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硫酸粘杆菌素检测求助
话说为了应对市场需求,需要进行硫酸粘杆菌素的检测方法的开发,查找标准方法,大致浏览下用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]进行检测,基本资源有满足,开始工作。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/emyc1007.gif[/img]1.化合物性质及结构先介绍下硫酸粘杆菌素,分子结构图如下:[img=,200,197]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030927_01_3246897_3.gif[/img]分子式:2(C[sub]52[/sub]H[sub]98[/sub]N[sub]16[/sub]O[sub]13[/sub]).5(H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub]),分子量:2801.27,纯度80.1%,PH3-7.5范围内稳定,为硫酸粘杆菌素A和硫酸粘杆菌素B的混合物。2. 配制标样。用十万分之一的天平,称取硫酸粘杆菌素10.20mg至10mL容量瓶中,用换算成硫酸粘杆菌素浓度C=2=1347.98mg/L,用体积比V[sub]1[/sub]+V[sub]2[/sub]=1+4的0.1甲酸乙腈溶液溶解,并配置成10mg/L工作液。3. 仪器方法建立。3.1质谱条件3.1.1寻找母离子硫酸粘杆菌素是由氨基酸缩合而成的碱性多肽类抗生素,在一级质谱中易与多个H +结合成多电荷正离子,初步选定流动相A1+B2=3+7,接双通,流速0.2mL/min,进浓度为5.0mg/L的标准品1μL,初始Fragment为100,用MS2 SCAN正模式扫描,得到ESI正离子模式全扫描质谱图如图所示,硫酸粘杆菌素的三电荷离子[sup]3 +[/sup]响应最高,,进而确定它们的母离子(m /z) 分别为390. 5、385. 8。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030929_01_3246897_3.png[/img]3.1.2优化Fragment电压将扫描模式该为MS2 SIM模式,将得到的Precursor Ion输入,驻留时间Dwell设为20,Fragment从1v-200V范围设置,在其他仪器条件不变的情况下进样,得到不同Fragment下的响应强度图,初步选定其Fragment在100V左右,进一步在100左右细化Fragment,最终选定硫酸粘杆菌素A和B的Fragment为110V。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030930_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030931_01_3246897_3.png[/img]3.1.3 ProductIon和CE优化将扫描模式选为Product Ion模式,将390.5和385.8作为Precursor Ion,MS2 From 100,MS2 To 400(包含母离子),Fragment选定优化好的110V,碰撞能按照CE=左右寻找,得到子离子,选定包含国标的离子,并得到大致CE范围,将扫描模式选为MRM模式,在得到的初步CE左右,进一步优化得到最佳的CE值。[align=center][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030932_01_3246897_3.png[/img][/align]综上,得到硫酸粘杆菌素的质谱条件,如下表: [b]表 1 目标化合物的质谱分析条件[/b][table=745][tr][td=1,2]No.[/td][td=1,2]中文名称[/td][td=1,2]英文名称[/td][td=1,2]CAS[/td][td]前体[/td][td]产物[/td][td]去簇电压[/td][td=1,2]碰撞能[/td][td]加速电压[/td][/tr][tr][td]离子[/td][td]离子[/td][td](V)[/td][td](V)[/td][/tr][tr][td=1,3]1[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素A[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]390.5[/td][td] 384.7*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]378.8[/td][td]110[/td][td]8[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][tr][td=1,3]2[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素B[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]385.8[/td][td] 380.0*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]373.9[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][/table][color=#231F20]注:[/color][color=#231F20]* [/color][color=#231F20]为定量离子。[/color][color=#231f20]3.2 流动相条件液相条件的寻找,首先确定流动相,在双通的用乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水=5+5、乙腈+0.1%甲酸水=3+7 3种比例条件下看峰型和响应的大小,选定乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最好,然后乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水5mmol/L乙酸铵=7+3、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水=7+3,出峰强度和峰型与乙腈+0.1%甲酸水=7+3基本一样,确定硫酸粘杆菌素在流动相比例乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最佳,先接色谱柱,笔者试验Agilent EclipsePlus C18 RRHD 1.8μm2.1*100mm,Waters HSS T3 1.8μm,Agilent XDB-C18 1.8μm,最终发现Agilent XDB-C18 1.8μm,对目标化合物分离效果及峰型最好。[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.用建立好的仪器方法配置标曲硫酸粘杆菌素 St50μg/L, 100μg/L,200μg/L,400μg/L,600μg/L.[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_02_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.前处理条件 4.1.化合物分析粘杆菌素为多肽类抗生素,含有多个氨基,极性很强,易溶于水,微溶于甲醇等有机溶液,PH3-7.5范围内稳定,可用HLB和阳离子交换柱进行净化。[/color][color=#231f20]4.2试验方法[/color][color=#231f20]4.2.1 前期试验[/color][color=#231f20] 通过国标方法及文献资料,选择4%三氯乙酸+4%乙酸铅, 10%三氯乙酸:乙腈=3:7溶液作为提取溶剂, 提取离心后 ,用正己烷净化 ,过500mgHLB ,3mL水淋洗,3mL5%甲醇/水淋洗,6mL甲醇洗脱 35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析,加标小瓶中理论值100μg/L,全程试剂空白,猪肉未知样品,及加标回收,均一样大,sp100μg/L有明显的基质干扰,单纯的标准品35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析,无回收。4.2.2前期试验分析与总结:a.最终进样不能吹干或旋干,选择N[sub]2[/sub](35℃以下)吹至1mL以下;b.HLB洗脱接受后,溶液较浑浊,说明HLB净化效果不佳;c.提取液4%三氯乙酸+4%乙酸铅较其他两种浑浊;d.分析化合物有多个氨基可选择离子交换柱, WCX柱。[/color][color=#231f20]4.2.2 再次试验[/color][color=#231f20]称样5.0g--- 添加标准品1mg/L×100μL[/color][color=#231f20]---加入10%三氯乙酸:乙腈=3:7 15mL----充分混匀,超声20min,离心 [color=#231f20]----[/color]上清液倒入新离心管[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color] 残渣继续用10%三氯乙酸:乙腈=3:7 10mL提取一遍[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color]合并上清液,用氨水调PH=7[color=#231f20]----[/color] 加入10mL乙腈饱和的正己烷,充分混匀,离心 [color=#231f20]----[/color]弃去正己烷层,下层过WCX(200mg,6cc),甲醇水平衡[/color][color=#231f20] ----5mL水淋洗 ----5mL甲醇淋洗----6mL甲酸:甲醇=1:4洗脱,接收[color=#231f20]----[/color]用N2在40℃下吹至1mL左右,用水定容至2mL,过0.22μm滤膜。[/color][color=#231f20]线性范围:25μg/L,50μg/L,100μg/L,150μg/L,200μg/L基质标曲。得到如下谱图:[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]回收率在70%左右。[/color][color=#231f20]综上:对于硫酸粘杆菌素,提取试剂用酸性,选用离子交换柱比HLB柱净化干净,定容之前溶液勿吹干(多次失败得出)。以上,是本人做硫酸粘杆菌素仪器方法开发时的一些经验和体会,希望能给大家带来帮助,也希望大家能多提提意见,共同进步,谢谢大家。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif[/img][/color][color=#231f20][/color][color=#231f20][/color][align=center][/align]
问题: 请问下,大家有做过硫酸粘杆菌素的吗?回复: 不好做,结果能否做出来要看饲料的基质