细菌取菌移植器

大家是用什么方法抑制色谱柱内的细菌生长？

一、细菌的分布： 微生物种类繁多，繁殖迅速，分布广泛，不论自然界的空气、土壤、水，生活中的食物、各种物体和器械表面，以及动物和人的皮肤粘膜、与外界相通的腔道中都广泛存在着数量极其庞大的各种微生物，其中以细菌、放线菌最多。因此，了解微生物在自然界及正常人体的分布，对于在医疗实践及某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。 （一）空气中细菌的检查（设计性实验选题） （二）水中细菌的检查（设计性实验选题） （三）人体皮肤表面细菌的检查（设计性实验选题） 【附录】细菌菌落的计数方法 ①选择生长均匀，无片状菌苔生长的平皿观察。一般先用肉眼观察，用记号笔在平板底上进行点数（以免遗漏），然后再持放大镜检查有无遗漏的微小菌落。 ②如菌落多而密集，可用分区法或菌落计数器计数。分区法是用记号笔在平皿底部通过圆心做垂直线，分为http://www.bbioo.com/bio101/UploadFiles/200611/20061113123705956.gif四区，再分别选择菌落密集和稀疏的两个区，再做平分线，使每一小区为平皿面积的1／8 或1／16，然后再分别挑选菌落稀疏和密集的两小区 进行计数，所得数乘以8或16，即为该平皿的菌落总数。（图４-1） ③简易的菌落计数器是一块玻璃板上刻划有144个面积为1平方厘米的正方形小格。将长有菌落的培养皿放上，计算10个小方格内的菌落数，如为30个，则平均1小方格为3个菌落。若培养皿直径是9厘米，则半径为4.5厘米，整个培养皿上的菌数是3个×3.1416×（4.5）2=191个菌落。二、外界因素对细菌的影响微生物和外界环境有密切的关系，当外界环境适宜就能进行正常的新陈代谢生长繁殖；当外界环境条件发生巨大改变，可导致微生物的主要代谢活动发生障碍，生长停顿，甚至死亡。在医学上常用人工的方法造成对微生物不利的环境，来抑制或杀灭微生物，以达到消毒灭菌的目的。其方法大致可分为物理、化学和生物三大类。 （一）物理因素对细菌的影响 1、温度对细菌的影响2、紫外线杀菌试验 （二）化学因素对细菌的影响 化学消毒剂的杀菌作用（三）生物因素对细菌的影响 噬菌体的特异性裂解细菌试验 【材料】大肠杆菌、痢疾杆菌的肉汤培养物、痢疾杆菌噬菌体、普通肉汤、普通琼脂平板。 【方法】 （1）将琼脂平板划分成三等份，注明1、2、3。 （2）分别以接种环取菌后，在1、3处涂布痢疾杆菌，2处涂布大肠杆菌。http://www.bbioo.com/bio101/UploadFiles/200611/20061113123903343.gif（3）分别沾取一接种环的痢疾杆菌噬菌体加于1、2处中央，（注意不要交叉污染），另取一接种环的肉汤放于3处中央。 （4）置37℃孵育24小时后取出，观察噬菌斑出现的位置（见图4-2），并记录之。 （四）细菌对抗生素的敏感性试验---纸片扩散法 　　又称Bauer-Kirby法。是将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上，经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌圈。测量抑菌圈的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。体外药敏结果可作为病人治疗选用药物的参考。 【材料】金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18～24小时培养物、普通琼脂平板、小镊子；含有青霉素、庆大霉素、红霉素、复合磺胺、链霉素等抗生素的干燥滤纸片。 【方法】 （1）将金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌培养物密集均匀地涂布整个平板。 （2）将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，相互间应间隔一定距离。 （3）37℃培养24小时后，观察结果。 【结果】 根据药物纸片周围抑菌圈直径的大小来判断该菌对各种药物的敏感程度。判断标准见表4-1 （五）中草药对细菌的抑菌作用测定

[size=4] 我们对现今应用较为普遍的VITEK-AMS鉴定系统中报告“不能鉴定细菌”(UIO)菌株作了进一步分析，探讨其发生原因、处理方法，以期建立一套切实可行的仪器与手工方法相结合的细菌鉴定方法。[/size][size=4]　　[b]一、材料与方法[/b][/size][size=4]　　1. 仪器与试剂：VITEK-AMS 60型全自动细菌鉴定仪及其配套GNI、GPI、YBC试验卡（生物梅里埃公司产品)。[/size][size=4]　　2. 试验菌株：1 025株本院1999.10.21-2000.3.3临床标本分离的菌株进行了Vitek- AMS鉴定，其中应用GNI 卡631例、GPI卡334例、YBC卡60例。[/size][size=4]　　3.VITEK-AMS鉴定法：根据细菌表型特征，选择相应GNI+、GPI、YBC卡，严格按仪器操作说明进行，孵育后当检验地带网仪器报告结果为UIO时，挑取生长对照孔(GPI卡第1孔、GNI+卡第3孔、YBC卡第24孔)悬液于非选择性培养基上重新分离，观察是否纯培养，若是，分别按同法及以下两法鉴定。否则， 经纯培养后重新上机鉴定。[/size][size=4]　　4. 双歧检索鉴定法：根据Vitek全自动微生物分析系统技术资料提供的双歧检索表，依生化结果检索至属或种。[/size][size=4]　　5. 常规鉴定法：按照全国临床检验操作规程［1］进行，并经API系统(生物梅里埃公司) 复核鉴定至种。部分菌株鉴定依据文献［2］进行。 [/size][size=4]　　[b]二、结果[/b][/size][size=4]　　1. UIO发生机率：总共1025株细菌鉴定中，共出现UIO 44株，占4.3%。其中GPI卡334株，出现UIO16株，占4.8%；GNI+卡631株，出现UIO 24株，占3.8%；YBC卡60株，出现UIO4株，占6.7%。[/size][size=4]　　2.UIO发生原因：在44株出现UIO中，9株（0.9%)为待检细菌不纯，3株(0.3%)为浊度不合要求，2株(0.2%)为接种物孵育时间过长（超过48h），2株(0.2%)为超出试验卡鉴定范围（均为臭鼻克雷伯菌），1株(0.1%)为菌悬液不乳化（粘液型绿脓假单胞），其他如冲液时气泡过多，或其他原因不确定者27株（2.6%）。[/size][size=4]　　3.处理：（1）9株不纯菌株，经纯培养后，重新上机，均能成功鉴定。（2）35株纯培养但报告UIO菌株中，18株(1.8%)可通过双歧检索法获得结果，并与常规分类法结果完 全一致。3株（0.3%）浊度不合要求者经调整浊度后重新上机获得结果。 2株(0.2%)接种物超过48h菌株，经重新孵育后得以鉴定。1株(0.1%)为悬液不乳化菌株经|检验地带网|配制3个麦氏单位菌悬液，然后低速离心1～2 min(1 000r/min)，取上清液比浊并调节到所需的浓度后，得以鉴定。(3)余下11株(1.1%)菌中，仅2株(1株为大肠埃希菌，另1株为臭鼻克雷伯菌)不能从双歧检索表中查出结果，其他9株(主要为洋葱假单胞菌、琼氏不动杆菌、木糖产碱氧化杆菌等)，虽能从双歧检索表获得结果，但与常规鉴定法结果不相符合，或出现矛盾的生化结果，需增加试验项目，按常规鉴定方法及 API系统报告结果。[/size][size=4]　　[b]三、讨论[/b][/size][size=4]　　实验表明95.7%的临床分离菌株可通过VITEK-AMS正确鉴定，仅4.3%菌株无法一次性成功鉴定。细菌不纯是产生这部分菌株的主要原因（占近1/5），其他如待检菌菌龄、菌液浓度也是关系鉴定成败的关键。由于仪器本身原因（如对于罕见生物型、新种或不典型菌株无法鉴定）也不可忽视。正确处理这部分菌株，有重要的临床意义。实际应用自动化仪器时，必须挑取纯培养菌落，可提高鉴定率，对确认为纯培养而无法鉴定者，可通过传统分类法，参照双歧检索表能成功鉴定将近一半菌株，因此合理应用双歧检索表不失为一种较好的辅助方法。但仍有占总数1.1%菌株需用常规方法或其他方法如API系统重新鉴定。[/size][size=4]　　参考文献[/size][size=4]　　1，叶应妩，王毓三，主编. 全国临床检验操作规程. 第2版. 南京： 东南大学出版社,1997.5.[/size][size=4]　　2，Patrick R. Manual of clinical Microbiology (7th Edition). Washington DC: American Society for Microbiology, 1999.316-647. [/size]

据外媒报道，巴西里约的研究人员本月释放了1万只特殊的蚊子，这些蚊子全部携带一种可以对抗登革热的细菌。研究人员计划总共释放4万只这种蚊子，他们希望这些蚊子不断繁殖扩散，并成为蚊子群体中的大多数，从而减少登革热的案例。“益蚊”以毒攻毒24日，英国广播公司（BBC）报道称，这种特殊的蚊子是“益蚊”。据BBC报道，巴西的研究人员本月在里约热内卢北部的图比亚坎加区释放了1万只“益蚊”。按计划，他们将在4个月内，总共对里约市的4个目标街区释放4万只这种蚊子。巴西菲奥科鲁兹研究所的卢奇亚诺·莫雷拉是这个项目的带头人。据他介绍，这个研究项目开始于2012年。原来，这些蚊子身上携带一种能够阻止登革热病毒在蚊子之间传播的细菌。只要确保这些蚊子不断繁殖和扩散，成为各大街区里蚊子群体的主体，登革热的疫情就能大大得到控制。而此后，研究人员也无需再继续人工释放更多这种蚊子。“我们的团队将每周都对这4个目标街区进行调研。我们将通过特殊的诱捕器收集蚊子，然后对它们进行分析。”莫雷拉说。效仿澳大利亚巴西释放的“益蚊”身上携带的细菌叫做沃尔巴克氏细菌。这是一种昆虫共生细菌，广泛存在于节肢动物的生殖组织内。这种细菌对于携带和传播登革热病毒的埃及斑蚊能起到类似于疫苗的作用。沃尔巴克氏细菌不仅能够阻止登革热病毒在埃及斑蚊体内的繁殖，同时还对埃及斑蚊本身的繁殖起到抑制作用。一旦雄蚊感染了沃尔巴克氏细菌，即使雌蚊未受感染，两者的受精卵也不能发育成幼虫。另外，一旦雌蚊感染了沃尔巴克氏细菌，无论雄蚊是否受感染，两者的后代都会携带沃尔巴克氏细菌。因此，只要携带沃尔巴克氏细菌的蚊子成为一个地方蚊子群体的多数，登革热疫情就会得到抑制。在澳大利亚，这一个过程平均需要10周的时间。据报道，澳大利亚是最早通过这一措施抑制登革热疫情的国家。在巴西之前，越南和印尼已经效仿了澳大利亚这一做法。值得提出的是，沃尔巴克氏细菌不会传播给人类。早在2008年，澳大利亚的莫纳什就开始对沃尔巴克氏细菌进行研究。当时，因为有人担心这种细菌会传播给人类和家畜，研究人员们不得不在5年的时间内都使用自己的手臂来喂养这些蚊子。新闻背景登革热死灰复燃1981年，在巴西消失20多年的登革热突然死灰复燃。在随后的30多年里，巴西总共报告700万个登革热的病例。近年来，巴西一直是世界上登革热案例最多的国家。2009年至2014年，该国总共报告320万个登革热病例，其中有800个死亡病例。未来的3个月里，巴西的研究人员还将在另外3个街区释放3万只携带沃尔巴克氏细菌的蚊子，将在2016年展开大规模的研究评估这一项目的效果。“信息透明和提供恰当的信息对于街区里的住户具有优先的重要性。”莫雷拉强调。

自来水中有细菌微生物，煮开了，能杀死大多数细菌。但是杀死都细菌去哪里了？还不是被喝到肚子里去了

细菌内毒素1 设备：电冰箱、恒温水浴箱、超净工作台、旋涡混合器、计时器2 用具：剪刀、镊子、无热原空安瓿5mg/支、浮板、封口膜、精密[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url](50ml-250ml、250ml-1000ml)、吸头(50ml-250ml、250ml-1000ml)、PH试纸3 试剂3.1 细菌内毒素工作标准品：用于仲裁鲎试剂的灵敏度和各种阳性对照。3.2 鲎试剂：为冻干品制剂，灵敏度为0.25EU/ ml，规格为：0.1ml/支3.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量不超过0.03EU/ml注射用水。(BET水)3.4 0.1mol/L HCl溶液、0.1mol/L NaOH溶液（临用时用细菌内毒素检查用水配制）。3.5 清洁液：75％酒精4 操作步骤4.1 鲎试剂灵敏度复核试验：鲎试剂灵敏度定义为在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。4.2 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ或0.25λ四个浓度为内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阳性，按下式计算，反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1(∑x/4)当λc在0.5λ-2.0λ（包括0.5λ-2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。5 干扰试验5.1 用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数的稀释液分别将同一支细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水和供试品溶液制成每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素养检查用水和供试品溶液各做2支阴性对照管。如果最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算，用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。Es=lg-1(∑xs/4)Et=lg-1(∑xt/4)当Es在0.5 λ-2.0λ，且当Et在0.5Es和2.0Es时，则认为供试品在该浓度下I 干扰试验。6 检查法6.1 精密称取土霉素检品适量，加0.1mol/L HCl溶液适量溶解，加0.1mol/L NaOH溶液适量，调节PH在6.5-7.5之间，加BET水稀释至一定浓度，备用。6.2 取装量为0.1mol/L的鲎试剂5支，备用。6.3 NC管的制备：取0.2ml BET水加入一支鲎试剂中，摇匀。6.4 PC管的制备：取0.1ml BET水溶解一支鲎试剂，加0.1ml用BET水稀释的含2λ的内毒素工作标准品的溶液，摇匀。6.5 PPC管的制备：取0.1ml BET水溶解鲎试剂，加0.1ml的用供试品的稀释液稀释的含2λ内毒素工作标准品，摇匀。6.6 供试品管的制备：取0.1ml BET水溶解鲎试剂，加0.1ml的供试品稀释液，摇匀。6.7 以上各管按顺序排列，置浮板上，放置37±1℃的恒温水浴箱中，保温1小时±2分钟。7 结果判断：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（+）。凝胶从管壁滑脱者并不能保持完整者为阴性（-），供试品管2支均为阴性（-）。应认为符合规定；如2支为阳性（+），应认为不符合规定。如2支中1支为正（+），1支为负（-），按上述方法另取4支供试品管复试。4支中1支为（+），即认为不符合规定。阳性对照品为（-）或供试品阳性对照品管为(-)，或供试品阴性对照品为（+），试验无效。[em62]

细菌DNA的提取2006-10-24 17:19这里提供的是由Marmur于1961年建立，经Dale等人简化和发展，此方法略加修改后可用于其他细菌种类。主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化，所提取的DNA无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子克隆。⑴材料①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后，4摄氏度保存可长期使用)②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。④蛋白酶K ⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA⑵方法①取单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用试管）②将上述菌液接种于200mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用500ml或1000ml三角瓶）③离心，收集沉淀（5000r/m,10分钟）④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中，混匀。⑤加入200mg SDS，室温下振荡过夜，使细菌细胞充分裂解，裂解液呈粘稠状⑥加入等体积的酚/氯仿溶液，温和地混匀，细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面），重复萃取三次⑦加入2倍体积无水乙醇，此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（最终浓度50ug/ml），37℃保温1小时⑨加入蛋白酶K（50ug/ml）,继续保温1小时⑩加入等体积苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇，－20℃静止过夜25000g，4℃，离心15分钟，收集沉淀，用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES缓冲液中，4℃保存备用。⑶说明①本方法可用于其他种类细菌，但是溶菌条件需略加修改，对革兰氏阳性菌（如葡萄球菌），在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁，对于另外一些细菌（如分枝杆菌），在加入SDS后，将溶液加温至65℃是可取的。②一些种类的细菌含大量核酸酶，去垢剂不能完全抑制其活性，用TES缓冲液代替SSC缓冲液可通过EDTA的作用抑制核酸酶活性，必须注意的是，TES缓冲液离子强度较低，在加入乙醇之前需用醋酸钠调节DNA溶液的离子强度（醋酸钠的最终浓度为0.3mol/L）③DNA溶液中残留少量酚和氯仿，可在乙醇沉淀之前用水饱和乙醚萃取去除④比较纯净的DNA溶液的Ａ260/A280及A260/A235大于1.7

作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种:

【序号】：3【作者】： 刘玉红【题名】：磺化壳聚糖对细菌及其生物被膜抑制作用的研究【期刊】：浙江工商大学【年、卷、期、起止页码】：2019【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkWfZcByc-RON98J6vxPv10cxm4k5PbzNvdytKFlEVDMMEanklHvQrvc06GgLEtOUR&uniplatform=NZKPT

据台湾《联合晚报》报道，台湾“中央研究院”院长翁启惠和基因体研究中心副研究员马彻共同领导的研究团队，成功解构了细菌的保护屏障，突破了苦恼全球科学家２０年的“细菌谜团”。　　长久以来，医药界一直以转胜肽酶为标的，设计出一系列对抗细菌的抗生素，其中最有名的就是盘尼西林；然而，随着细菌抗药性的增加，这类抗生素的威力大不如前，人类在遭受各种细菌的强大威胁时，也逐渐面临无药可用的窘境。　　马彻说，虽然科学家清楚知道透过抑制转醣酶来开发新一代抗生素，但因对转醣酶的结构及作用机制不清楚，２０年来进展有限。“中研院”基因体研究中心近年来针对转醣酶进行一系列研究，成功利用Ｘ光绕射方法，清晰解构出金黄色葡萄球菌细胞壁上转醣酶及其受质的复合结构。今后只要设计出可阻断转醣酶继续作用下去的小分子药物，就能开发出可杀死细菌的新一代抗生素。 据报道，这项重要的研究发现，发表在“美国国家科学院期刊”最新一期刊物中，引起全球科学界高度重视。翁启惠认为，这是未来解决具抗药性细菌的利器，很有前景。

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（一）温度 　　各种细菌都需在最适生长温度的范围内生长。当外界温度明显高于最适生长温度，细菌被杀死；如果在低于细菌的最低生长温度时，细菌代谢活动受抑制，则出现抑菌作用。 　　1.高温：细菌蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜及酶类因热力作用发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍导致细菌死亡。大多数无芽胞细菌55℃～60℃加热30～60min即被杀死；加热100℃立即死亡，有芽胞的破伤风芽胞梭菌需煮沸3h才被杀死。热力灭菌分湿热和干热两种。在同一温度下，前者的效力大于后者 　　（1）湿热：常用的方法有 　　1）巴氏消毒法：方法有两种：一是61.1℃～62.8℃30min；另一是71.7℃l5～30s，目前主要用于牛乳消毒。 　　2）煮沸法：煮沸100℃（1个大气压状态下）。5min中可杀死细菌繁殖体，如于水中加入2％碳酸钠，则可提高其沸点至105℃，既杀死芽胞，又防止金属器皿生锈。 　　3）流通蒸气灭菌法：常用阿诺（Arnold）流通蒸气灭菌器或蒸笼。利用一个大气压下100℃水蒸气进行消毒。经10～30min细菌繁殖体被杀死，但对芽胞的作用不大。 　　4）间歇灭菌法：采用间歇加热方式达到灭菌目的。方法是将待灭菌物品置于Arnold灭菌器内，经l00℃加热15～30min，每日一次，连续3次。每次灭菌后，取出再置37℃孵箱过夜，使残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气加热使之被杀死。这样可达到杀死芽胞又使不耐100℃的物质保存下来。 　　5）加压蒸汽灭菌法：利用密闭的耐高压的高压蒸汽灭菌器，在蒸汽不外溢的条件下，使锅内压力增高，蒸汽的温度也随之增高，大大加强其杀菌效力。通常在103.4kPa的压力下达121.3℃，维持15～20min可杀灭所有细菌芽胞和繁殖体。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。 　　（2）干热 　　1）烧灼：是常用的干热灭菌法。微生物实验室使用的接种环、接种针、瓶口和试管口常在火焰上烧灼灭菌。 　　2）干烤：在密闭干烤箱内加温至160℃～170℃维持2h是对一般玻璃器皿、注射器、瓷器的灭菌方法，适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品医学教.育网搜集整理。 　　2.低温：一般细菌耐低温，在低温条件下，细菌代谢活动降低不再繁殖，能较长时间维持生命，故常用于保存菌种。为避免解冻时对细菌的损伤，可在低温状态下真空抽干，去尽水分，此法称冷冻真空干燥法，可保存细菌数年至数十年，是目前保存菌种的最好方法。

.4 水质的细菌学检测 9.4.1 水中细菌总数的检测 9.4.1.1 目的和原理 水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关，它是评价水质污染程度的一个重要指标之一。由于重金属及某些其它有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，因此总细菌数少的水样，并不能排除已被这些物质所污染。本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细期总数是指1毫升水样在营养琼脂培养基中，37℃、24小时培养后所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水中总菌数不得超过 100个。 9.4.1.2 材料和器皿 （1）培养基①营养琼脂培养基②2216E培养基：蛋白胨 5.0克 酵母膏 1.0克 FePO4 0.01克 琼脂 18.0克 陈海水 1000毫升 pH 7.6～7.8 （2）无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养皿，盛有90ml及 9mL灭菌蒸馏水的锥形瓶和试管。 9.4.1.3 方法和步骤 （1）采集水样。（2）吸取10 ml水样（河水、污水、游泳池水或港湾水等），注入盛有90ml无菌水或无菌海水的三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。（3）按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、10-4。（4）根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4稀释度；中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿 1ml。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30—300个之间。（5）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培养基（用于河水样）或2216E培养基（用于海水、港湾水样）约15ml，立即旋摇培养血，充分混匀，水平放置至固化。（6）接种河水的培养皿，倒置于37℃培养24小时。接种海水样，港湾水样的培养皿，应倒置后于18—20℃下培养到长出明显菌落（5天左右）止。 9.4.1.4 结果与分析 取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。（1）菌落计算原则平皿菌落的计算，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。对长得相当接近，但不相触的菌落，应予以—一计数。对链状菌落，应当作为一个菌落来计算。平皿中若有较大片状菌落时则不宜采用，若片状菌落少于平皿的一半时，而另一半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。算出同一稀释度的平均菌数，供下一步计算时用。（2）计算方法①首先选择平均菌落数在30～300者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数（见表5－9的例1）。②若有两个稀释度的平均菌落数都在30—300之间，则应按两者的比值来决定。若其比例小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的数字（见表7-例2和例3）。③如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例4）④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例5）。⑤如果全部稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表5－9例6）。③菌落计数的报告，菌落在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表5－9的“报告方式”栏）。 表5－9 稀释度选择及菌落报告方式 例次 不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比 菌落总数（个／ml）报告方式（个／ml） 10 -1 10 -2 10-3 1136016420-1640016000或1.6×104 22760295 461.63775038000或3.8×104 3289027160 2.22710027000或7×104 4无法计数4651513-513000510000或5.1×105 527 11 5 -270 270或2.7×102 6无法计数305 12- 30500 31000或3.1×104

用细菌杀死细菌病菌对抗生素产生了耐药性怎么办？或许可以用另一种细菌来杀死它。新加坡研究人员利用合成生物学手段，通过基因改造使大肠杆菌分泌专门的毒素，成功杀死绿脓杆菌。 绿脓杆菌是一种生存能力很强、对多种抗生素和消毒剂有耐药性的细菌。 不同类型的绿脓杆菌之间因生存竞争而存在“内战”，它们会分泌称为绿脓菌素的毒素，彼此攻击。每种绿脓菌素只对特定菌株起作用。新加坡南洋理工大学的研究人员利用这种特性，给大肠杆菌植入基因，使其分泌可杀灭感染人类的绿脓杆菌菌株的毒素。 在这种大肠杆菌作用下，实验室中培养的绿脓杆菌只有1％能够存活，绿脓杆菌形成的生物膜也比正常情况下稀薄得多。生物膜是由细菌及其分泌的物质形成的膜状物，毒性和耐药性比单个细菌更强。 不过这一方法目前还有缺陷，离实用尚有距离。研究小组正在设法改进这种方法，并在培养另一种大肠杆菌菌株,用于杀灭霍乱弧菌。

一、目的和要求(1) 了解水细菌学检验的卫生学意义和基本原理，掌握水中细菌总数的检验方法。(2）了解平板菌落计数原则。二、原理水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求各不相同，无法找到一种在某种条件下使水中所有细菌均能生长繁殖的培养基。因此，通常选择一种大部分细菌能生长的培养基，通过生长出来的菌落大致计算水中细菌总数。目前一般是采用普通肉膏蛋白陈琼脂培养基。三、仪器与试剂(1)高压蒸汽灭菌器。(2）显微镜。(3）灭菌水。(4）肉膏蛋白陈琼脂培养基。蛋白陈 l0g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15-20g蒸馏水 1000m将上列成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4-7.6，过滤，分装于玻璃容器中，经121℃ (151b①/in2）高压蒸汽灭菌20min，冷暗处备用。四、实验步骤1．水样的稀释根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管做10倍系列稀释。①11b=0. 453 592掩，下同。2．接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，再倾注约15mL已融化并冷却到45℃左有的培养基，并立即转动平皿，使水样与培养基充分混匀。每个水样应倾注3个平皿。每次检验时另用3个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。3．培养待冷却凝固后，翻转平皿，使皿底向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数。3个平皿中的平均菌落数即为水样1mL中的细菌总数。4．菌落计数做平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大状菌落生长时，则不宜采用；而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数；若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。五、数据处理1．按各种不同情况进行计算(1) 首先选择平均菌落数在30-300者进行计算，当有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告。(2) 若有两个稀释度，其平均菌落数均为30-300，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的菌落总数。(3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。2．菌落计数的报告菌落数在100以内时按实有数报告。大于100时，采用2位有效数字，在2位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示，报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。六、注意事项(1）严格无菌操作，防止污染。(2）根据水样污染程度选择稀释倍数，必要时做预实验。

问:分离的细菌如何鉴定?答:细菌的传统鉴定 1. 形态特征及染色结果 ①革兰氏染色 ②鞭毛染色 ③荚膜染色 ④细胞壁染色（NaCl法：1.取1d25%NaCl溶液于洁净的载玻片上。2.挑一环培养6h的细菌在25%的NaCl中涂匀，自然凉干。3.滴加0.01%的结晶紫于其上，30s后水洗干燥，油镜观察。） ⑤抗酸染色 2. 培养特征观察取菌龄24-28h的菌3.6接种于PDA平板，PDA斜面，营养肉汤中培养24h，进行琼脂柱，明胶穿刺培养，30℃培养24h。 3. 生理生化实验需氧性测定和运动性测定：将斜面培养24h的待测菌用接种针穿刺到培养基管底，3d后观察变化。如果菌落沿培养基表面生长，表明为好氧菌，反应为阳性，如果菌落沿穿刺线生长，反应为阴性。培养基成分：蛋白胨0.2g，NaCl0.5g，K2HPO40.2g，琼脂0.5-0.6g，葡萄糖1.0g，水100ml。 4. 生长温度测定在肉汤培养基（外加1%葡萄糖）中用接种针接种，在恒温水浴锅中不同温度下（[c

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，微生物检验中常用的生化反应介绍如下： 　　一、糖酵解试验　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。　　二、淀粉水解试验　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。　　试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

1 水中大肠菌群（Coliform group）细菌的检测 1 .1目的和原理 如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染而引起肠道传染病。由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个。 大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经37℃ 24小时培养，能产酸产气，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌。本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，此一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。本法除了用于检测水样（淡水或海水）外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50克样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡1—2分钟，便成10-1稀释，以用于检验。 1.2 材料与器皿 （1）培养基二倍浓度的乳糖胆汁液体培养基一倍浓度的乳糖胆汁液体培养基伊红——美蓝琼脂（E．M．B．）培养基亮绿乳糖胆汁（B．G．B）液体培养基营养琼脂培养基（2）灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染液、灭菌培养皿 1.3 方法与步骤 （1）假定试验①用10ml水样，接种到二倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接三支 。②用lml水样，接种到一倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接种三支。③制备水样 10-1和 10-2的稀释液。④分别接种lml10-1和 10-2稀释液到一倍浓度的乳糖胆汁管中，每个稀释液接种三支。⑤在35℃中培养48小时，观察有无气体和酸产生。⑥在48小时以内，培养管内倒置的杜汉氏管中有任何量的气体积累，便可断定为阳性假定试验。若培养管内液体清晰而杜氏管中有气泡时，可能为放置不当而残存的空气泡，不可与产气的阳性反应相混同。无气泡着为阴性。产酸者呈黄色。(2) 确信试验①取呈阳性和阳性可疑的初步发酵试管，轻轻振荡或转动，然后以无菌的金属接种环，转移1环培养物至亮绿乳糖胆汁管中，于35C℃培养48小时。如在倒置的杜汉氏管中产气，不论其量多寡，皆为阳性确信试验。②凡初步发酵试验管在24小时之前就显示活跃的发酵（产气量占杜汉氏管10％以上）的试管，应及时转移至确信试验的培养基。（3）完成试验①取上述阳性确信试验管，在伊红一美蓝平板上划线分离，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：a．划线间距至少相隔0.5厘米 b．接种针尖端要稍弯曲 c．先对发酵管轻击，并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣，d.划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面，以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于35C培养24小时。② 24小时后，观察在EMB平板上出现的单个菌落，具核心及深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37 ℃培养24小时。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在。③ 在EMB平板上呈较典型的大肠菌群细菌还可再次转接至乳糖胆汁发酵管中，在37℃下培养48小时，产生气体者即确认了大肠菌群细菌的存在。④ 根据证实有大肠菌群细菌存在的阳性管数查表5－10，以确定大肠菌群数。整个试验的步骤见图5－7所示。 图5－7 大肠菌群细菌的检测 1.4 结果及分析 将上述各个试验阶段的结果列表记录，并最后算出水中所含大肠菌群的最大可能值（表5－10）。 表5－10 最近似数（MPN）指数和95%置信度检索表 出现阳性反应的试管数每100ml中的MPN指数95% 置信度 在3支10ml 试管中在3支1ml 试管中在3支0.1ml 试管中下限 上限 0013 0.59 0103 0.5 13 10040.520 1017121 1107123 11111336 12011336 2009136 20114337 21015344 21120789 22021447 2212810150 300234120 301397130 3026415380 310437210 3117514230 31212030380 3209315380 32115030440 32221035470 330240361300 331460712400 33211001504800 本试验所用的培养基系选择培养基，许多细菌都不能利用培养基中的乳糖来发酵产气产酸，而大肠菌群细菌及少数其它种类的细菌可发酵乳糖产气产酸。培养基中的胆汁（牛、羊或猪的胆酸盐）是表面活性剂，它不会抑制大肠菌群细菌的生长，但能抑制其它革兰氏阳性细菌，如芽孢形成菌的生长。在胆汁缺乏时可用0.1克的十二烷基磺酸钠替代。溴甲酚紫（或亮绿）是pH的指示剂，大肠菌群在发酵乳糖产气外还同时产酸，该指示剂有助于我们判断发酵的进程。在假定试验的初步发酵管中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过确信试验和完成试验，对初步发酵中的阳性可疑管进行复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态观察，即可将那些少量的非大肠菌群细菌（“假阳性管”）删除去，放在记录时须把三步试验都呈阳性的试管数计入阳性反应管。 1.5 培养基配制 （1）乳糖胆汁液体培养基： 蛋白胨 20.0克 乳糖 5.0克 胆酸钠 5.0克 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1毫升 蒸馏水 1000毫升. 将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000毫升蒸馏水中，调pH至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1毫升，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115℃灭菌20分钟。（2）伊红－美蓝琼脂（E．M．B）培养基①蛋白胨琼脂培养基（其成分为蛋白胨10.0克；琼脂18.0克；蒸馏水1000毫升；pH7.6） ②20％乳糖 2毫升 ③2％伊红溶液 2毫升 ④0.5％美蓝溶液 1毫升 将已灭菌的蛋白胨琼脂培养基加热溶化，冷却至60 ℃左右时，将已灭菌的乳糖溶液、伊红溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入，摇匀后即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏，故必须严格控制灭菌温度，一般为115℃，20分钟。（3）亮绿乳糖胆汁（B.G.B.）液体培养基蛋白胨 10.0克 乳糖 10.0克 胆酸钠 20.0克 亮绿 0.0133克 蒸馏水 1000毫升 pH 7.4 分装试管后，加入杜汉氏小管，115℃灭菌20分钟。

感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性]培养基[/url]中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp[sup]r[/sup]等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性[://]培养基[/url]上。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为[i]lac[/i]Z'基因。[i]lac[/i]Z'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。任何携带着[i]lac[/i]Z'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(异丙基β—D—硫代半乳糖苷)诱导后，在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落（半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝）。而当有外源DNA片段插入到位于[i]lac[/i]Z'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而显蓝色，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。[仪器、材料与试剂](一) 仪器和材料 超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴、离心管、试管、培养皿、锥形瓶、接种针、玻璃涂棒、酒精灯、镊子、牙签、大肠杆菌DH5a 、质粒(二) 试剂0.1mol／L CaCl2溶液 LB液体培养基 LB固体培养基 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg／mL溶液，置—20℃冰箱保存。Xgal：将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20℃。IPTG：取2g IPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL，用0.22um滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。[实验步骤](一) 制备感受态细胞1、吸取15µl E.coil菌液，接种于20ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，待OD600=0.5左右将该菌悬液以1：50接种量转于50ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20-30min测一次OD600，至OD600=0.6左右，停止培养。2、培养液转入离心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm离心10min。3、弃上清液，用4ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30min。4、4℃下5000rpm离心6min。5、弃上清液，用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。6、以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，分装于1.5ml离心管中，每管100µ l感受态细胞悬液，置-70℃条件下保存。.(二) 质粒DNA转化大肠杆菌1、取100µl摇匀后的感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入5µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min。2、加入900µl LB液体培养基，则总体积约1ml，混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Amp[sup]r[/sup]。3、在预制的LB琼脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃倒置吸收。4、将恢复培养的菌体4000rpm离心5min，移去上层900µl LB培养基，用余下的100µl重悬菌体至均匀。(四) α互补现象的检查将重悬菌体均匀涂布于含X-gal+IPTG+氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12—24h，出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。如果进一步验证，可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养6-8h，然后提取质粒酶切验证，或进行菌落PCR扩增鉴定。

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物检验中常用的生化反应介绍如下：一、糖酵解试验　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

[size=4] 在环保部监测站的建设标准中所说的“细菌检定分类系统”，准确地说应该是“细菌检测分类系统“。该系统可与无菌操作台配套使用。[font=新宋体] 目前水中粪大肠杆菌群（耐热大肠菌群）检测方法主要有传统的滤膜法及多管发酵法，并且已经列入环保行业标准方法（HJ/T 347-2007），此两种传统方法被国内环境检测部门广泛采用，但上述方法操作时间长需2-5天，步骤较为繁琐，需验证试验，不能对水的卫生学状况做出快速评价，制约了其应用。 且多管发酵法每毫升水样中最低检出线为2个粪大肠菌群，而固定底物酶底物法却能抑制200万个异样细菌，精确检测到1个粪大肠菌群。 因此，固定底物酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。该方法及相关设备也可以作为一个[font=Arial]“细菌检测分类系统“。[/font][/font][/size][size=3][font=宋体][/font][/size]

电泳槽细菌测试流程如下。所用仪器：小冰箱、培养盘、温度控制在30摄氏度的细菌培养盘、无菌棉棒、可以长期保存的标签、可以自由处置的含90%的无菌水瓶。操作流程：1、打开稀释瓶倒入10ml电泳漆。2、塞上瓶塞并且轻摇瓶身，充分摇匀。3、将培养盘移出冰箱，并根据标签进行区分。4、将棉棒伸入稀释过的样品，滴三滴在琼脂上，进行测试。5、保持温度和湿度的稳定性。6、两天后定期做检查，7天后丢弃样品。根据以上实验，电泳漆的主槽要每周进行一次细菌含量的检测，当主槽进行过两次细菌测试时，对包括洗涤系统在内的整个系统进行UF或RO预处理；将主槽内使用的加仑数再加上软管中的加仑数（折合为主槽的10%），来计算增加的杀菌剂的数量。 先后用1.5%的Kathon EDC及硝酸银处理细菌。用在电泳槽以及洗涤槽内的杀虫剂必须是与存在的细菌是相配的。 在24小时内保持细菌的水平。

细菌总数测定法一、设备和材料恒温培养箱、恒温水浴槽、试管、移液管、菌落计数器、放大镜、托盘天平、称量纸、培养皿。二、培养基和试剂营养琼脂培养基 0.9%生理盐水三、检验程序待检样 适当倍数的稀释液 选择2-3 个适当稀释度各1ml分别加入灭菌平皿内 每皿内加入适量营养琼脂 37℃ 48±2小时 菌落计数→报告四、操作步骤1．按无菌操作要求称取样品10g，连同100ml生理盐水加入灭菌三角瓶内，震荡，使成1∶10的均匀供试液。2．用1ml 灭菌吸管吸取1∶10的供试液 1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，沿管壁注入装有9ml 灭菌的盐水管中，混匀即为1∶100的稀释液。3．另取1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次，应换用一支1ml灭菌吸管并充分混匀，稀释至10-3 倍数或适当倍数备检。4．在做上述10倍递增稀释时，每稀释妥一稀释度，即可取1ml稀释液注入9厘米平皿内。（一般可根据对供试品污染情况的估计，从供试液起，选择2-3个适宜稀释度进行测定，每个稀释度各用2-3个平皿）注：每次吸液时均应将待稀释液充分混匀，充分振荡或用吸管反复吹系数次。4．稀释液注入平皿后，将熔化并冷至45～50℃的肉汤琼脂培养基倾注平皿内约15mL，转动平皿使充分混合均匀后置水平台待凝。5．琼脂凝固后，翻转平板，置30-35℃培养箱内培养24h、48h，分别计算平板内生长的菌落，以48小时的菌落数为准。五、菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数（霉菌不包括在内），然后持放大镜检查有无遗漏，各平板菌落计数后，求出同一稀释度各平板生长的平均菌落数，如平板中有连成片状的菌落或在点样菌落蔓延生长时，该平板不宜计数。六、细菌菌数报告一般的报告方法是选取同一稀释度平均菌落数在30～300个之间的平板，作为菌落总数测定的范围，其中一个平板有较大片状菌落生长时，或两平板菌落数相差一倍以上，此稀释度不宜采用，稀释度的选择：1．一个稀释度，平均菌落数在30～300个之间时，乘以稀释倍数报告。2．两个稀释度，平均菌落数在30～300个之间，则应求出两者总菌数之比，比值小于或等于2应报告平均数，大于2则报告其中较小的数字。3．有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。4．所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。5．所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一个稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。6．有稀释度均无菌生长，报告数为10个/克。菌数的报告，菌数在100以内时，按实有数报告之，大于100时，采用左端前2位数字，在前两位数字之后的数值，以四舍五入法计算，数字后面的空，可用10的指数表示。如供试品经检验细菌数不符合要求，无特殊规定时应重新取样，依法复检两次，按三次结果平均值报告并判定合格与否。

近日有报道称，一些赴印度接受治疗的患者感染了一种新型超级细菌，其含有一种叫NDM-1的基因。这种细菌对现有的绝大多数抗生素都“刀枪不入”，甚至对碳青霉烯类抗生素也具有耐药性，而碳青霉烯类抗生素通常被认为是紧急治疗抗药性病症的最后方法。　　目前，这种变种超级细菌已经传播到英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家，并有可能在全世界范围内进一步蔓延。本月13日，比利时医疗人员证实，一名比利时人死于这种据信源自南亚的超级细菌，成为该菌致死“第一人”。　　“超级细菌的出现，是滥用抗生素的最直接恶果，而中国是全世界滥用抗生素最严重的国家。”广东省地中海贫血防治协会会长、南方医院儿科主任李春富表示，正常人体内有许多共生菌群，抗生素特别是广谱抗生素的不合理应用，打破了其平衡。每一种抗生素投入使用，没有被杀灭的细菌会迅速产生对这一抗生素的抗体，成为耐药菌。抗生素的滥用，使得细菌的抗药性越来越强，这类细菌统称为“超级细菌”。　　据统计，2007年我国门诊感冒患者约有75%应用抗生素，外科手术则高达95%，而超级细菌的出现是滥用抗生素最直接的恶果　　羊城晚报记者 张小磊 实习生 张莉 李翌　　新型超级细菌中含有ＮＤＭ—1基因，ＮＤＭ—1意思是“新德里金属蛋白酶—1”，是一种超级抗药性基因。这种脱氧核糖核酸结构可以在同种甚至异种细菌之间“轻松”复制。　　超级细菌研究人员认为，抗生素诞生之初曾是杀菌的神奇武器，但细菌逐渐进化出抗药性，近年来屡屡出现能抵抗多种抗生素的超级细菌。由于新型抗生素的研发速度相对较慢，对付超级细菌已经成为现代医学面临的一个难题。　　研制一种抗生素大约需要10年时间，而产生耐药菌素却在2年之内，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的繁殖速度。许多大的制药公司越来越不愿意为研发抗生素埋单，其原因除了抗生素开发到一定程度后，再开发新的品种所需的研发费用越来越高外，更重要的是快速的失效使医药公司的巨大投入得不到产出补偿。　　现状　　探因　　中国每年有20万人死于药物不良反应，其中因抗生素滥用造成的死亡占到40%　　世界医学界流传着一句话：“美国枪支容易买到，抗生素很难买得到，而中国恰恰相反。”据2007年统计，我国的门诊感冒患者约有75%应用抗生素，外科手术则高达95%。世界卫生组织调查显示，中国住院患者抗生素药物使用率高达80%，其中联合使用两种以上抗生素的占58%，远高于30%的国际水平。　　复旦大学附属儿科医院的统计数据显示，该院每年销售收入排序前三位的药物均为抗生素。2001年，15种最畅销的药物中抗生素药品就占了11种。此外，静脉注射已经成了滥用抗生素的新途径。每天1000个呼吸道感染的门诊患者里，有将近2／3会接受静脉注射治疗。儿科医院静脉应用抗生素呈现出逐年增多的趋势：1996年注射用抗生素消耗金额占全部抗生素消耗金额的比例为46.7%，而2001年上升到53.6%。　　据统计，仅超前使用第三代头孢菌素，全国一年就多花费7亿多元。滥用抗生素的直接恶果就是耐药性的日渐严重。以中国细菌耐药性最为严重的地区之一上海为例，上海人群感染的金黄色葡萄球菌中，80%已经产生了对青霉素G的耐药性。一些药品的有效率已经跌到了20%。在一些地方，预防结核病的卡介苗的有效率只有30%。　　有一组数字，或许能说明问题：中国每年有20万人死于药物不良反应，其中，因抗生素滥用造成的死亡要占到40%。我国7岁以下儿童因为不合理使用抗生素造成耳聋的数量多达30万，占总体聋哑儿童的30%至40%，而一些发达国家只有0.9%。在住院的感染病患者中，耐药菌感染的病死率为11.7%，普通感染的病死率只有5.4%。　　李春富说，滥用抗生素的直接副作用是，患者体内的病毒会对抗生素产生抗体，之后重复使用抗生素，就会无效。“抗生素的副作用往往潜伏期长，要多年后才能表现出来。可推断，未来的10—20年内，抗生素滥用对人体的肾脏、肝脏等产生的副作用会慢慢明朗起来。现在可确证的是，很多三四十岁的‘黑牙’人群，就是因为多年前滥用四环素这种抗生素引起的副作用。”　　探因　　患者数量庞大，医疗投入不足，部分医生经验欠缺，患者“急功近利”等造成“滥用”　　抗生素为何如此疯狂滥用？这是中国国情、国家经费投入、医生自身、患者四方面综合博弈的结果。　　就我国国情而言，中国是人口大国，每天走进医院的患者自然不少。“和外国情况不一样，我们每天一个上午就常常要诊断几十个病人，在如此短的人均诊断时间里，我们根本没精力对每个患者进行详细观察、询问、讨论甚至病情跟踪。”李春富说，加之，国家在医疗方面的投入不足，医生的工资跟不上经济发展的速度，很多方面的福利都只有靠医生自己。因此部分医生为了牟利，便不断给病人开抗生素。“从这方面讲，医生只有好好看病，与钱无关，才可能避免”。　　同时，不少医生临床经验和判断力不足，加之怕承担风险，常常为了稳妥起见，采用普遍使用的抗生素进行治疗，形成诊断的惯性。因而，临床经验比较足的医生，对抗生素的依赖会有所减少。广东省人民医院儿科主任林晓源谈到一个病例，某位患者找到其之前，已经去过多家医院，开了很多药，吃了都不见好转。林主任诊断后，只给他开了6块钱的药，患者起初一直对此表示怀疑。但按照医嘱服药两天后，药到病除。“当时他的病情恰恰不是用大量价格贵的抗生素能够治好的”，林主任说，我结合自己多年的临床经验观察后，才敢这样下药，但一般医生不太敢冒险选择这样做。　　滥用抗生素另一个“元凶”是患者“急功近利”的就医心情。一般说来，感冒发烧是上呼吸道病毒感染，无需使用抗生素，通过患者自身抵抗就能治好，但不能在一两天内就马上痊愈。“我们遇到的许多患者往往也求愈心切，看到短时内发烧症状不消，就会抱怨医生，甚至质疑其医术。医生有理说不清，干脆应患者所需，采用抗生素，早早解除症状了事。”林主任说。　　另外，抗生素属于处方用药，国家对这类药品是有着严格的要求的，没有医生的处方，药店是绝对不可以卖给顾客的。但是，现实情况中，我们在全国的大街小巷都可以任意购买抗生素，相关部门的监管存在明显漏洞。虽然任何一家药店或者药房都非常醒目地写着“RP”凭医生处方购买等字样，但实际上，任何人到任何一家药店，根本无须医生处方便能买到抗生素（包括任何针剂）等处方用药。甚至，很多药店还配有护士，就在药房里面直接地为买药者进行静脉注射，致使药房里打针致死命案时有发生。　　求解　　落实相关规定，明确使用界限，扶持“私人医生”跟踪治疗，减少使用抗生素　　“普通感冒我从来不开抗生素。”中国工程院院士钟南山教授曾经在“世界哮喘病日”义诊活动中指出，目前广东人因滥用抗生素造成的后果相当严重，使用抗生素一定要慎重。　　有个中国人讲述他在美国生病治疗的经历时说，当时他开车在纽约到孟菲斯的路上，忽然觉得肚子很痛，便电话求救。美国急诊室医生赶到后，做完相关检查，没给他开任何药，只让他拼命喝水便离开了。到目的地后，医生打来电话询问病情，之后第二天早上、中午、下午，医生又分别电话询问病情，几天后，患者好了。　　“像国外一样，多做检查，多观察，多跟踪，少用药，是避免抗生素滥用的最佳方法。”李主任说，但是目前我国条件根本达不到。那么，呼吁中国大医院采取患者人数限制，培养扶持“私人医生行业”，将更多的患者分流到家庭和个人，才是解决问题的好办法。　　2004年，卫生部出台《抗菌药物临床应用指导原则》，这是针对我国抗生素临床应用的第一部指导性意见，它规定了抗生素需凭处方销售，哪些抗生素可以口服，哪些抗生素可以注射，以及哪些抗生素不能同时使用等，以最大限度防止抗生素滥用。　　但是，如何避免条文流于空泛？对此，相关部门应将笼统的规定落实化，由医疗界开展学术研讨，将抗生素的使用界限定清楚，达成如何使用，何种情况下使用的共识。“有了这个共识，门诊和临床的工作人员才可能改变滥用抗生素的惯性做法，有方向，有目标，规范去做。”李春富说。

[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/06/202406241014302662_4223_5604214_3.jpg!w690x690.jpg[/img]　　在现代科技的快速发展下，生物检测领域也迎来了诸多创新与突破。其中，ATP细菌检测仪作为一种先进的生物检测仪器，凭借其独特的优势，在食品安全、医疗卫生、环境监测等领域发挥着越来越重要的作用。以下，我们将深入探讨ATP细菌检测仪的众多优点。　　首先，ATP细菌检测仪具备出色的快速性。相比传统的细菌培养方法，ATP细菌检测仪能够在短时间内迅速得到检测结果。传统的培养方法通常需要数天甚至更长时间才能观察到细菌的生长和繁殖，而ATP细菌检测仪则能够在几分钟到几十分钟内完成检测，大大提高了检测效率。这种快速性对于需要及时响应和处理的场合尤为重要，如食品加工行业、医疗机构和公共场所等。　　其次，ATP细菌检测仪具有高度的准确性。ATP是生物体内普遍存在的一种高能化合物，是细胞活动不可或缺的能量来源。ATP细菌检测仪通过检测样品中ATP的含量，可以间接推算出活菌的数量。由于ATP只存在于活菌中，因此ATP细菌检测仪可以直接测量活菌的数量，而不需要依赖于细菌的繁殖和计数。这种直接测量的方式使得检测结果更加准确可靠，避免了传统培养方法中可能出现的误差和干扰。　　再者，ATP细菌检测仪的灵敏性也是其一大优点。它能够检测到极低浓度的细菌，甚至可以达到每毫升几万个细菌的数量。这种高灵敏度使得ATP细菌检测仪能够及时发现潜在的微生物污染问题，为食品安全、医疗卫生和环境监测等领域提供了更加有效的保障。　　此外，ATP细菌检测仪还具有简便易用的特点。其操作过程简单易懂，不需要过多的技术和经验，只需按照说明书进行简单的操作即可。这使得ATP细菌检测仪能够广泛应用于各个行业和领域，为不同用户提供了方便和实用的检测手段。　　　综上所述，ATP细菌检测仪作为一种先进的生物检测仪器，在食品安全、医疗卫生和环境监测等领域发挥着重要作用。其快速、准确、灵敏、简便易用等优点使得它成为了一个多功能的生物检测工具。然而，在使用过程中仍需注意一些事项以确保检测结果的准确性和可靠性。随着科技的不断发展和进步，我们有理由相信ATP细菌检测仪将在未来的生物检测领域发挥更大的作用。

一块肉反复冷冻解冻四次，最后测得的菌落数，竟然是未冷冻前的15倍？日前，央视记者做出这样的实验结论。那么，这种结果是否有可能出现？昨天，记者采访了中国畜产品加工研究会的刘登勇博士，刘登勇博士的专业是肉品加工和质量安全控制，他告诉记者，这种情况是有可能出现的，所以肉解冻完还是最好一次吃掉。反复冷冻解冻，肉变质更快？4次解冻实验后，细菌竟然飙升15倍近日，网上流传一种说法，称肉类反复冷冻解冻后，会加快肉类腐败变质，增加细菌含量。针对这种说法，央视记者找到上海一家实验室，将从市场上买来的鲜肉，在五天中，先进行冰箱冷冻，取出后进行解冻，观察细菌生长的趋势。经过反复四次冷冻和解冻后，最后一次测得的结果，是最初没有冷冻时测试结果的15倍左右，很令人吃惊。为什么低温没把细菌杀死？解冻时细胞膜破裂，流出液体滋生细菌那么，这一实验结果是否有可能出现？对此，记者采访了中国畜产品加工研究会的刘登勇博士。刘登勇博士告诉记者，反复冷冻再解冻，是有可能出现菌落总数增加的情况的，而根据实验所处具体环境的不同，菌落总数增加的情况也会有所不同，不能说就一定会增加15倍或其他倍数。在极低温的冷冻环境下，肉品中的微生物不是应该被冻死了吗？为什么把冷冻完的肉取出来之后，细菌又会滋生呢？这其中又有哪些奥妙呢？对此，刘登勇博士告诉记者，在极低温度的情况下，肉品表面的细菌并不会被完全冻死，只是活力被暂时抑制住了。一旦肉品被从低温环境下取出，细菌就会重新获得有利于其生长的环境。而在这种过程中，有一个因素尤其有助于细菌繁殖。“在冷冻过程中，肉品中的水分会形成很多细小的冰晶，反复多次冷冻和解冻会导致冰晶不断长大，这些冰晶会刺破细胞膜，导致细胞中的液体流出来”，刘登勇博士说，这就是为什么肉解冻后会有少量液体流出来的原因，这些细胞中的水分富含营养，会让细菌繁殖得飞快，而每冷冻一次，就意味着细胞膜被多破坏一次，解冻后流出来的养分就会增加，所以细菌总数也会相应增加。

细菌生长繁殖的条件是充足的营养、合适的PH、适宜的温度和()。 A、酶 B、氧气 C、水分 D、生长因子