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我们以前做产气荚膜梭菌,标准菌在滤膜上会长黑色菌落。用磁珠和庖肉两种方法保存了菌种,过了一段时间从这两种取出再做也是对的。可现在,可能过了大半年吧,两种保存方法接出来的菌都是浅橙色半透明,不是黑色了。革兰氏染色镜检是阳性(紫色)较大的杆菌,和网上的图片很相似。不知道这样正常吗?是否只能是黑色菌落?求高手指点,谢谢!
老师们请教一下,产气荚膜梭菌检验公式中的 d 表示稀释因子(第一稀释度)是十分之一还是10?
1. 适应范围和应用领域1.1. 适应于饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的测定2. 方法原理2.1. 采用滤膜法。取50ml的水样用孔径为0.22um的滤膜过滤,然后将滤膜移至SPS琼脂培养基上,倒置于36℃±1℃厌氧培养24h,计数黑色菌落,任意挑取3个-5个在滤膜上生长的黑色菌落,分别接种FT培养基,于36℃±1℃厌氧培养18-24h后,将培养物做确证实验,根据实验结果确证产气荚膜梭菌的存在。3. 试剂 3.1. 庖肉培养基 3.2. 亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂(SPS) 3.3. 液体硫乙醇酸盐培养基(FT) 3.4. 动力-硝酸盐培养基(A法) 3.5. 卵黄琼脂培养基4. 仪器及设备 4.1. 恒温培养箱 4.2. 厌氧培养装置 4.3. 滤器5. 操作5.1. 样品测定5.1.1. 安装好过滤装置,在100级洁净工作台进行过滤操作。取50ml水样(若含菌量较多,可用0.1%蛋白胨水将水样按比例稀释)注入装有滤膜的滤器中,打开滤器阀门进行抽滤。5.1.2.结束过滤操作,用无菌镊子将滤膜倒置在SPS琼脂培养基上(或正置于SPS培养基上,在上层覆盖约5mlSPS培养基创建厌氧环境),滤膜应与培养基完全贴紧,两者不留气泡。5.1.3.倒置于厌氧装置中在36℃±1℃厌氧培养24h。计数平板上的黑色菌落数。5.2.确证性试验 挑取可疑黑色菌落3-5个,分别接种FT培养基,于36℃±1℃厌氧培养18-24h 5.2.1. 革兰氏染色镜检:产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌,其耐热菌株可能形成卵形芽孢,位于菌体中央或近端,其宽度一般不大于菌体。 5.2.2. 动力硝酸盐试验:接种针穿刺,36℃±1℃厌氧培养24h,观察接种线的生长情况,判断有无动力。然后滴加A液和B液2-3滴,观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌现象:无动力;硝酸盐阳性。 5.2.3. 含铁牛乳培养基试验:取生长旺盛的FT培养液1ml接种含铁牛乳培养基,在46℃培养2h后观察“爆裂发酵”现象。在5h内不发酵为阴性。产气荚膜梭菌为阳性。 5.2.4.卵黄琼脂试验:接种针取FT培养液点种于卵黄琼脂平板,,36℃±1℃厌氧培养24h,观察接种点变化。产气荚膜梭菌会分解卵黄中的卵磷脂,接种点底部及周围形成乳白色浑浊带。5.3.结果表述: 根据黑色菌落计数和确证性试验结果,计算每50ml水样中的产气荚膜梭菌数量,结果以CFU/50ml计。附图:[img=,490,278]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141058_01_3081717_3.png[/img]菌株培养---庖肉培养基(图左), 疱肉斜面培养基(图右)[img=,490,248]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141059_01_3081717_3.png[/img]产气荚膜梭菌在SPS培养基上的现象(图左)及大肠杆菌阴性对照[img=,490,514]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141100_01_3081717_3.png[/img]在FTG培养基上生长旺盛[img=,490,208]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141101_01_3081717_3.png[/img]动力-硝酸盐培养基(+)含铁牛乳培养基(+)含铁牛乳培养基(—)[img=,490,235]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141102_01_3081717_3.png[/img]产气荚膜梭菌在血平板上的溶血现象。