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张韧,王建超,陈文庆,刘华杰,高飞,徐舸辰,林龙飞(北京清大天一科技有限公司,北京102200) 反应器悬浮培养技术是目前国内外疫苗生产的热点之一,它可以极大提高疫苗的质量和生产率。介绍了该技术在国内外疫苗生产中的研发和应用现状,表明国内该技术目前已经在口蹄疫疫苗生产中获得成功应用,利用MDCK、Vero等细胞培养生产禽流感疫苗的技术也正在积极研发中,并将逐步替代传统的鸡胚生产工艺。积极推广和应用这一新型疫苗生产技术将是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。 生物反应器;悬浮培养;微载体培养;口蹄疫;禽流感 在我国,细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定,自2012年2月1日起,各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展进行了综述,分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病,国际兽医局(OIE)将之列为A类传染病。2010和2011年,在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性;通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前,面对国内外严峻的口蹄疫防控形势,高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代,许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统。1962年BHK21细胞悬浮培养成功,细胞增殖迅速,并成功应用于口蹄疫病毒的生产。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式,主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家(表1)。印度口蹄疫生产企业使用8000L反应器生产口蹄疫疫苗,南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000~5000 L反应器生产口蹄疫疫苗,口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性,这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859824_small.jpg*来自作者所属公司的客户信息调查但是,这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今,存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤(Tryptosephosphate broth, TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate, LAH)的GMEM及EMEM,再补加5%~10%牛血清(表1)。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定,导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高,一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家,牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性,不仅影响病毒繁殖,而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害,TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性,目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。自从20世纪的80年代起,细胞培养基(液)发展迅速,低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化,为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。1.2 国内应用现状 默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下简称“清大天一”)在国内较早开发了BHK21低血清细胞培养基和BHK21无血清无动物来源成分细胞培养基。2008年,清大天一开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术,并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右,工艺全过程管道化操作,产品内毒素含量低,口蹄疫疫苗生产和质量显著提高,同时生产成本下降30%。2009年,清大天一成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术,并 2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺,无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始,到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程,不添加任何的血清和动物来源成分,消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰,同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106~6×106/mL以上,为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图,相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺,因实现细胞无血清培养,工艺过程无需沉降换液。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859832_small.jpg 图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段,其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。
㈠无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体,病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素,以及一些蛋白质如清蛋白,纤连蛋白,胎球蛋白等,这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能,如吸附毒性化合物,抗生物反应器剪切力,提供细胞贴壁所需的基质,作为脂类和其他生长因子的载体等。㈡它的优点:更高的成分限定性各批产品之间更高的产品质量一致性简化提纯和下游生产过程便于控制培养的生理环境特殊细胞类型的优化配方㈢它的种类说明⑴UltraCULTURETM培养剂(通用无血清培养基)UltraCULTURE培养剂是一种通用的无血清培养剂。它的组成包括:F-12DMEM培养基,重组人胰岛素,牛转铁蛋白,以及牛血清蛋白的纯化混合物(包括清蛋白)。UltraCULTURE培养基的总蛋白浓度大约为3mg/ml。可在UltraCULTURE培养基中添加防冻剂(Cat.No.12-132),用于无血清环境下细胞的冻存。UltraCULTURE培养基不含L-谷氨酸,使用前请先加入5ml200mM的L-谷氨酸溶液(Cat.No.17-605或17-905)应用:培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞,疫苗生产中病毒颗粒的制备
培养基是一种有液体、半固体、固体形式,用于保证微生物繁殖、鉴定或保持其活力的试验用品。生产力学性能稳定的固体培养基及半固体培养基,已经成为国内众多商品化即用型培养基生产厂商关注的重要因素。培养基的流动性、均匀性、结块情况等物理性质判断培养基质量优劣和变化的最直观要素。微生物培养基力学性能测试仪,可迅速便捷的量化其力学性质,提供更为客观的数据参数指导微生物培养基的产品开发与质量评价。本款微生物培养基力学性能测试仪TA. Medium具有以下优势:○高清精密触摸设计,无需外联电脑,无场地约束,即搬即用。○内置运算软件,结果即时显示,可USB接口传输或连接打印机。○底部步进电机设计,位移精确稳定,无共振,无噪音。○高力量分辨率,专为微量力测试设计。*1.测试结果显示精度:0.01g2.位移精度:0.01mm*3.测试臂移动距离:350mm*4.检测速度:0.1~20 mm/s。5.速度解析度:0. 1mm/s,精度优于1%6. 数据采集率:不低于200组/秒,每组4个通道同时读取。