如此重要的[/font][b][font=微软雅黑]双岐杆菌[/font][/b][font=微软雅黑]是如何在喷雾干燥中存活的呢?[/font][font=微软雅黑]双岐杆菌在喷雾干燥的存活情况和载体有很大的关系;有研究表明,双歧杆菌分别与含有明胶、树胶和可溶性淀粉的载体一起喷雾干燥,结果发现喷雾干燥后双歧杆菌的存活因其载体种类不同而不同。[/font][font=微软雅黑]很大程度上取决于所用的载体。比较不同的载体浓度对存活的影响。发现双歧杆菌在与明胶、树胶或可溶性淀粉喷雾干燥后存活率高。经喷雾干燥后双歧杆菌表现大存活,温度升高则失活升高,然后温度升高引起的失活程度因所用载体不同而不同。已有研究表明,采用可溶性淀粉程度大,采用脱脂乳则小。[/font]
话说为了应对市场需求,需要进行硫酸粘杆菌素的检测方法的开发,查找标准方法,大致浏览下用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]进行检测,基本资源有满足,开始工作。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/emyc1007.gif[/img]1.化合物性质及结构先介绍下硫酸粘杆菌素,分子结构图如下:[img=,200,197]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030927_01_3246897_3.gif[/img]分子式:2(C[sub]52[/sub]H[sub]98[/sub]N[sub]16[/sub]O[sub]13[/sub]).5(H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]),分子量:2801.27,纯度80.1%,PH3-7.5范围内稳定,为硫酸粘杆菌素A和硫酸粘杆菌素B的混合物。2. 配制标样。用十万分之一的天平,称取硫酸粘杆菌素10.20mg至10mL容量瓶中,用换算成硫酸粘杆菌素浓度C=2=1347.98mg/L,用体积比V[sub]1[/sub]+V[sub]2[/sub]=1+4的0.1甲酸乙腈溶液溶解,并配置成10mg/L工作液。3. 仪器方法建立。3.1质谱条件3.1.1寻找母离子硫酸粘杆菌素是由氨基酸缩合而成的碱性多肽类抗生素,在一级质谱中易与多个H +结合成多电荷正离子,初步选定流动相A1+B2=3+7,接双通,流速0.2mL/min,进浓度为5.0mg/L的标准品1μL,初始Fragment为100,用MS2 SCAN正模式扫描,得到ESI正离子模式全扫描质谱图如图所示,硫酸粘杆菌素的三电荷离子[sup]3 +[/sup]响应最高,,进而确定它们的母离子(m /z) 分别为390. 5、385. 8。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030929_01_3246897_3.png[/img]3.1.2优化Fragment电压将扫描模式该为MS2 SIM模式,将得到的Precursor Ion输入,驻留时间Dwell设为20,Fragment从1v-200V范围设置,在其他仪器条件不变的情况下进样,得到不同Fragment下的响应强度图,初步选定其Fragment在100V左右,进一步在100左右细化Fragment,最终选定硫酸粘杆菌素A和B的Fragment为110V。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030930_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030931_01_3246897_3.png[/img]3.1.3 ProductIon和CE优化将扫描模式选为Product Ion模式,将390.5和385.8作为Precursor Ion,MS2 From 100,MS2 To 400(包含母离子),Fragment选定优化好的110V,碰撞能按照CE=左右寻找,得到子离子,选定包含国标的离子,并得到大致CE范围,将扫描模式选为MRM模式,在得到的初步CE左右,进一步优化得到最佳的CE值。[align=center][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030932_01_3246897_3.png[/img][/align]综上,得到硫酸粘杆菌素的质谱条件,如下表: [b]表 1 目标化合物的质谱分析条件[/b][table=745][tr][td=1,2]No.[/td][td=1,2]中文名称[/td][td=1,2]英文名称[/td][td=1,2]CAS[/td][td]前体[/td][td]产物[/td][td]去簇电压[/td][td=1,2]碰撞能[/td][td]加速电压[/td][/tr][tr][td]离子[/td][td]离子[/td][td](V)[/td][td](V)[/td][/tr][tr][td=1,3]1[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素A[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]390.5[/td][td] 384.7*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]378.8[/td][td]110[/td][td]8[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][tr][td=1,3]2[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素B[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]385.8[/td][td] 380.0*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]373.9[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][/table][color=#231F20]注:[/color][color=#231F20]* [/color][color=#231F20]为定量离子。[/color][color=#231f20]3.2 流动相条件液相条件的寻找,首先确定流动相,在双通的用乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水=5+5、乙腈+0.1%甲酸水=3+7 3种比例条件下看峰型和响应的大小,选定乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最好,然后乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水5mmol/L乙酸铵=7+3、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水=7+3,出峰强度和峰型与乙腈+0.1%甲酸水=7+3基本一样,确定硫酸粘杆菌素在流动相比例乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最佳,先接色谱柱,笔者试验Agilent EclipsePlus C18 RRHD 1.8μm2.1*100mm,Waters HSS T3 1.8μm,Agilent XDB-C18 1.8μm,最终发现Agilent XDB-C18 1.8μm,对目标化合物分离效果及峰型最好。[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.用建立好的仪器方法配置标曲硫酸粘杆菌素 St50μg/L, 100μg/L,200μg/L,400μg/L,600μg/L.[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_02_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.前处理条件 4.1.化合物分析粘杆菌素为多肽类抗生素,含有多个氨基,极性很强,易溶于水,微溶于甲醇等有机溶液,PH3-7.5范围内稳定,可用HLB和阳离子交换柱进行净化。[/color][color=#231f20]4.2试验方法[/color][color=#231f20]4.2.1 前期试验[/color][color=#231f20] 通过国标方法及文献资料,选择4%三氯乙酸+4%乙酸铅, 10%三氯乙酸:乙腈=3:7溶液作为提取溶剂, 提取离心后 ,用正己烷净化 ,过500mgHLB ,3mL水淋洗,3mL5%甲醇/水淋洗,6mL甲醇洗脱 35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析,加标小瓶中理论值100μg/L,全程试剂空白,猪肉未知样品,及加标回收,均一样大,sp100μg/L有明显的基质干扰,单纯的标准品35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析,无回收。4.2.2前期试验分析与总结:a.最终进样不能吹干或旋干,选择N[sub]2[/sub](35℃以下)吹至1mL以下;b.HLB洗脱接受后,溶液较浑浊,说明HLB净化效果不佳;c.提取液4%三氯乙酸+4%乙酸铅较其他两种浑浊;d.分析化合物有多个氨基可选择离子交换柱, WCX柱。[/color][color=#231f20]4.2.2 再次试验[/color][color=#231f20]称样5.0g--- 添加标准品1mg/L×100μL[/color][color=#231f20]---加入10%三氯乙酸:乙腈=3:7 15mL----充分混匀,超声20min,离心 [color=#231f20]----[/color]上清液倒入新离心管[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color] 残渣继续用10%三氯乙酸:乙腈=3:7 10mL提取一遍[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color]合并上清液,用氨水调PH=7[color=#231f20]----[/color] 加入10mL乙腈饱和的正己烷,充分混匀,离心 [color=#231f20]----[/color]弃去正己烷层,下层过WCX(200mg,6cc),甲醇水平衡[/color][color=#231f20] ----5mL水淋洗 ----5mL甲醇淋洗----6mL甲酸:甲醇=1:4洗脱,接收[color=#231f20]----[/color]用N2在40℃下吹至1mL左右,用水定容至2mL,过0.22μm滤膜。[/color][color=#231f20]线性范围:25μg/L,50μg/L,100μg/L,150μg/L,200μg/L基质标曲。得到如下谱图:[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]回收率在70%左右。[/color][color=#231f20]综上:对于硫酸粘杆菌素,提取试剂用酸性,选用离子交换柱比HLB柱净化干净,定容之前溶液勿吹干(多次失败得出)。以上,是本人做硫酸粘杆菌素仪器方法开发时的一些经验和体会,希望能给大家带来帮助,也希望大家能多提提意见,共同进步,谢谢大家。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif[/img][/color][color=#231f20][/color][color=#231f20][/color][align=center][/align]